組織切片多光譜定量分析技術(shù)在腫瘤免疫學(xué)研究中的應(yīng)用

熊芮，范昌發(fā)，王佑春

中國食品藥品檢定研究院 實(shí)驗動物資源研究所，北京 100050

隨著現(xiàn)代組織學(xué)分析技術(shù)的發(fā)展，僅僅測量勻漿組織中分子的平均表達(dá)量已不能滿足研究人員的需求，在保持細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)特征的同時，得到檢測目標(biāo)詳盡的空間分布信息以及精確可靠的定量結(jié)果在研究中變得越來越重要。使用傳統(tǒng)方法，在福爾馬林固定石蠟包埋組織切片上對多個目標(biāo)信號共定位，在實(shí)驗操作上十分具有挑戰(zhàn)性。組織切片多光譜定量分析技術(shù)的高分辨率與高靈敏度，克服了傳統(tǒng)分子成像技術(shù)的不足，為免疫細(xì)胞表型分析、定位和定量提供了新思路，被廣泛用于腫瘤免疫學(xué)研究。

1 組織切片多光譜定量分析技術(shù)的原理

組織切片多光譜定量分析技術(shù)是近幾年建立起來的一種新技術(shù)[1]，與流式細(xì)胞術(shù)類似，它能夠定量評估細(xì)胞表型及活性，還可以同時提供組織背景和相關(guān)細(xì)胞與細(xì)胞相互作用的信息，而這些信息難以或不可能通過其他方法獲得[2]，故該技術(shù)在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究中有其獨(dú)到用途。該技術(shù)包括三個部分：①多重免疫熒光標(biāo)記，可通過獨(dú)有的抗原直標(biāo)和抗體去除技術(shù)，并借助酪酰胺信號放大（tyramide signal amplification，TSA）的作用[3]實(shí)現(xiàn)在同一切片上進(jìn)行多重免疫熒光染色（標(biāo)記原理如圖1），在同一張完整的組織切片中同時清晰成像和進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的免疫熒光標(biāo)記可多達(dá)7個。②多光譜成像（multispectral imaging，MSI）與光譜拆分算法（圖2），組織自發(fā)熒光和相互重疊的顏色信號會嚴(yán)重干擾實(shí)驗結(jié)果，光譜拆分技術(shù)能夠拆分發(fā)射峰相近的熒光標(biāo)記信號[4]，多光譜成像技術(shù)可將顏色信號以連續(xù)光譜的方式記錄，得到經(jīng)修正的單通道圖像，最后為光譜拆分后的單通道圖像添加偽彩，重新生成多通道圖像。與普通的RGB成像相比，多光譜成像能夠識別細(xì)微的顏色差異，在解決信號間串色干擾問題的同時去除自發(fā)熒光背景。③定量組織切片圖像分析軟件，通過軟件的內(nèi)置組織類型識別算法，使系統(tǒng)自動定位目標(biāo)組織區(qū)域，獲得精確至單細(xì)胞乃至細(xì)胞器水平的多參數(shù)定量結(jié)果，對組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行完整而全面的評價。

2 組織切片多光譜定量分析技術(shù)的優(yōu)勢

多標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）廣泛用于定量檢測血液中游離免疫細(xì)胞的特定亞群數(shù)量，但不能揭示實(shí)體瘤內(nèi)部和周圍的免疫細(xì)胞的空間關(guān)系和功能狀態(tài)，而這其中可能包含了預(yù)測患者對特定免疫療法的反應(yīng)所需的重要信息。免疫組織化學(xué)法（immunohistochemistry，IHC）無法捕獲分析免疫細(xì)胞亞群所需的復(fù)雜多標(biāo)記物表型，同時對3個以上標(biāo)記物進(jìn)行可視化或定量研究。石蠟切片的自發(fā)熒光現(xiàn)象會降低免疫熒光（immunofluorescence，IF）的靈敏度和定量可靠性[5]，由于顯色信號重疊，又會導(dǎo)致成像困難。

