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    巨細(xì)胞病毒IgG抗體檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)的性能驗(yàn)證

    2018-08-29 01:01:56楊洋吳恩應(yīng)陳玉琴劉愛(ài)和吳灼斌林桓旭黃偉榮李彬郭采平
    生物技術(shù)通訊 2018年4期
    關(guān)鍵詞:符合率試劑一致性

    楊洋,吳恩應(yīng),陳玉琴,劉愛(ài)和,吳灼斌,林桓旭,黃偉榮,李彬,郭采平

    深圳市衛(wèi)光生物制品股份有限公司 藥物研發(fā)中心,廣東 深圳 518107

    人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)是皰疹病毒科β屬的DNA病毒,在人群中傳播廣泛,我國(guó)成人的感染率超過(guò)95%,且巨細(xì)胞病毒的感染與地區(qū)、年齡、經(jīng)濟(jì)狀況相關(guān)[1]。一般成人感染后臨床癥狀較輕或不明顯,但孕婦感染后可引起胎兒流產(chǎn)、死胎、先天性畸形及智力低下,還可導(dǎo)致器官移植等免疫功能低下的患者死亡[2-4]。因此,巨細(xì)胞病毒感染的早期快速診斷對(duì)控制巨細(xì)胞病毒傳播、促進(jìn)優(yōu)生優(yōu)育、降低器官移植患者死亡率有重要意義。我們采用間接ELISA法研制了巨細(xì)胞病毒IgG抗體檢測(cè)試劑盒,對(duì)其性能進(jìn)行了驗(yàn)證,為該試劑盒制定企業(yè)注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)和確定生產(chǎn)工藝提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    人巨細(xì)胞病毒抗原、抗人IgG-HRP購(gòu)自深圳市菲鵬生物股份有限公司;新生牛血清購(gòu)自武漢三利生物技術(shù)有限公司;牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自MP Biomedicals公司;96孔微孔板購(gòu)自深圳市金燦華公司;TMB、Tween-20購(gòu)自Amresco公司;巨細(xì)胞病毒IgG抗體參考品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院(標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號(hào)360004,批號(hào)201101,以下簡(jiǎn)稱“國(guó)家參考品”);巨細(xì)胞病毒IgG抗體企業(yè)參考品為深圳市衛(wèi)光生物制品股份有限公司自產(chǎn)(批號(hào)20140710,以下簡(jiǎn)稱“企業(yè)參考品”);參比試劑巨細(xì)胞病毒IgG抗體診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法)購(gòu)自珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)海泰生物制藥有限公司(批號(hào)20140606,以下簡(jiǎn)稱“參比試劑”);待考核試劑為巨細(xì)胞病毒IgG抗體檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法),由本公司研制(批號(hào)20140701、20140702、20140703,以下簡(jiǎn)稱“待考核試劑”);第三方試劑巨細(xì)胞病毒IgG抗體檢測(cè)試劑盒(增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光免疫分析法)購(gòu)自北京泰格科信生物科技有限公司(批號(hào)20140603,以下簡(jiǎn)稱“第三方試劑”);其余普通化學(xué)試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;實(shí)驗(yàn)樣本來(lái)源于深圳市第二人民醫(yī)院、深圳市衛(wèi)光生物制品股份有限公司單采血漿站。MK3酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo公司;PW-960全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)購(gòu)自深圳匯松公司;MB-1酶標(biāo)板脫水機(jī)購(gòu)自北京天石醫(yī)療公司;DK-600電熱恒溫水浴箱購(gòu)自上海精宏公司;KBF.720恒溫恒濕箱購(gòu)自德國(guó)賓得公司。

    1.2 HCMV IgG的檢測(cè)

    將待檢樣品按1∶101稀釋,即取待測(cè)樣品10 μL至1000 μL樣品稀釋液中,充分混勻,每孔加100 μL;設(shè)立空白對(duì)照2孔(從加底物開(kāi)始實(shí)驗(yàn)),陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和臨界對(duì)照各2孔;覆蓋封板膜,置37℃孵育30 min;取出已孵育完畢的反應(yīng)板,棄去封板膜;洗板機(jī)洗板4次,300 μL/孔,浸泡20 s,干板;每孔加入酶結(jié)合物100 μL(空白對(duì)照孔除外),覆蓋封板膜,置37℃孵育30 min;取出已孵育完畢的反應(yīng)板,棄去封板膜,洗板4次,干板;加入100 μL TMB顯色液(包括空白對(duì)照孔),輕輕振蕩混勻;覆蓋封板膜,置37℃避光孵育15 min;每孔加入100 μL終止液終止反應(yīng);終止后30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀讀取吸光度值,取單波長(zhǎng)450 nm或雙波長(zhǎng)450 nm/630 nm測(cè)量。

