超聲輔助酶法提取羅非魚皮膠原蛋白及其溶解特性

李家柔，倪劍波，何靜怡，許惠雅，井璐楠，施文正,

(1 上海海洋大學食品學院，上海 201306；2 平太榮遠洋漁業(yè)集團，浙江舟山 316100；3 國家淡水水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心(上海)，上海 201306)

人體內(nèi)富含膠原蛋白[1]，以起到支撐、保護組織的作用。外源性膠原蛋白大多來自陸生的哺乳動物[2]，目前主要應用于食品工業(yè)、生物醫(yī)藥、化工領(lǐng)域等[3]。然而，一些疾病如牛海綿狀腦病(瘋牛病)的爆發(fā)和宗教限制等因素限制了哺乳動物膠原蛋白的應用[4]。與哺乳動物膠原蛋白相比，魚類膠原蛋白有相似的氨基酸組成及生物相容性[5]，且無傳播疾病的風險、無宗教限制、吸收能力更強，引起了較多學者的關(guān)注[6-7]。據(jù)報道，魚類副產(chǎn)品膠原蛋白含量豐富，特別是魚皮中含有約70%的Ⅰ型膠原蛋白[8]。

羅非魚是中國重要的經(jīng)濟養(yǎng)殖魚類之一，生長快、富含蛋白質(zhì)[9]。2020年，中國羅非魚產(chǎn)量和羅非魚加工品產(chǎn)量分別為165萬t和55萬t[10]，但羅非魚加工品形式單一，主要為整魚冷凍和冷凍魚片[9]，副產(chǎn)物如魚皮、魚鱗、魚骨等未得到有效利用，造成資源浪費和環(huán)境污染。羅非魚皮中膠原蛋白質(zhì)量分數(shù)為20.65%，約占其粗蛋白的62.30%[11]，是良好的膠原蛋白來源。

超聲作為一種綠色加工技術(shù)，不但廣泛應用于食品加工的各個環(huán)節(jié)，也被用來提取天然活性產(chǎn)物[12]。利用超聲技術(shù)不但可以在較短的時間內(nèi)完成提取過程，而且能降低溶劑消耗，得到更高純度的產(chǎn)品[13]。鄒燁等[14]利用超聲輔助胃蛋白酶，以乙酸為溶劑提取中華鱉裙邊膠原蛋白，得率高達74.5%，且與酶提取法所得膠原蛋白相比，熱穩(wěn)定性顯著提高；李根等[15]使用超聲輔助酶法提取鯢皮膠原蛋白，得率(37.36%)是酶法提取的兩倍多，且發(fā)現(xiàn)超聲處理改變了鯢皮表面結(jié)構(gòu)，使膠原蛋白更易溶出。目前尚未有研究給出超聲輔助酶法提取羅非魚皮膠原蛋白的最佳工藝，使其在工業(yè)化的提取應用上受限。常規(guī)酶法提取魚類膠原蛋白得率約為10%～30%，效率低下且耗時較長[15-18]。

本研究采用超聲輔助胃蛋白酶法提取羅非魚皮膠原蛋白，進行響應面優(yōu)化得到使膠原蛋白得率較高的最佳提取工藝，使羅非魚皮膠原蛋白得到高效充分的利用，為羅非魚皮膠原蛋白的工業(yè)化提取以及在食品中的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚購于上海市浦東新區(qū)南匯新城鎮(zhèn)水產(chǎn)店，取魚皮去鱗除雜后，于-80 ℃冷凍備用；氫氧化鈉、氯化鈉、無水碳酸鈉、正丁醇、五水合硫酸銅等均為分析純，胃蛋白酶(3000 U/g)，國藥集團化學試劑有限公司；乙酸、酒石酸鉀鈉均為分析純，牛血清白蛋白(生物技術(shù)級，96%)，上海邁瑞爾化學技術(shù)有限公司；福林酚試劑，合肥博美生物科技有限責任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIENTZ-10N型冷凍干燥機、SB-400DTY型超聲多頻清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-1800PC型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；H-2050R型高速冷凍離心機，長沙湘儀有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫攪拌水浴鍋，常州鴻澤實驗科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料前處理

去除雜蛋白：用NaOH溶液(0.1 mol/L)浸泡魚皮24 h(m∶V=1∶20)，間隔12 h重新更換溶液以達到最佳的去除效果，之后用蒸餾水沖洗備用。

脫脂：用10%正丁醇溶液進行浸泡，其他條件同上述步驟。

1.3.2 羅非魚皮膠原蛋白的提取

超聲輔助酶法提?。簩⒔?jīng)前處理后的羅非魚皮剪碎(0.5×0.5 cm2)，每組魚皮用量為2 g，加入0.5 mol/L 乙酸溶液(m∶V=1∶40)，再加入一定量的胃蛋白酶，酶解液pH為2左右，在25 kHz 頻率下用一定功率超聲處理一定時間，4 ℃攪拌18 h，離心(10 000×g，離心半徑r=10 cm)30 min后，收集上清液，在沉淀中再次加入0.5 mol/L 乙酸溶液(m∶V=1∶10)及胃蛋白酶，進行超聲、攪拌、離心(條件同上)。收集上清液，加入NaCl使其最終濃度為0.9 mol/L，10 000×g(離心半徑r=10 cm)離心30 min后，將沉淀溶于乙酸溶液進行透析，于-80 ℃ 冷凍過夜，真空冷凍干燥后即可得到膠原蛋白粉末。

