檸檬苦素對(duì)大鼠肝纖維化的影響及機(jī)制初探Δ

肖玉洪，安禎祥（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，貴陽(yáng) 55000；.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，貴陽(yáng) 550001）

肝纖維化是由各種致病因子導(dǎo)致慢性肝損傷的病理性修復(fù)過(guò)程，細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積是其主要病理特征。肌成纖維細(xì)胞是產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的核心細(xì)胞，而肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞可通過(guò)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）為肌成纖維細(xì)胞[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，EMT可促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，但EMT過(guò)程是可逆的，抑制細(xì)胞EMT過(guò)程，能減緩甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)程[2]。這使得逆轉(zhuǎn)EMT成為抗肝纖維化的潛在策略。

檸檬苦素是一種三萜類化合物，也是橙子和檸檬種子以及果皮中的主要活性成分，具有保肝、抗肝癌、抗炎等藥理作用[3]。有研究表明，檸檬苦素可通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）/Smad信號(hào)通路來(lái)逆轉(zhuǎn)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺組織EMT過(guò)程，減輕小鼠的肺纖維化[4]。為探究檸檬苦素對(duì)肝纖維化的改善作用，以及其抗肝纖維化作用是否與調(diào)控EMT相關(guān)，本研究以四氯化碳（CCl4）造模法構(gòu)建肝纖維化大鼠模型，觀察檸檬苦素對(duì)大鼠肝纖維化的影響，并基于EMT角度，初步探討其可能的作用機(jī)制，旨在為檸檬苦素的藥理研究與開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有DM500型光學(xué)顯微鏡（德國(guó)Leica公司）、TGL-20M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙高新開發(fā)區(qū)湘儀貝克儀器儀表有限公司）、EPS-300型電泳儀（上海天能科技有限公司）、RS-25S型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波榮順科技儀器廠）、EL10A型自動(dòng)酶標(biāo)儀（博科控股集團(tuán)有限公司）、Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System型蛋白電泳槽和Mini Trans-Blot型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）、LIDE 200型掃描儀（日本Canon公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

檸檬苦素對(duì)照品（批號(hào)NMKS2021081，純度99.58%）購(gòu)自南京春秋生物工程有限公司；秋水仙堿片（批號(hào)201202，規(guī)格0.5 mg）購(gòu)自西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司；CCl4（批號(hào)20181008，純度≥99.5%）購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）、層粘連蛋白（laminin，LN）試劑盒（貨號(hào)分別為RA20032/20211010、RA20606/20211010）均購(gòu)自武漢貝茵萊生物科技有限公司；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒（批號(hào)分別為20211015、20211016）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；ECL高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒、ECL低背景發(fā)光檢測(cè)試劑盒和辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔及羊抗鼠免疫球蛋白G抗體（批號(hào)分別為30330、50330、20330、30324）均購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司；鼠源蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）、磷酸化 Akt（p-Akt）（Ser473）、波形蛋白（vimentin）克隆抗體（批號(hào)分別為10021367、10020148、10010984）均購(gòu)自Proteintech中國(guó)公司；兔源E-鈣黏蛋白（E-cadherin）多克隆抗體（批號(hào)AF06224214）購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗體（批號(hào)GR3316865-11）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；水為蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠42只，SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（遼）2020-0001。大鼠由貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心喂養(yǎng)。大鼠自由飲水?dāng)z食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)由貴州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)20210008）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、建模、給藥及取材

將大鼠隨機(jī)分成正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（秋水仙堿0.1 mg/kg）[5]和檸檬苦素低、高劑量組（12.5、50 mg/kg）[4]，正常組和模型組各9只，其余每組各8只。除正常組大鼠腹腔注射橄欖油外，其余各組大鼠均腹腔注射含50%CCl4的橄欖油混合溶液（體積比1∶1），注射體積為1.5 mL/kg，每周2次，連續(xù)注射8周，構(gòu)建肝纖維化模型[6]。注射造模8周后，從正常組和模型組中各抽取1只大鼠處死并取出肝臟行蘇木精-伊紅（HE）染色，依據(jù)Scheuer評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估造模成功[7]。從第9周起，各組大鼠按10 mL/kg灌胃，正常組及模型組給予水，其余各組大鼠給予相應(yīng)藥物（臨用時(shí)用水溶解），每日1次，連續(xù)給藥4周。末次給藥后（第12周末），大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉后采血，離心后留取血清，于-20 ℃保存，用于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定；大鼠采血后處死，將肝右葉組織用4%多聚甲醛溶液固定，用于HE和Masson染色；剩余肝組織立即凍存在-80 ℃冰箱中，用于Western blot檢測(cè)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，正常組和模型組大鼠無(wú)死亡，陽(yáng)性對(duì)照組和檸檬苦素低、高劑量組各死亡1只大鼠，總計(jì)死亡3只大鼠。

