抗菌涂料抗菌性能的測(cè)定方法

趙慧 呂曉飛 許琳 董亞楠 梁青 丁楠

（河北省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，河北石家莊 050000）

隨著人們生活水平的不斷提高，人們對(duì)裝飾用涂料的要求也越來(lái)越高?？咕苛鲜侵竿ㄟ^(guò)添加具有抗菌功能并能在涂膜中穩(wěn)定存在的抗菌劑，經(jīng)一定工藝加工后制成的具有殺菌和抑菌功能的涂料。當(dāng)抗菌涂料用于公共場(chǎng)所時(shí)，能夠降低公共場(chǎng)所的細(xì)菌數(shù)量，降低交叉感染和接觸感染的幾率；用于居家環(huán)境時(shí)，能有效地降低家具等物品上的細(xì)菌密度，優(yōu)化人們的居住環(huán)境。不同的抗菌劑對(duì)于抗菌涂料的抗菌性能有所不同[1,2]。

目前，我國(guó)關(guān)于抗菌涂料抗菌性能的標(biāo)準(zhǔn)有推薦性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21866-2008《抗菌涂料（漆膜）抗菌性測(cè)定法和抗菌效果》[3]。在此標(biāo)準(zhǔn)中，測(cè)定抗菌涂料抗菌性能的方法為定量接種細(xì)菌于待檢驗(yàn)樣板上，用貼膜的方法使細(xì)菌均勻接觸樣板，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的培養(yǎng)后，檢測(cè)樣板中的活菌數(shù)。所用菌株為致病性的大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌。但是在我們的生活環(huán)境中除了致病菌還有許多其他的微生物。這些微生物如果在表面大量聚集和繁殖，既會(huì)給人們的健康和居住環(huán)境帶來(lái)很大的危害，也會(huì)造成墻面、家具等表面被侵蝕[4]。白色葡萄球菌是人類皮膚和粘膜上的一種正常細(xì)菌，在環(huán)境中廣泛存在，并且被用作環(huán)境檢測(cè)常用菌種[5]，它被認(rèn)為是一種常見(jiàn)的環(huán)境菌。當(dāng)人體抵抗力降低或涉及到不正常的寄生部位時(shí)，也會(huì)引起許多感染，危及人體。

本研究采用上述方法對(duì)抗菌涂料進(jìn)行抗大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌的抗菌性能測(cè)定，印證此方法在本實(shí)驗(yàn)室可行并且所用抗菌涂料具有很好的抗菌性能。選用在環(huán)境中常見(jiàn)的非致病菌白色葡萄球菌對(duì)抗菌涂料的抗菌性能進(jìn)行研究，確定其菌液濃度、作用時(shí)間等關(guān)鍵因素。這是白色葡萄球菌在抗菌涂料抗菌性能研究中的首次運(yùn)用，填補(bǔ)了抗菌涂料抗非致病性細(xì)菌研究的空白。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)原料和儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)原料

抗菌涂料：立邦凈味120 竹炭抗菌無(wú)添加內(nèi)墻乳膠漆；

空白對(duì)照涂料：立邦新時(shí)時(shí)麗亞光內(nèi)墻乳膠漆；

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）：ATCC 25922；

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）：ATCC 6538；

白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）：ATCC 8799；

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司，稱取干粉培養(yǎng)基，按比例溶于蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，分裝，經(jīng)過(guò)121℃ 15 min 高溫高壓滅菌；

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司，稱取干粉培養(yǎng)基，按比例溶于蒸餾水中，溶解，分裝，經(jīng)過(guò)121℃ 15 min 高溫高壓滅菌；

洗脫液：0.85% NaCl 生理鹽水加入0.2%吐溫80，用0.1mol/LNaCl溶液或0.1mol/LHCl溶液調(diào)節(jié)pH值為7.0～7.2，分裝，經(jīng)過(guò)121℃ 15 min 高溫高壓滅菌；

培養(yǎng)液：用于大腸桿菌的培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基與洗脫液的比例為1/500；用于金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基與洗脫液的比例為1/100；用于白色葡萄球菌的培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基與洗脫液的比例為1/100；

消毒液：70%乙醇溶液；

覆蓋膜：聚乙烯薄膜，尺寸為（4 0±2）m m×（40±2）mm、厚度為（0.05～0.10）mm，用消毒液浸泡10 min，再用洗脫液沖洗，自然干燥；

樣板：PVC 板，尺寸為（50±2）mm×（50±2）mm、厚度為（0.20～0.30）mm，用消毒液浸泡10 min，再用洗脫液沖洗，自然干燥。

1.1.2 儀器設(shè)備

隔水式恒溫培養(yǎng)箱：GHP-9270 型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

超凈工作臺(tái)：SW-CJ-2Fb 型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：BXM-75VD 型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

