抗人IgG和抗人IgM單克隆抗體的特性鑒定及應用

封青，郭春艷，王珍 ，李研，梁導艷，胡軍

1.陜西省人民醫(yī)院；2.西安交通大學 醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院；陜西 西安 710068

免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）包括 IgG、IgA、IgM、IgD、IgE等5類，主要存在于血漿中。IgM是機體被病毒入侵后最先分泌的抗體，是機體抗感染的先頭部隊，目前診斷病毒感染是活動性感染還是近期感染的指標就是IgM抗體檢測。IgG是血清中免疫球蛋白的主要成分，是機體感染病毒再次免疫應答產(chǎn)生的主要抗體，親和力高，體內(nèi)分布廣泛，持續(xù)時間長，具有重要的免疫效應，是機體抗感染的主力軍。IgG抗體檢測不僅可用于對病毒的特異性診斷，還可作為判斷傳染病疫區(qū)以及疫苗研制期檢測的有效指標[1-2]。疫苗研制對疾病防控起至關重要的作用，疫苗臨床早期研究方法是將病毒注射到人體內(nèi)，通過檢測血清中的相關抗體來評價疫苗效價[3]，而疫苗效價評價的主要依據(jù)是人體血漿中的IgG抗體。

臨床上主要通過血清學檢測判斷機體是否感染病毒，如采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測患者血清中的IgG和IgM抗體，檢測試劑盒中的酶標二抗即為抗人IgG和抗人IgM。其原理是將病毒抗原包被在96孔酶標板上，加入患者血清，再分別加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗人IgG和IgM抗體，若患者感染過該病毒，就可檢出針對該病毒的特異性抗體。市售人血漿弓形蟲[1]、血清囊蟲[4]、結核分枝桿菌[5-6]、肺炎支原體[7]、人免疫缺陷病毒[8]、結核[9]、人抗乙腦病毒[10]、狂犬病毒[11]、EV71 腸道病毒[12]和抗雙鏈 DNA[13]等 IgG 和IgM抗體檢測試劑盒都是應用上述原理的。

ELISA是臨床輔助診斷和流行病學調(diào)查中應用最廣的方法[4]，準確率高、成本低、重復性好、報告速度快且適合批量檢測，有助于病毒感染早發(fā)現(xiàn)早治療。單克隆抗體具有高度特異性，是現(xiàn)有免疫學和血清學研究的重要工具，無論在醫(yī)學研究領域還是傳染性疾病診斷與治療方面均已被廣泛應用。為此，我們以人IgG和IgM為抗原，通過傳統(tǒng)方法制備并鑒定抗人IgG和IgM單抗，為開發(fā)病原微生物抗體檢測試劑盒提供實驗材料。

1 材料與方法

1.1 材料

8周齡雌性BALB/c小鼠購自西安交通大學實驗動物中心；小鼠骨髓瘤細胞SP2/0由本實驗室提供；人IgG和人IgM購自Abcam公司；山羊抗小鼠酶標二抗購自中杉金橋公司；抗體亞型鑒定試劑盒購自SBA Clonotyping System/HRP購自Southern Biotech公司；HAT購自Gibco公司；單克隆抗體培養(yǎng)血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；HRP購自國安生物有限公司；檢測腺病毒抗體、麻疹病毒抗體和流感病毒抗體試劑盒購自杭州金萊公司。

1.2 單克隆抗體的制備

以人IgG和人IgM為抗原分別免疫小鼠，抗原量為50 μg/只，用佐劑乳化，方法參考文獻[14]。采用有限稀釋法進行雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)，經(jīng)過3次克隆化篩選出能產(chǎn)生所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞，從而得到2株抗人IgG和2株抗人IgM單克隆抗體，分別命名為IgG-2、IgG-25、IgM-7和IgM-23。采用體內(nèi)誘生法，分別大量培養(yǎng)雜交瘤細胞，并選擇健康小鼠，先于小鼠腹腔注射0.3 mL石蠟油，1周后于小鼠腹腔注射陽性克隆的雜交瘤細胞108/只，待小鼠腹腔明顯膨出，無菌取腹水并離心收集上清，分裝保存。

1.3 單克隆抗體生物學特性分析

1.3.1 單克隆抗體亞型鑒定 用SBA Clonotyping System/HRP試劑盒測定，具體方法是以羊抗小鼠Ig類型的標準抗血清，采用酶聯(lián)免疫雙抗夾心法測定單抗與抗小鼠Ig類型和亞類的反應性，確定單抗的亞型。

1.3.2 單克隆抗體的純化 單克隆抗體純化采用飽和硫酸銨鹽析沉淀法[15]，分別用50%、40%和33%的飽和硫酸銨依次提取3次，離心所得沉淀物用少許0.01 mol/L PBS（pH7.4）溶解，經(jīng)透析，收集并凍干保存，用紫外吸收法測定4株抗體的蛋白含量，用間接ELISA法測定抗體效價。