常規(guī)酶法提?。喝〖羲榈牧_非魚皮2 g，加入0.5 mol/L 乙酸溶液(m∶V=1∶40)，再加入1.67%胃蛋白酶，酶解液pH為2左右，4 ℃磁力攪拌48 h[19]，離心(10 000×g，離心半徑r=10 cm)30 min后，收集上清液，在沉淀中再次加入0.5 mol/L 乙酸溶液(m∶V=1∶10)及1.67%胃蛋白酶，進行攪拌、離心(條件同上)。收集上清液，加入NaCl使其最終濃度為0.9 mol/L，10 000×g(離心半徑r=10 cm)離心30 min后，將沉淀溶于乙酸溶液進行透析，于-80 ℃ 冷凍過夜，真空冷凍干燥后即可得到膠原蛋白粉末。

膠原蛋白得率由下式計算：

(1)

式中：y為膠原蛋白得率；m1為冷凍干燥后膠原蛋白粉末質(zhì)量/g；m2為魚皮質(zhì)量/g。

1.3.3 單因素試驗

在前期試驗基礎(chǔ)上，設(shè)定提取溶劑為乙酸(5 mol/L)、料液比為1∶40、超聲頻率為25 kHz。以膠原蛋白得率為指標，探究超聲功率(100、150、200、250、300 W)、超聲時間(15、20、25、30、35 min)、加酶量(0.75%、1.00%、1.25%、1.50%、1.75%)等因素的影響，每個水平進行3次平行試驗，取均值。

1.3.4 響應面優(yōu)化試驗

以膠原蛋白得率為響應值，設(shè)計響應面試驗，各因素與水平如表1所示。

表1 響應面試驗因素與水平

1.3.5 紫外可見光譜分析

參考邢瀚文等[21]的方法，以乙酸溶液(0.5 mol/L)為溶劑，配制1 mg/mL的膠原蛋白溶液，在10 000×g(離心半徑r=10 cm)的條件下離心10 min，取上清液，紫外掃描范圍為200～400 nm。

1.3.6 溶解度分析

參考Chen等[22]的方法并稍做改動，將膠原蛋白樣品用乙酸溶液(0.5 mol/L)溶解，使其質(zhì)量濃度為3 mg/mL，取8 mL樣品溶液，分別調(diào)pH為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，室溫下攪拌30 min后，加入蒸餾水(調(diào)至相應的pH)使其達到10 mL。室溫下再次攪拌30 min后，于4 ℃在10 000×g(離心半徑r=10 cm)條件下離心30 min，上清液蛋白濃度通過 Lowry法[23]進行測定。蛋白相對溶解度(%)由每個pH條件下蛋白濃度與最高蛋白濃度比值計算。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

使用 IBM SPSS Statistics 23.0進行單因素ANOVA檢驗、顯著性分析(P<0.05)及Duncan多重比較；使用Design-Expert 10進行響應面優(yōu)化；使用Origin 2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 超聲功率對膠原蛋白得率的影響

由圖1得，膠原蛋白得率在超聲功率為150 W時達到最大，之后隨著超聲功率的增大，膠原蛋白得率逐漸減小。

圖1 超聲功率對膠原蛋白得率的影響

一定的功率范圍內(nèi)，超聲產(chǎn)生的空化效應和機械效應可修飾酶的結(jié)構(gòu)，暴露其活性位點，提高酶的活力[24]。超聲作用還可改變底物特性，使膠原蛋白更易溶解于提取溶劑中[25]，為膠原蛋白的提取提供最佳條件。超聲功率過大時，會產(chǎn)生顯著的熱效應，降低酶的活性甚至使其失活，影響膠原蛋白得率。水產(chǎn)膠原熱變性溫度較低，溫度過高也會破壞膠原蛋白的結(jié)構(gòu)，從而降低膠原蛋白得率。所以，選取最佳超聲功率為150 W。

2.1.2 超聲時間對膠原蛋白得率的影響

由圖2 可以看出，膠原蛋白得率隨超聲時間延長呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，在超聲時間為25 min時提取率最高，為49.53%。

圖2 超聲時間對膠原蛋白得率的影響

之后，膠原蛋白得率隨超聲時間的增長而明顯降低(P<0.05)，說明超聲作用時間對膠原蛋白的得率有較大的影響。適當?shù)某曌饔脮r間可使酶與底物充分反應，促進膠原蛋白的溶出。長時間的超聲作用會產(chǎn)生較高能量，使環(huán)境介質(zhì)的溫度變高，對酶的活性以及膠原蛋白的分子結(jié)構(gòu)造成一定影響[26]，使膠原蛋白得率下降。因此，要嚴格控制超聲時間，選取25 min為最佳條件。