電子天平：Scout SE-SE2001F 型，奧豪斯儀器（常州）有限公司；

無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑90 mm；

無(wú)菌刻度吸管或微量移液器及無(wú)菌吸頭；

無(wú)菌鑷子；

接種環(huán)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣板的制備

A（陰性對(duì)照樣板）：未涂刷任何涂料面積為50 mm×50 mm 的樣板。

B（空白對(duì)照樣板）：涂刷未添加抗菌成分的空白對(duì)照涂料面積為50 mm×50 mm 的樣板。

C（抗菌涂料樣板）：涂刷添加抗菌成分涂料的面積為50 mm×50 mm 的樣板。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

制備大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌濃度為（5.0～10.0）×105CFU/mL 的菌懸液[6]，分別滴加0.5 mL 菌懸液至A、B、C 樣板上，用無(wú)菌鑷子將覆蓋膜均勻且無(wú)氣泡地蓋在樣板上，使菌均勻接觸樣品。置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中（37±1）℃條件下24 h。每個(gè)樣品做3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。靜置結(jié)束后分別加入20 mL 洗脫液反復(fù)沖洗樣板和覆蓋膜，混勻后稀釋并接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（37±1）℃條件下培養(yǎng)（24～48）h 進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)[6]。

制備白色葡萄球菌的菌懸液，濃度分別為（5.0～10.0）×103CFU/mL、（5.0～10.0）×105CFU/mL、（5.0～10.0）×107CFU/mL，分別滴加0.5 mL 菌懸液至A、B、C 樣板上，用上述方法進(jìn)行抗菌性能實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，每個(gè)濃度做3個(gè)平行。

制備白色葡萄球菌最適濃度的菌懸液，分別滴加0.5 mL菌懸液至A、B、C 樣板上，用無(wú)菌鑷子將覆蓋膜均勻且無(wú)氣泡地蓋在樣板上，使菌均勻接觸樣品。于無(wú)菌培養(yǎng)皿中（37±1）℃條件下分別靜置12 h、24 h、48 h。每個(gè)樣品做3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。靜置結(jié)束后用洗脫液沖洗，稀釋后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

抗菌率計(jì)算公式為：

式中：R-抗菌率，單位為%；B-空白對(duì)照樣板平均回收菌數(shù)，單位為CFU/片；C-抗菌涂料樣板平均回收菌數(shù)，單位為CFU/片。

2 結(jié)果

2.1 抗大腸埃希氏菌

選取大腸埃希氏菌菌液濃度為8.0×105CFU/mL 的菌懸液0.5 mL 至樣板上，即4.0×105CFU/片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1 所示。

表1 抗大腸埃希氏菌的3 次實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表1 可以得出，樣品A 的實(shí)際回收活菌數(shù)值均不小于1.0×105CFU/片，且樣品B 的實(shí)際回收活菌數(shù)值均不小于1.0×104CFU/片。而且同一空白對(duì)照樣品B 的3 個(gè)平行活菌數(shù)值符合（最高對(duì)數(shù)值-最低對(duì)數(shù)值）/平均活菌數(shù)值對(duì)數(shù)值為0，小于0.3。符合GB/T 21866-2008 標(biāo)準(zhǔn)中的要求，實(shí)驗(yàn)有效。由上述數(shù)據(jù)可以得出此抗菌涂料抗大腸埃希氏菌的抗菌率為99.98%。

2.2 抗金黃色葡萄球菌

選取金黃色葡萄球菌菌液濃度為7.0×105CFU/mL 的菌懸液0.5 mL 至樣板上，即3.5×105CFU/片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2 所示。

表2 抗金黃色葡萄球菌的3 次實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2 可以得出，樣品A 的實(shí)際回收活菌數(shù)值均不小于1.0×105CFU/片，且樣品B 的實(shí)際回收活菌數(shù)值均不小于1.0×104CFU/片。而且同一空白對(duì)照樣品B 的3 個(gè)平行活菌數(shù)值符合（最高對(duì)數(shù)值-最低對(duì)數(shù)值）/平均活菌數(shù)值對(duì)數(shù)值為0，小于0.3。符合GB/T 21866-2008 標(biāo)準(zhǔn)中的要求，實(shí)驗(yàn)有效。由上述數(shù)據(jù)可以得出此抗菌涂料抗金黃色葡萄球菌的抗菌率為99.96%。