1.3.3 單克隆抗體腹水純化后效價測定 采用間接ELISA法，用pH9.6的碳酸鹽緩沖液（2 μg/mL）分別包被抗原人IgG和人IgM，置4℃冰箱中過夜；洗板，用牛血清白蛋白封閉，37℃孵育1 h；棄液體，洗板3次，從1/10開始梯度稀釋純化的單克隆抗體，加板，37℃孵育1 h；棄液體，洗板3次，加入稀釋至1/2500的羊抗鼠酶標二抗，37℃孵育1 h；棄液體，洗板5次，以TMB底物顯色，2 mol/L硫酸終止顯色，用酶標儀測定D450nm值。

1.3.4 單克隆抗體交叉鑒定 采用間接ELISA法，用pH9.6的碳酸鹽緩沖液（2 μg/mL）分別包被抗原人IgG、人IgM、牛血清、雞血清、兔血清和羊血清，置4℃冰箱中過夜，洗板，用牛血清白蛋白封閉，37℃孵育1 h；棄液體，洗板3次，加入單克隆抗體上清原液，同時以SP20細胞培養(yǎng)上清為陰性對照，37℃孵育1 h；棄液體，洗板3次，加入稀釋至1/2500的羊抗鼠酶標二抗，37℃孵育1 h；棄液體，洗板5次，以TMB底物顯色，2 mol/L硫酸終止顯色，用酶標儀測定D450nm值。

1.3.5 HRP標記4株單克隆抗體 用HRP標記抗體須借助交聯(lián)劑的作用，將酶連接在抗體分子上。本實驗室單克隆抗體標記采用改良碘酸鈉標記法[16]，HRP分子中與酶活性無關的糖基被過碘酸鈉氧化為醛基，再與抗體蛋白的氨基形成Schiff堿，從而達到標記的目的。標記完成后采用間接ELISA法測定酶標抗體的最佳稀釋率。

1.3.6 Western印跡鑒定單克隆抗體特異性 人IgG和人IgM蛋白分別加入等體積的上樣緩沖液，100℃煮10 min變性，用氨基黑染色法定量蛋白濃度，配制濃度15%的分離膠，上樣，進行SDSPAGE。電泳結束后進行印跡電泳，將PAGE膠中的蛋白質(zhì)轉移至NC膜上，3 h后取膜封閉1 h，洗膜3次，采用一步法直接加入HRP標記的單克隆抗體，4℃孵育過夜，洗膜5次，采用化學發(fā)光法顯色，用化學發(fā)光成像系統(tǒng)成像。

1.3.7 夾心ELISA法鑒定單抗識別的表位 1個抗原分子表面常有多個抗原決定簇，用該抗原制備的單克隆抗體有的抗同一個決定簇，有的則抗不同決定簇。采用雙抗夾心ELISA法包被抗人IgG-2與HRP標記的抗人IgG-25雙抗夾心抗原，5 μg/mL人 IgG、0.5 μg/mL人IgG、5 mg/mL人血清和0.5 μg/mL人血清，以5 mg/mL羊血清為陰性對照；同樣包被抗人IgM-7與HRP標記的抗人IgM-23雙抗夾心抗原，5 μg/mL人IgM、0.5 μg/mL人IgM、5 mg/mL人血清和0.5 μg/mL人血清，以5 mg/mL羊血清為陰性對照。以TMB底物顯色，2 mol/L硫酸終止顯色，用酶標儀測定D450nm值。

1.3.8 單克隆抗體的應用 按照市售檢測人腺病毒抗體試劑盒、麻疹病毒抗體IgM試劑盒和流感抗體試劑盒的說明，分別將試劑盒自帶的陰、陽性血清加入相應試劑盒中的酶標板中，37℃孵育1 h，洗板后將HRP標記的抗人IgG-2、IgG-25、IgM-7、IgM-23、試劑盒中酶標二抗抗人IgG和IgM用合適的稀釋濃度直接加至相應酶標板，37℃孵育40 min，洗板，以TMB底物顯色，2 mol/L硫酸終止顯色，用酶標儀測定D450nm值。

2 結果

2.1 陽性單克隆抗體的建立

應用成熟的單抗制備技術，最終獲得2株抗人IgG和2株抗人IgM單克隆抗體，分別命名為IgG-2、IgG-25、IgM-7和IgM-23，經(jīng)單抗亞類鑒定試劑盒測得4株單抗均為Kappa鏈，亞類均為IgG1。連續(xù)傳代3個月后檢測抗體效價和特異性，均與以往結果無差異，單抗特性穩(wěn)定，均能穩(wěn)定分泌抗人IgG和抗人IgM。