圖1 多重免疫熒光標(biāo)記原理

圖2 多光譜拆分示意圖

多光譜成像克服了上述檢測手段的不足，大幅降低了福爾馬林固定石蠟包埋組織自體熒光的影響[5]。該技術(shù)將多標(biāo)志物染色、多光譜成像和軟件定量算法分析匯聚結(jié)合[6]，支持石蠟切片中確定復(fù)雜的細(xì)胞表型、原位檢測免疫細(xì)胞和評估檢查點(diǎn)表達(dá)，同時對單個細(xì)胞上多種標(biāo)記物進(jìn)行定量計算，自動識別組織形態(tài)，分割不同的組織區(qū)域（如腫瘤和基質(zhì)），獲得以前方法無法企及的信息。

3 組織切片多光譜定量分析技術(shù)在腫瘤診斷及評價預(yù)后中的應(yīng)用

與傳統(tǒng)解剖病理學(xué)不同，多數(shù)研究人員希望在組織切片水平上獲得關(guān)于細(xì)胞蛋白表達(dá)的信息，以實(shí)現(xiàn)精確的定量分析[7]，包括目的細(xì)胞百分比計數(shù)、組織面積測量、標(biāo)記物顯色強(qiáng)度或熒光強(qiáng)度的測量。如利用經(jīng)典IHC方法對淋巴瘤進(jìn)行免疫分型時，有經(jīng)驗的血液病理學(xué)家可憑染色強(qiáng)度評分，雖具有臨床價值，但數(shù)據(jù)主觀性強(qiáng)，重復(fù)性有限[8]。由于沒有直觀的細(xì)胞定量數(shù)據(jù)，難以建立更加精確的診斷標(biāo)準(zhǔn)。Ng等[9]將多光譜定量分析技術(shù)用于血管免疫母細(xì)胞性T細(xì)胞淋巴瘤（angioimmunoblastic T-cell lymphoma，ATIL）的研究，用多重免疫熒光法標(biāo)記TFH標(biāo)志物（BCL6和PD1），經(jīng)定量組織切片圖像分析軟件分析直接精確得出ATIL患者組織切片的CD4+細(xì)胞中BCL6陽性細(xì)胞和PD1陽性細(xì)胞的百分比，及2種標(biāo)志物同時表達(dá)的細(xì)胞百分比，經(jīng)多光譜定量分析軟件處理，將細(xì)胞表型分析結(jié)果圖形化，可精確診斷和判斷ATIL的預(yù)后。Chris[10]等將MSI與自動組織細(xì)胞識別軟件結(jié)合，準(zhǔn)確定量Rab-B肝中Ki-67+增殖的肝細(xì)胞。圖像分析軟件自動學(xué)習(xí)組織細(xì)胞的形態(tài)，對其形態(tài)學(xué)進(jìn)行評估，將組織圖像劃分為不同區(qū)域的能力可以極大地幫助病理學(xué)家判斷與鑒別復(fù)制的組織形態(tài)，減少人為錯誤[11]。

4 組織切片多光譜定量分析技術(shù)在腫瘤發(fā)生機(jī)制研究中的應(yīng)用

腫瘤微環(huán)境在腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。Mlecnik等[12]利用多光譜成像技術(shù)及其圖像處理軟件，并結(jié)合組織芯片，分析原發(fā)性結(jié)直腸癌（carcinomaofcolon and rectum，CRC）患者腫瘤組織中血管、淋巴管及腫瘤內(nèi)浸潤的淋巴細(xì)胞密度。他們用多熒光標(biāo)記法在組織芯片上對CRC患者組織的血管和淋巴管標(biāo)志物及多個免疫靶點(diǎn)（CD3/CD4/T-Bet/CD45RO/CD8/GZMB/CD57等）進(jìn)行標(biāo)記，依靠多光譜定量分析軟件自動將血管、淋巴管與其他組織區(qū)分，并由軟件直接計算血管面積/組織面積、淋巴管面積/組織面積的比率，不僅降低了組織芯片使用的成本，還提高了研究人員的分析效率，減少人為主觀判讀偏差。

Zaretsky等[13]利用多光譜定量分析技術(shù)研究接受抗PD-1（programmed death-1）療法的黑色素瘤患者復(fù)發(fā)的腫瘤細(xì)胞免疫逃逸機(jī)制，通過定量分析，可更加清楚及方便地分析出患者黑色素瘤樣本中 PD-L1（programmed death-ligand 1）的表達(dá)水平和細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T cell，CTL）浸潤的水平和空間位置關(guān)系，在探索獲得性抵抗PD-1阻斷療法的機(jī)制中起到重要作用。