    1.3 HCMV IgG檢測(cè)試劑盒的性能驗(yàn)證

    1.3.1 技術(shù)指標(biāo) 依據(jù)中華人民共和國(guó)醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《YY/T 1183-2010酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)試劑(盒)》和《YY/T 1236-2014巨細(xì)胞病毒IgG/IgM抗體檢測(cè)試劑(盒)》,對(duì)試劑盒的外觀、陽(yáng)性參考品符合率、陰性參考品符合率、重復(fù)性、檢測(cè)限、批間差進(jìn)行檢測(cè)[6-7]。

    1.3.1.1 外觀 試劑盒外包裝應(yīng)完整,無(wú)破損;各組分應(yīng)齊全、完整,液體應(yīng)密封無(wú)泄漏;酶標(biāo)板條應(yīng)平整、無(wú)飛邊、表面光潔度好、底部無(wú)波紋及劃傷;液體組分應(yīng)澄清透明,無(wú)絮狀物;標(biāo)識(shí)應(yīng)清晰,易識(shí)別。

    1.3.1.2 陽(yáng)性參考品符合率 對(duì)10份陽(yáng)性參考品進(jìn)行檢測(cè),其結(jié)果應(yīng)不得出現(xiàn)假陰性。

    1.3.1.3 陰性參考品符合率 對(duì)5份陰性參考品進(jìn)行檢測(cè),其結(jié)果應(yīng)不得出現(xiàn)假陽(yáng)性。

    1.3.1.4 重復(fù)性 用重復(fù)性參考品重復(fù)檢測(cè)10次,CV應(yīng)≤15.0%。

    1.3.1.5 檢測(cè)限 對(duì)3份最低檢出限參考品進(jìn)行檢測(cè),應(yīng)均能檢出。

    1.3.1.6 批間差 用3個(gè)批號(hào)的試劑盒分別對(duì)國(guó)家參考品L1、R、N1(強(qiáng)陽(yáng)、弱陽(yáng)、陰性)、企業(yè)參考品l1、r、n1(強(qiáng)陽(yáng)、弱陽(yáng)、陰性)進(jìn)行測(cè)定,各10個(gè)復(fù)孔,計(jì)算30次結(jié)果的吸光度值值均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差(SD)及變異系數(shù)(CV值)。

    1.3.2 對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究 用本公司研制的巨細(xì)胞病毒IgG抗體檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)與珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)海泰生物制藥有限公司的巨細(xì)胞病毒IgG抗體診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法)同時(shí)檢測(cè)1050例樣本,進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究[8-12]。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。求出χ2檢驗(yàn)、一致性系數(shù)Kappa值(κ),考察評(píng)價(jià)試劑與參比試劑檢測(cè)結(jié)果的一致性及是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異。

    2 結(jié)果

    2.1 技術(shù)指標(biāo)的驗(yàn)證

    20170701、20170702、20170703批試劑盒檢測(cè)10份陽(yáng)性參考品(國(guó)家參考品,P1~P10),準(zhǔn)確性(陽(yáng)性符合率)均為100%;3批試劑盒分別檢測(cè)5份陰性參考品(國(guó)家參考品,N1~N5),特異性(陰性符合率)均為100%;重復(fù)性CV值分別為1.7%(20140701批)、4.9%(20140702批)和 4.8%(20140703批);批間變異系數(shù)分別為3.9%(強(qiáng)陽(yáng)性)、7.2%(弱陽(yáng)性)和5.3%(陰性),均小于等于15.0%;3份最低檢出限國(guó)家參考品L1、L2、L3均能檢出,且均為陽(yáng)性。

    20170701、20170702、20170703批試劑盒檢測(cè)10份陽(yáng)性參考品(企業(yè)參考品,p1~p10),準(zhǔn)確性(陽(yáng)性符合率)均為100%;3批試劑盒分別檢測(cè)5份陰性參考品(企業(yè)參考品,n1~n5),特異性(陰性符合率)均為100%;重復(fù)性CV值分別為4.6%(20140701批)、3.6%(20140702批)和 1.9%(20140703批),批間變異系數(shù)分別為5.9%(強(qiáng)陽(yáng)性)、5.9%(弱陽(yáng)性)和6.1%(陰性),均小于等于15.0%;3份最低檢出限參考品L1、L2、L3均能檢出,且均為陽(yáng)性。

    以上技術(shù)指標(biāo)均符合中華人民共和國(guó)醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《YY/T 1183-2010酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)試劑(盒)》、《YY/T 1236-2014巨細(xì)胞病毒IgG/IgM抗體檢測(cè)試劑(盒)》的要求。同時(shí),將20140701、20140702、20140703批試劑盒送中國(guó)食品藥品檢定研究院檢定,所檢技術(shù)指標(biāo)項(xiàng)目全部合格。