2.2 血清中肝功能指標(biāo)和肝纖維化指標(biāo)的檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法，按試劑盒說(shuō)明書步驟操作，檢測(cè)各組大鼠血清中ALT、AST、HA、LN含量。

2.3 肝組織形態(tài)和肝纖維化的觀察

取“2.1”項(xiàng)下各組3只大鼠固定于4%多聚甲醛溶液的肝組織，石蠟包埋、切片，每只大鼠取3個(gè)切片進(jìn)行HE染色，另外取3個(gè)切片進(jìn)行Masson染色，用光學(xué)顯微鏡觀察肝組織形態(tài)和肝纖維化并采集圖像，用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)定Masson染色圖像的光密度和面積，計(jì)算平均光密度。

2.4 肝組織中Akt、p-Akt、E-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)的檢測(cè)

取“2.1”項(xiàng)下各組3只大鼠凍存在-80 ℃冰箱中的肝組織，稱定質(zhì)量后盡可能剪碎，加入組織蛋白抽提試劑，冰浴勻漿、超聲破碎及離心后收集上清液，測(cè)定各樣本蛋白含量。對(duì)蛋白進(jìn)行加熱變性處理后，電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，洗膜后，分別加入 E-cadherin、p-Akt、Akt、vimentin、GAPDH一抗（稀釋度分別為1∶1 000、1∶3 000、1∶3 000、1∶10 000、1∶10 000），4 ℃孵育過(guò)夜；膜洗滌后加入相應(yīng)的二抗（稀釋度為1∶200），室溫孵育后，漂洗，ECL化學(xué)發(fā)光和曝光顯影及定影。使用Gel-Pro Analyzer 4軟件分析目標(biāo)蛋白的灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白（GAPDH）的灰度值比值表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平，并計(jì)算p-Akt/Akt比值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性時(shí)組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)組間兩兩比較選擇Tamhane-T2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 檸檬苦素對(duì)肝纖維化模型大鼠血清肝功能指標(biāo)的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST含量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和檸檬苦素低、高劑量組大鼠血清中ALT、AST含量均顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1 檸檬苦素對(duì)肝纖維化模型大鼠血清肝功能指標(biāo)的影響（±s，U/L）

表1 檸檬苦素對(duì)肝纖維化模型大鼠血清肝功能指標(biāo)的影響（±s，U/L）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01

組別正常組模型組陽(yáng)性對(duì)照組檸檬苦素高劑量組檸檬苦素低劑量組AST 6.78±2.25 75.80±12.12a 21.10±6.61b 16.30±6.58b 18.82±2.57b n 8 8 7 7 7 ALT 4.88±2.14 56.65±9.30a 19.44±6.05b 27.41±4.95b 21.74±3.01b

3.2 檸檬苦素對(duì)肝纖維化模型大鼠血清纖維化指標(biāo)的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清中HA、LN含量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和檸檬苦素低、高劑量組大鼠血清中HA含量均顯著降低（P＜0.01），陽(yáng)性對(duì)照組和檸檬苦素高劑量組大鼠血清中LN含量均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），檸檬苦素低劑量組大鼠血清中LN含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

表2 檸檬苦素對(duì)肝纖維化模型大鼠血清纖維化指標(biāo)的影響（±s，ng/mL）

表2 檸檬苦素對(duì)肝纖維化模型大鼠血清纖維化指標(biāo)的影響（±s，ng/mL）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組陽(yáng)性對(duì)照組檸檬苦素高劑量組檸檬苦素低劑量組n 8 8 7 7 7 HA 19.28±5.30 69.43±12.64a 27.46±1.80b 21.17±4.20b 27.06±5.45b LN 119.07±16.13 187.63±40.22a 140.37±26.30b 149.14±12.44c 181.43±21.45

