基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)人乳頭瘤病毒的分型檢測(cè)

孫萌，柴蕊，張亞蘭

北京城市學(xué)院 生物醫(yī)藥學(xué)部，北京 100083

宮頸癌是威脅婦女健康的主要疾病之一，被認(rèn)為是全球性公共衛(wèi)生問題，是發(fā)展中國(guó)家最常見的癌癥，世界上每2 min就會(huì)有1個(gè)婦女死于宮頸癌[1]。而人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）持續(xù)感染是宮頸癌和一些生殖器瘤樣病變的主要原因。HPV有多種基因型，目前已知100多種，其中30余種可從受感染的生殖道組織中分離出來[2-4]。根據(jù)病毒致癌性的大小，可將HPV分為低危型（非癌相關(guān)型，包括HPV6、11、42、43和一些新型HPV）和高危型（癌相關(guān)型，包括 HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68）[5-6]。近10年來我國(guó)宮頸癌的發(fā)病率穩(wěn)步上升且趨于年輕化，故對(duì)宮頸癌及癌前病變的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期干預(yù)顯得非常必要。

發(fā)達(dá)國(guó)家宮頸癌的篩查流程多為HPV檢測(cè)和細(xì)胞學(xué)檢查同時(shí)進(jìn)行，異常者轉(zhuǎn)陰道鏡檢查，可疑病變定點(diǎn)活檢，隨訪以HPV檢測(cè)和細(xì)胞學(xué)檢查為主[7-12]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification method，LAMP）是一種新型體外等溫?cái)U(kuò)增特異性核酸片段的技術(shù)，該技術(shù)主要利用2對(duì)特殊引物和具有鏈置換活性的DNA聚合酶在一定條件下進(jìn)行反應(yīng)，只需把基因模板、引物，鏈置換DNA合成酶等共同置于一定溫度（60～65℃）下，可在15 min至1.5 h內(nèi)出現(xiàn)109～1010倍的擴(kuò)增。LAMP技術(shù)針對(duì)HPV的DNA檢測(cè)，具有較高的特異性，操作簡(jiǎn)單、快速高效。通過LAMP完成HPV分型是一種快速檢測(cè)HPV亞型的方法，對(duì)宮頸癌及癌前病變篩查具有重大意義，可為臨床宮頸病變的診治提供依據(jù)。HPV高危型有多種，除HPV59、HPV66、HPV68這3種亞型，其他高危型已經(jīng)可以通過LAMP檢測(cè)出來。因此，我們選取高危型HPV59、HPV66、HPV68作為實(shí)驗(yàn)樣本開展研究。

1 材料和方法

1.1 材料

臨床HPV樣本購(gòu)自浙江殷欣生物技術(shù)有限公司；微流控芯片、微流控芯片核酸分析儀由博奧生物集團(tuán)有限公司提供；ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自上海智巖科學(xué)技術(shù)有限公司；LAMP DNA擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自上海信裕生物技術(shù)有限公司；引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 特異性靶序列篩選

登陸NCBI官網(wǎng)，檢索HPV59、HPV66、HPV68亞型全基因組序列，并將其所對(duì)應(yīng)的所有毒株序列分類下載。HPV亞型是根據(jù)其基因的L1和L2區(qū)的不同核酸序列進(jìn)行命名。用核酸分析軟件DNAMAN對(duì)HPV59序列進(jìn)行多序列比對(duì)，選取變異少的L1、L2區(qū)序列并對(duì)該序列進(jìn)行Blast比對(duì)，選定高特異性的HPV59靶序列片段。HPV66、HPV68片段選擇同HPV59。如圖1。

1.3 特異性引物設(shè)計(jì)

根據(jù)選定的特異性靶序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物組合（表1），并根據(jù)引物組合設(shè)計(jì)該組的頸環(huán)引物（LF、LB）。

1.4 引物溶解與混合

引物合成后按照說明書填寫引物補(bǔ)水單，計(jì)算初次補(bǔ)水量。引物補(bǔ)水前12 000 r/min離心10 min，在超凈工作臺(tái)里按照補(bǔ)水單一一對(duì)應(yīng)補(bǔ)加適量的滅菌水，充分振蕩混勻，瞬時(shí)離心，于4℃放置2.5 h，使之完全溶解。用分光光度計(jì)測(cè)定每條引物的核酸濃度，清潔光纖表面，加2 μL滅菌水到光纖表面，放下檢測(cè)壁，用濾紙將水吸干，如此可保證BLANK準(zhǔn)確。吸取1.5 μL滅菌水加到下光纖表面，放下檢測(cè)壁，點(diǎn)擊BLANK做空白對(duì)照。加樣測(cè)量，將1.5 μL核酸加到下光纖表面，放下檢測(cè)壁，輸入樣本編號(hào)，點(diǎn)擊Measure測(cè)量。將測(cè)量結(jié)果輸入補(bǔ)水單，計(jì)算二次補(bǔ)水量。引物補(bǔ)二次水，在超凈工作臺(tái)里按照補(bǔ)水單一一對(duì)應(yīng)補(bǔ)加適量的滅菌水，充分振蕩混勻，瞬時(shí)離心，放置-20℃待用。引物溶解后，在EP管上標(biāo)記好要配制的混合引物的名稱，加入35 μL水，然后依次加入24 μL FIP、BIP，10 μL LB、LF，3 μL F3、B3，振蕩混勻，瞬時(shí)離心，-20℃保存。