    2.2 對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究

    用本公司研制的巨細(xì)胞病毒IgG抗體檢測(cè)試劑盒與已上市的珠海海泰巨細(xì)胞病毒IgG抗體診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法)(國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2013第3400423號(hào))對(duì)1050份血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),可疑樣本未進(jìn)入計(jì)算。表4給出了診斷試驗(yàn)中常用的評(píng)價(jià)指標(biāo),本公司試劑盒的陽(yáng)性符合率為98.92%(95%置信區(qū)間:98.18%~99.66%),陰性符合率為98.60%(95%置信區(qū)間:97.24%~99.96%),與已上市試劑盒的總符合率為98.83%(95%置信區(qū)間:98.17%~99.49%),假陽(yáng)性率為1.40%,假陰性率為1.08%,陽(yáng)性試驗(yàn)的預(yù)示值為99.46%,陰性實(shí)驗(yàn)的預(yù)示值為97.24%,Youden指數(shù)為0.9752,Kappa系數(shù)為 0.9710,一致性優(yōu),配對(duì)χ2檢驗(yàn)的P>0.05,待考核試劑和對(duì)比試劑的檢測(cè)結(jié)果不一致部分不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異。

    1050例樣本中,結(jié)果不一致的樣本共有23例(其中13例第三方試劑與評(píng)價(jià)試劑測(cè)定結(jié)果一致,7例第三方試劑與對(duì)比試劑測(cè)定結(jié)果一致)。推斷其原因可能是樣本中巨細(xì)胞病毒IgG抗體含量位于待考核試劑最低檢出限附近,同時(shí)樣本和稀釋液沒(méi)有充分混勻,加樣后讀取試驗(yàn)結(jié)果的時(shí)間較早所致。

    表1 國(guó)家參考品驗(yàn)證結(jié)果

    表2 批間變異系數(shù)檢測(cè)結(jié)果(n=30)

    表3 企業(yè)參考品驗(yàn)證結(jié)果

    表4 2種試劑盒檢測(cè)1050例樣本的結(jié)果

    3 討論

    檢測(cè)巨細(xì)胞病毒IgG抗體的免疫學(xué)方法有中和試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫法、放射免疫法等[13],但只有酶聯(lián)免疫法具備操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性好、技術(shù)成熟的優(yōu)點(diǎn),且用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室[14-15]。

    本公司研制的巨細(xì)胞病毒IgG抗體檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)按中華人民共和國(guó)醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《YY/T 1183-2010酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)試劑(盒)》、《YY/T 1236-2014巨細(xì)胞病毒IgG/IgM抗體檢測(cè)試劑(盒)》對(duì)國(guó)家參考品和企業(yè)參考品進(jìn)行檢測(cè),各項(xiàng)指標(biāo)均合格。珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)海泰生物制藥有限公司的酶聯(lián)免疫法試劑盒的有效性已經(jīng)得到國(guó)內(nèi)權(quán)威部門的認(rèn)可,很多研究都使用該試劑盒做比對(duì)試驗(yàn)[16-17],顯示了其較好的性能,可信度高。在本次對(duì)比研究中,收集血清樣本1050例,使用本公司研制的巨細(xì)胞病毒IgG抗體檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法)與珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)海泰生物制藥有限公司的巨細(xì)胞病毒IgG抗體診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法)分別測(cè)定樣本中巨細(xì)胞病毒IgG抗體,χ2檢驗(yàn)的P>0.05,待考核試劑與對(duì)比試劑檢測(cè)不一致的部分不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異,一致性分析Kappa系數(shù)為0.9710,表明一致性優(yōu)(κ>0.75,表明一致性優(yōu);κ在0.40~0.75之間為一致性良好;κ<0.4則表示一致性較差),即2種試劑盒有高度的一致性,有臨床應(yīng)用價(jià)值,對(duì)相關(guān)疾病可以提供有效的診斷和治療依據(jù)。此外,可以依據(jù)中華人民共和國(guó)醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《干擾實(shí)驗(yàn)指南WS/T 416-2013》、《弓形蟲(chóng)、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒抗體及G型免疫球蛋白抗體親和力檢測(cè)試劑技術(shù)審查指導(dǎo)原則》完成交叉、干擾實(shí)驗(yàn),完善分析性能評(píng)估資料。

    連續(xù)研制3批試劑盒,經(jīng)以上性能評(píng)估,各批產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果符合相關(guān)要求和規(guī)定,可為完善試劑盒的產(chǎn)品技術(shù)要求和產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)提供指引。

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