2.2 單抗腹水純化后蛋白含量和效價測定

單克隆抗體經(jīng)飽和硫酸銨鹽析沉淀法純化后蛋白含量都可達4 mg/mL以上，抗體效價均達到104以上（表1）。

表1 單克隆抗體純化后蛋白含量和效價

2.3 單克隆抗體交叉鑒定

采用ELISA法，分別以人IgM、牛血清、雞血清、兔血清和羊血清為包被抗原，檢測4株單抗的特異性，結果見表2。2株抗人IgG-2和IgG-25單克隆抗體有很好的特異性，只與IgG反應，而不與人IgM、牛血清、雞血清、兔血清和羊血清發(fā)生交叉反應；2株抗人IgM-7和IgM-23單克隆抗體有很好的特異性，只與IgM反應，而不與IgG、牛血清、雞血清、兔血清和羊血清發(fā)生交叉反應。

表2 單克隆抗體的反應特性

2.4 HRP標記4株單克隆抗體

采用間接ELISA法確定標記抗體的最佳稀釋率，抗人IgG-2最佳稀釋率為1/104，抗人IgG-25最佳稀釋率為1/103（圖1A）；抗人IgM-7最佳稀釋率為1/105，抗人IgM-23最佳稀釋率為1/104（圖1B）。

圖1 間接ELISA鑒定HRP標記抗體的最佳稀釋率

2.5 Western印跡鑒定單克隆抗體

HRP標記的抗人IgG-2和IgG-25識別的相對分子質(zhì)量為50×103和25×103（圖2A），HRP標記的抗人IgM-7和IgM-23識別的相對分子質(zhì)量為80×103（圖2B），符合預期大小。

圖2 Western印跡鑒定單克隆抗體

2.6 夾心ELISA法鑒定單抗識別的表位

包被抗人IgG-2與HRP標記的抗人IgG-25可夾心出抗原人IgG，敏感值可達0.5 μg/mL，可檢測出人血清中的IgG（圖3A），說明2株抗人IgG-2和IgG-25識別的抗原位點不同；用同樣方法無法夾心出人IgM（圖3B），則說明2株抗人IgM抗體識別的抗原位點相同。

圖3 夾心ELISA法鑒定單抗識別的表位

2.7 單克隆抗體的應用

按照試劑盒操作方法，在檢測腺病毒抗體、麻疹病毒IgM和流感抗體病毒試劑盒中，抗人IgG-2、IgG-25、IgM-7和IgM-23更優(yōu)于試劑盒自帶的酶標二抗，結果如圖4。

圖4 單克隆抗體在3種試劑盒中的應用

3 討論

我們通過常規(guī)單抗技術和免疫學方法，最終獲得2株抗人IgG和2株抗人IgM單抗，為研制有效試劑盒、檢測臨床疾病及評估疫苗免疫水平提供了實驗材料。此外，將這4株單抗運用到臨床疾病特異性抗體檢測中，可以更系統(tǒng)、更全面地掌握機體被病原體感染后產(chǎn)生的免疫應答反應所處狀態(tài)，以便采取相應的防制措施，具有明顯的應用價值。王平等[17]用抗牛血清IgG單克隆抗體建立了雙抗體夾心法檢測生物制品中殘留的牛血清IgG。本研究用雙抗夾心法對已建立的2株IgG和2株IgM識別的抗原表位進行鑒定，結果表明抗人IgG-2和IgG-25識別的的抗原位點是不同的，而且可以檢測到人IgG，敏感值達0.5 μg/mL，這2株抗體可為后續(xù)建立雙抗體夾心ELISA法檢測人血清中的IgG提供實驗材料。

檢測患者血清中針對某種病毒的IgG/IgM抗體，首先要選擇特異性強、敏感度高的抗人IgG/抗人IgM。我們篩選的2株抗人IgG和2株抗人IgM單抗的效價都可達104以上，分泌Ig亞類分屬IgG1，均為可穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株，比市售試劑盒中的抗人IgG和抗人IgM的敏感度更高、更優(yōu)。

臨床檢測病毒感染方法多樣，主要有病毒培養(yǎng)、PCR檢測和ELISA檢測等。病毒培養(yǎng)是診斷金標準，但其陽性率低，培養(yǎng)時間久，操作不慎還可引起感染；PCR檢測對設備要求高，操作復雜，成本較高，實驗周期長[18]，有些醫(yī)院不具備檢測條件。血清中的IgM在病毒感染1周后就可產(chǎn)生，2～3周達高峰期，所以目前IgM抗體ELISA檢測已作為病毒急性期感染診斷指標，提高了臨床診斷效率。市售試劑盒中的抗人IgG/抗人IgM大多為羊源性多抗，與其相比，我們的鼠源性單抗成本低、特異性強、敏感度高、操作簡便、產(chǎn)量更高。