圖1 選定的特異性靶序列

1.5 引物初篩

表1 引物組合及序列

將 HPV59、HPV66、HPV68質(zhì)粒濃度由 1×109拷貝/μL梯度稀釋到1×105拷貝/μL，吸取5.24 μL稀釋后的質(zhì)粒水溶液與3.67 μL LAMP擴(kuò)增試劑混合，然后加入1.09 μL混合引物，振蕩，瞬時(shí)離心。陰性對(duì)照只須將質(zhì)粒換成滅菌水。將8聯(lián)排管放入ABI7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀，打開軟件編輯程序，啟動(dòng)擴(kuò)增程序。

1.6 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)引物靈敏度的檢測(cè)

分析引物初步篩選結(jié)果，選擇在1×105拷貝/μL條件下擴(kuò)增出峰時(shí)間較早的引物進(jìn)行靈敏度篩選。將HPV59、HPV66、HPV68質(zhì)粒濃度由1×109拷貝/μL梯度稀釋至1×103、1×102拷貝/μL。吸取5.24 μL稀釋后的質(zhì)粒水溶液與 3.67 μL LAMP擴(kuò)增試劑混合，然后加入1.09 μL混合引物，振蕩，瞬時(shí)離心。陰性對(duì)照只須將質(zhì)粒換成滅菌水。將8聯(lián)排管放入ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，打開軟件編輯程序，啟動(dòng)擴(kuò)增程序。

2 結(jié)果

2.1 引物初篩

對(duì)HPV59、HPV66、HPV68通過選取對(duì)應(yīng)核酸片段的LAMP結(jié)果見圖2。使用設(shè)計(jì)的5組HPV59引物，在1×105拷貝/μL初篩質(zhì)粒濃度下，擴(kuò)增曲線出峰時(shí)間應(yīng)在20 min，只有HPV59-2、HPV59-5較好，其他幾條幾乎沒有擴(kuò)增。HPV66引物設(shè)計(jì)了5組，初次篩選只有HPV66-2、HPV66-5擴(kuò)增效果較好，其他出峰時(shí)間較晚，均不符合。HPV68引物設(shè)計(jì)了10組，其中HPV68-4、HPV68-10擴(kuò)增結(jié)果較好。以上初篩選出的6組引物可作為下一步靈敏度檢測(cè)的參考。

2.2 引物靈敏度檢測(cè)

根據(jù)引物初篩結(jié)果，HPV59-5的出峰時(shí)間早于HPV59-2，所以選擇HPV59-5進(jìn)行靈敏度檢測(cè)，結(jié)果見圖 3。1×103拷貝/μL HPV59-5 擴(kuò)增曲線出峰時(shí)間為37 min，1×102拷貝/μL HPV59-5擴(kuò)增曲線出峰時(shí)間為33 min，且只有一條可出峰，陰性對(duì)照曲線沒有擴(kuò)增，由此可以得出HPV59-5的檢測(cè)下限為1×102拷貝/μL。

根據(jù)引物初篩結(jié)果，HPV66-2、HPV66-5的靈敏度檢測(cè)結(jié)果見圖 4。1×103拷貝/μL HPV66-2擴(kuò)增曲線出峰時(shí)間在30 min左右，1×103拷貝/μL HPV66-5擴(kuò)增曲線出峰時(shí)間在40 min左右，且這2種引物在1×102拷貝/μL均沒有擴(kuò)增出，所以引物HPV66-2的靈敏度較好，HPV66-2的檢測(cè)下限為1×103拷貝/μL。

圖2 引物初篩結(jié)果

根據(jù)引物初篩結(jié)果，HPV68-4、HPV68-10的靈敏度檢測(cè)結(jié)果見圖 5。1×103和1×102拷貝/μL HPV68-4擴(kuò)增曲線出峰時(shí)間都在46 min，1×103拷貝/μL HPV68-10擴(kuò)增曲線出峰時(shí)間在25 min，1×102拷貝/μL HPV68-10擴(kuò)增曲線出峰時(shí)間在40 min，早于引物HPV68-4，所以HPV68-10的靈敏度較好，檢測(cè)下限為1×102拷貝/μL。

2.3 微流控芯片對(duì)HPV樣本檢測(cè)