2.1.3 加酶量對膠原蛋白得率的影響

由圖3可知，加酶量在0.75%～1.50%范圍內(nèi)，膠原蛋白得率隨加酶量的增大而提高，在加酶量為1.5%時達到最大，繼續(xù)增大加酶量膠原蛋白得率開始降低。在加酶量為1.0%～1.5%范圍內(nèi)，膠原蛋白得率與加酶量幾乎呈現(xiàn)線性關(guān)系，這是由于，底物充足的條件下，酶促反應速率受酶濃度影響，適當增添酶量可以使底物與酶盡可能反應，進而提高膠原蛋白得率。繼續(xù)增大加酶量時，底物與酶完全反應，酶濃度過高反而會產(chǎn)生抑制作用，導致膠原蛋白降解[14,27]。鑒于此，最適加酶量定為1.5%。

圖3 加酶量對膠原蛋白得率的影響

由國標法測得凍干后膠原蛋白粉中的水分含量為：UPSC(4.52%±0.10%)，PSC(4.38%±0.06%)，不同批次的膠原蛋白粉水分含量相同。

2.2 響應面試驗結(jié)果與分析

2.2.1 數(shù)學模型的建立與顯著性分析

表2 響應面試驗設(shè)計與結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

2.2.2 因素間交互作用影響結(jié)果

由圖4可觀察到，超聲功率和加酶量(X2X3)的等高線圖為橢圓形，說明其交互作用顯著[31]。此模型下，使蛋白得率較高的條件為：超聲時間26.015 min、超聲功率164.804 W、加酶量1.67%，膠原蛋白得率為62.37%。為方便操作，調(diào)整提取條件為超聲時間26 min、超聲功率165 W、加酶量1.67%，驗證試驗所得膠原蛋白得率為62.26%，接近模型計算的理論值。常規(guī)酶法所提的膠原蛋白得率僅為29.02%，超聲輔助酶法不但縮短了提取時間，而且顯著提高了蛋白得率，為羅非魚皮膠原蛋白的高效提取提供了依據(jù)。

圖4 不同因素間交互作用的響應面和等高線圖

2.2.3 紫外光譜分析

在紫外光譜中，由于—C=O、—COOH、—CONH2等基團的存在，膠原蛋白在210～240 nm之間存在特征吸收峰[32]。由圖5可知，UPSC和PSC都在230 nm處有最大吸收峰，與Ι型膠原蛋白特征一致，且與鯢皮膠原蛋白[15]以及中華鱉膠原蛋白[33]紫外吸收峰相似。UPSC和PSC在280 nm處無明顯的吸收峰，說明其幾乎不含芳香族氨基酸。以上結(jié)果表明，超聲輔助酶法提取到的膠原蛋白為典型的Ι型膠原蛋白。

圖5 羅非魚皮膠原蛋白紫外光譜分析

2.2.4 溶解度分析

圖6 顯示了UPSC和PSC在不同pH條件下的相對溶解度，可以看出二者均在酸性條件下有較高的溶解度。

圖6 不同pH下膠原蛋白相對溶解度

UPSC和PSC的最大溶解度分別在pH=5及pH=6處，隨著pH繼續(xù)增大，相對溶解度顯著降低(P<0.05)，均在pH =7左右達到最小，而后又在堿性條件下隨pH增加有所上升。這是由于在膠原蛋白等電點(pI=7)處，蛋白分子凈電荷為0，疏水作用力增強，使膠原蛋白相對溶解度下降；當pH高于或低于等電點時，蛋白分子間的電荷斥力會增大蛋白的相對溶解度。同時可以觀察到，在酸性pH范圍內(nèi)，UPSC的相對溶解度均高于PSC，這與Zou等[33]研究結(jié)果相似，他們發(fā)現(xiàn)經(jīng)超聲處理的酸溶性蛋白比常規(guī)酸法提取所得的膠原蛋白溶解度高，這為膠原蛋白在食品工業(yè)的應用提供了借鑒。

3 結(jié)論

本研究對超聲輔助酶法提取羅非魚皮膠原蛋白的提取條件進行了響應面優(yōu)化，最優(yōu)提取工藝為：超聲功率165 W、超聲時間26 min、加酶量1.67%，此工藝下膠原蛋白得率高達62.26%，約為常規(guī)酶法提取得率(29.02%)的兩倍。此法高效簡便，既縮短了提取時間，又顯著提高了羅非魚皮膠原蛋白得率。紫外光譜掃描結(jié)果表明，UPSC在230 nm處有最大吸收峰，為典型的Ι型膠原蛋白。溶解性試驗表明，在酸性條件下，與PSC相比，UPSC具有更高的相對溶解度。因此，超聲輔助酶法是一種簡便高效的提取方法，適合羅非魚皮膠原蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)。未來可進一步探討超聲輔助對于羅非魚皮膠原蛋白各項物理化學性質(zhì)的影響及變化機制，使羅非魚皮膠原蛋白得到差異化利用。

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