由以上實(shí)驗(yàn)可以證明實(shí)驗(yàn)所用方法在本實(shí)驗(yàn)室可行，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有效；本實(shí)驗(yàn)選用的抗菌涂料抗大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌的性能大于99.9%，抗菌性能優(yōu)良。

2.3 抗白色葡萄球菌

此抗菌涂料抗白色葡萄球菌性能的方法研究從菌液濃度和作用時(shí)間兩個(gè)關(guān)鍵因素來(lái)考慮。

2.3.1 不同菌液濃度

分別選取白色葡萄球菌菌液濃度為6.0×103CFU/mL、7.2×105CFU/mL、6.8×107CFU/mL 三個(gè)濃度的菌懸液0.5 mL滴加至樣板上，即3.0×103CFU/片、3.6×105CFU/片、3.4×107CFU/片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3 所示。

由表3 可以看出，當(dāng)菌液濃度為6.0×103CFU/mL 即3.0×103CFU/片時(shí)，涂刷抗菌涂料的C 樣板回收菌很少，幾乎沒(méi)有，不成規(guī)律，無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)算抗菌率。

表3 不同菌液濃度抗白色葡萄球菌的3 次實(shí)驗(yàn)結(jié)果

當(dāng)菌液濃度為6.8×107CFU/mL 即3.4×107CFU/片時(shí)，同一空白對(duì)照樣品B 的3 個(gè)平行活菌數(shù)值符合（最高對(duì)數(shù)值-最低對(duì)數(shù)值）/平均活菌數(shù)值對(duì)數(shù)值為0.43，大于0.3。這說(shuō)明空白對(duì)照樣品的3 次平行實(shí)驗(yàn)誤差大，涂在抗菌涂料上面誤差也會(huì)很大，此數(shù)據(jù)被認(rèn)為是不可信的。

當(dāng)菌液濃度為7.2×105CFU/mL 即3.6×105CFU/片時(shí)，涂刷抗菌涂料的C 樣板菌數(shù)在平板上分布均勻，比較平行。且同一空白對(duì)照樣品B 的3 個(gè)平行活菌數(shù)值符合（最高對(duì)數(shù)值-最低對(duì)數(shù)值）/平均活菌數(shù)值對(duì)數(shù)值為0，小于0.3。經(jīng)過(guò)計(jì)算得出抗菌率為99.97%。

因此，白色葡萄球菌的最適菌液濃度為7.2×105CFU/mL即3.6×105CFU/片。

2.3.2 不同作用時(shí)間實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分別選取12 h、24 h、48 h 三個(gè)不同的作用時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。為了防止取出樣板時(shí)溫度變化影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，選用三次完全獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三個(gè)不同作用時(shí)間的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4 所示。

表4 不同作用時(shí)間抗白色葡萄球菌的3 次實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表4 可以看出，當(dāng)菌液在樣板上培養(yǎng)12 h 后將菌液洗脫下來(lái)并計(jì)數(shù)，明顯的可以看出涂刷抗菌涂料的C 樣板回收菌數(shù)比較多，抗菌率為98.2%。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，菌液在樣板上培養(yǎng)24 h 后洗下計(jì)數(shù)，抗菌率有了明顯的提高，達(dá)到99.7%。但是隨著時(shí)間進(jìn)一步的延長(zhǎng)，菌液在樣板上培養(yǎng)48 h后洗下計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照和空白對(duì)照回收的菌數(shù)都比較少，推測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，菌種自然衰亡現(xiàn)象發(fā)生，并且同一空白對(duì)照樣品B 的3 個(gè)平行活菌數(shù)值符合（最高對(duì)數(shù)值-最低對(duì)數(shù)值）/平均活菌數(shù)值對(duì)數(shù)值為0.67，大于0.3。推測(cè)自然衰亡造成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不平行。因此，白色葡萄球菌的最佳作用時(shí)間為24 h。

3 結(jié)束語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)在確定實(shí)驗(yàn)所用涂料的抗菌性能優(yōu)良，實(shí)驗(yàn)室方法可行的前提下，首次提出選用在環(huán)境中常見(jiàn)的非致病菌白色葡萄球菌對(duì)抗菌涂料的抗菌性能進(jìn)行研究，確定其菌液濃度為7.2×105CFU/mL，作用時(shí)間為24 h。填補(bǔ)了抗菌涂料抗非致病性細(xì)菌研究的空白。