Nghiem等[14]用多重免疫熒光技術(shù)處理一位Ⅳ期Merkel細(xì)胞癌患者治療前后的活檢標(biāo)本，以評價潘利珠單抗（Pembrolizumab）的治療效果。此方法避免多次切片，克服了多個免疫標(biāo)志物不能在同一張切片上同時顯色的問題，得到背景干凈、信號清晰的數(shù)據(jù)圖片。治療前結(jié)果顯示在腫瘤-基質(zhì)界面處免疫浸潤最強(qiáng)烈，只有邊緣的腫瘤細(xì)胞為PD-L1陽性，僅靠近CD8+T細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞才表達(dá)PD-L1。流式細(xì)胞術(shù)無法獲得這種復(fù)雜的位置信息。經(jīng)過抗體治療后，活檢標(biāo)本顯示有彌漫性免疫吞噬細(xì)胞浸潤，無殘余的腫瘤細(xì)胞，并計算出陽性細(xì)胞比例。利用該結(jié)果，可遴選更適于免疫抗體治療的病人，提高抗體藥的療效。

在一項包含18種類型癌癥的研究中[15]，Huang等用多重?zé)晒鈽?biāo)記術(shù)標(biāo)記了MET/HGF通路中的蛋白質(zhì)，推導(dǎo)出MET癌蛋白激活的模型。Stefanie等用抗-OX40與抗-CTLA-4和HER2疫苗聯(lián)合治療荷瘤小鼠[16]，他們用MSI技術(shù)發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療后腫瘤部位出現(xiàn)強(qiáng)烈的腫瘤破壞效應(yīng)，伴有效應(yīng)T細(xì)胞浸潤腫瘤組織，證明聯(lián)合免疫療法能夠逆轉(zhuǎn)T細(xì)胞失能，提高小鼠存活率。Woods[17]等在炎癥和非炎癥狀態(tài)下，研究黑色素瘤細(xì)胞對逃逸T淋巴細(xì)胞殺傷作用的機(jī)制，利用多光譜定量分析技術(shù)同時得到明場和熒光圖像，在黑色素瘤活檢標(biāo)本中顯示免疫蛋白酶體（immunoproteasome，IP）亞基和CD3+細(xì)胞的分布情況，發(fā)現(xiàn)二者的表達(dá)有明顯的相關(guān)性，并且在整個組織中免疫蛋白酶體的表達(dá)不均勻。

5 組織切片多光譜定量分析技術(shù)在其他疾病方面的應(yīng)用

在傳染性疾病方面，多光譜成像技術(shù)已被用于原位共定位檢測細(xì)胞因子與病毒。如丙型肝炎和隱匿性丙型肝炎病毒感染是一種與肝細(xì)胞癌和淋巴增生性疾病發(fā)病風(fēng)險增加有關(guān)的病理類型，利用MSI可以證明丙型肝炎病毒是否促進(jìn)淋巴細(xì)胞生長、侵入細(xì)胞免疫細(xì)胞并在細(xì)胞中傳播[18]。MSI也可與FISH結(jié)合，用于研究隱匿性乙型肝炎病毒感染如何誘導(dǎo)外周血淋巴細(xì)胞中可見的DNA損傷[19]，以及用于確定人類腫瘤中的溶瘤呼腸孤病毒的分布情況[20]。除此之外，組織切片多光譜定量分析技術(shù)在神經(jīng)科學(xué)研究[21]、移植研究[22]、心血管疾病研究中[23]也有所涉及。

6 結(jié)語

組織切片多光譜定量分析技術(shù)解決了長期阻礙實(shí)驗的技術(shù)難題：在明場圖像下，分割組織區(qū)域或細(xì)胞區(qū)室，支持多重染色單獨(dú)定量分析；在熒光圖像下，目標(biāo)熒光與組織自發(fā)熒光得到有效區(qū)分，解決石蠟組織切片自發(fā)熒光干擾實(shí)驗的問題。總之，基于多光譜成像與組織切片圖像分析軟件相結(jié)合的組織切片多光譜定量分析技術(shù)是目前較新的組織原位細(xì)胞表型分析技術(shù)，將在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究、腫瘤臨床診斷等方面發(fā)揮積極作用。最近國內(nèi)外也有少數(shù)科學(xué)家將該技術(shù)用于病毒學(xué)、病毒感染機(jī)制研究中。