將篩選好的HPV59、HPV66、HPV68亞型擴(kuò)增引物加入微流控芯片，并在芯片中加入LAMP反應(yīng)所需試劑，即制成可檢測(cè)這3種亞型病毒的微流控芯片，配合微流控芯片核酸分析儀，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床樣本的快速分型檢測(cè)。取3個(gè)已知感染類型的臨床樣本，分別標(biāo)記為HPV59、HPV66、HPV68亞型，用微流控芯片進(jìn)行測(cè)試，擴(kuò)增曲線斜率超過30，則說明擴(kuò)增反應(yīng)已發(fā)生，軟件自動(dòng)判斷結(jié)果為陽性；否則，為陰性。出峰時(shí)間和峰值與擴(kuò)增反應(yīng)效率呈正相關(guān)。結(jié)果如圖6，A和B中橙色曲線代表實(shí)驗(yàn)的陽性對(duì)照，綠色曲線代表檢測(cè)的目的指標(biāo)HPV59和HPV66，藍(lán)色曲線代表人基因；C中紅色曲線代表實(shí)驗(yàn)的陽性對(duì)照，綠色曲線代表檢測(cè)的目的指標(biāo)HPV68，灰色曲線代表人基因（檢測(cè)HPV59、HPV66、HPV68樣本所使用的儀器不是同一臺(tái)，因此曲線顏色代表的內(nèi)容不同）。可以看出，擴(kuò)增曲線有明顯峰值出現(xiàn)，儀器顯示為陽性，微流控芯片對(duì)這3份樣本的檢測(cè)結(jié)果與樣本中HPV亞型的實(shí)際情況完全符合。

圖3 HPV59-5引物靈敏度檢測(cè)結(jié)果

圖4 HPV66-2、HPV66-5引物靈敏度檢測(cè)結(jié)果

3 討論

針對(duì) HPV59、HPV66、HPV68亞型的基因序列，分別設(shè)計(jì)篩選出一套適合反應(yīng)的LAMP引物，將引物加入微流控芯片，對(duì)3份實(shí)際HPV樣本進(jìn)行檢測(cè)，可以準(zhǔn)確檢測(cè)出樣本的HPV亞型。研究表明，可利用LAMP技術(shù)對(duì)HPV的亞型進(jìn)行準(zhǔn)確分型，但需要解決一系列技術(shù)問題，才能確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。首先，要有良好的引物設(shè)計(jì)。在引物設(shè)計(jì)篩選過程中，HPV59引物共設(shè)計(jì)了3次，樣本檢測(cè)結(jié)果表明最后一次設(shè)計(jì)的引物較好，要使LAMP的反應(yīng)效率提高，關(guān)鍵在于讓4條引物在反應(yīng)開始階段與靶基因發(fā)生雜合反應(yīng)，因此篩選引物時(shí)除了避免假陽性反應(yīng)外，還要選擇引物片段的大小，從而使Tm值處在一定范圍內(nèi)，引物的Tm 值應(yīng)滿足 F1c、B1c＞F2、B2＞F3、B3，且 F2和 B2的Tm值應(yīng)該在BstDNA聚合酶的催化溫度范圍內(nèi)，即60～65℃。F1c和B1c的Tm值要高于F2和B2的Tm值，這樣從模板DNA上釋放的DNA單鏈能夠更快速地形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)；而F2和B2的Tm值要高于F3和B3，從而保障內(nèi)引物與靶基因的結(jié)合先于外引物。其次，在樣本檢測(cè)過程中要設(shè)法排除干擾因素，并控制好反應(yīng)條件。例如，開始時(shí)是直接將HPV樣本加入微流控芯片進(jìn)行檢測(cè)，但檢出率很低，外對(duì)照出峰時(shí)間很晚，甚至擴(kuò)增不出來。經(jīng)分析認(rèn)為可能是由于樣本中干擾成分過多，對(duì)LAMP擴(kuò)增的抑制作用過大。后將HPV樣本進(jìn)行適當(dāng)?shù)那疤幚?，再加入濃縮全集成芯片進(jìn)行檢測(cè)，檢出率明顯提高。另外，考慮到溫度會(huì)影響引物的反應(yīng)，將微流控核酸分析儀的反應(yīng)溫度降低了2℃，將之前沒有檢出的樣本在此條件下再次進(jìn)行檢測(cè)，有的樣本可被檢測(cè)為陽性?？傊诹己靡镌O(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化檢測(cè)條件，利用微流控芯片可以準(zhǔn)確檢測(cè)出臨床樣本中HPV的亞型。將LAMP技術(shù)與微流控芯片整合并用于HPV的分型檢測(cè)，不僅可獲得較高的靈敏度和特異性，還具備指標(biāo)通量高、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)，預(yù)期在臨床上有較好的應(yīng)用前景。

圖5 HPV68-4、HPV68-10引物靈敏度檢測(cè)結(jié)果

圖6 HPV樣本檢測(cè)結(jié)果