3.3 檸檬苦素對(duì)肝纖維化模型大鼠肝組織病理學(xué)變化的影響

3.3.1 組織形態(tài) 如圖1所示，正常組大鼠肝竇無(wú)擴(kuò)張，門管區(qū)結(jié)構(gòu)完整，未見纖維組織增生及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組大鼠可見縱橫交錯(cuò)的纖維間隔，纖維組織大量增生，肝小葉紊亂，門管區(qū)變寬，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，少量肝細(xì)胞壞死，肝細(xì)胞脂肪變性明顯。陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肝臟被膜完整，纖維組織明顯增生，纖維間隔內(nèi)可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。檸檬苦素高劑量組大鼠肝臟被膜完整，肝細(xì)胞輕度脂肪變性，纖維組織少量增生，可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。檸檬苦素低劑量組大鼠肝臟被膜完整，纖維組織中度增生，門管區(qū)見明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和檸檬苦素低、高劑量組大鼠肝組織纖維增生程度均有所減輕，炎癥程度均有所改善。

圖1 檸檬苦素對(duì)肝纖維化模型大鼠肝組織形態(tài)變化的影響（HE染色，×200）

3.3.2 纖維化 如圖2所示，正常組大鼠匯管區(qū)觀察到少量藍(lán)色膠原纖維沉積。模型組大鼠可見大量藍(lán)色膠原纖維沉積，纖維增生明顯；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和檸檬苦素低、高劑量組大鼠的藍(lán)色膠原纖維沉積減少，纖維增生程度有所改善。正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和檸檬苦素低、高劑量組大鼠肝纖維化表達(dá)的平均光密度分別為 0.023±0.009、0.282±0.012、0.198±0.010、0.199±0.060、0.191±0.009（n=3）。與正常組比較，模型組大鼠肝纖維化表達(dá)的平均光密度顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組與檸檬苦素高劑量組大鼠肝纖維化表達(dá)的平均光密度均顯著降低（P＜0.01），檸檬苦素低劑量組大鼠肝纖維化表達(dá)的平均光密度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 檸檬苦素對(duì)肝纖維化模型大鼠肝纖維化變化的影響（Masson染色，×400）

3.4 檸檬苦素對(duì)肝纖維化模型大鼠肝組織中Akt、p-Akt、E-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)及p-Akt/Akt比值的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織中Akt、p-Akt、vimentin蛋白表達(dá)水平及p-Akt/Akt比值均顯著升高（P＜0.01），E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和檸檬苦素低、高劑量組大鼠肝組織中Akt、p-Akt、vimentin蛋白表達(dá)水平及p-Akt/Akt比值均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），陽(yáng)性對(duì)照組和檸檬苦素高劑量組大鼠肝組織中E-cadherin蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01），檸檬苦素低劑量組大鼠肝組織中E-cadherin蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見圖3。

圖3 檸檬苦素對(duì)肝纖維化模型大鼠肝組織中p-Akt、Akt、E-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)及p-Akt/Akt比值的影響（±s，n＝3）

4 討論

檸檬苦素是一種天然化學(xué)物質(zhì)，對(duì)急性肝損傷具有改善作用[8]，同時(shí)也可通過(guò)減少脂質(zhì)積累、抑制炎癥和氧化應(yīng)激來(lái)緩解非酒精性脂肪性肝病的發(fā)展[9]。本研究采用CCl4造模法構(gòu)建肝纖維化大鼠模型，考察檸檬苦素對(duì)大鼠肝纖維化的影響，同時(shí)選用有明顯抗肝纖維化作用的秋水仙堿作為陽(yáng)性對(duì)照藥物進(jìn)行比較[10]。CCl4造模法具有價(jià)格低廉、可靠性高、重復(fù)性好、與人類肝纖維化病理相似性高等特點(diǎn)，已成為了應(yīng)用最廣泛的肝纖維化造模方法[11]。CCl4可造成肝細(xì)胞損害，引起肝細(xì)胞膜通透性增高，胞漿內(nèi)的ALT、AST釋放入血，使血液中ALT、AST含量升高，是判斷肝細(xì)胞損傷與否及損傷程度的主要指標(biāo)[12]。HA、LN是參與細(xì)胞外基質(zhì)合成的主要成分，可反映肝內(nèi)纖維增生情況[13]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST、HA、LN含量均顯著升高，HE及Masson染色均觀察到大量纖維組織增生，表明肝纖維化模型造模成功。與模型組比較，經(jīng)檸檬苦素干預(yù)后，大鼠血清中HA、LN（檸檬苦素低劑量組除外）、AST、ALT含量均顯著降低，肝組織纖維增生程度均有所減輕，表明檸檬苦素對(duì)肝纖維化模型大鼠的肝損傷和肝纖維化有一定的改善作用。

EMT是指上皮細(xì)胞在致病因子（如細(xì)胞生長(zhǎng)因子、缺氧、炎癥等）刺激下喪失細(xì)胞極性，細(xì)胞間黏附力降低，獲得遷移的能力，變?yōu)榫邆溟g質(zhì)細(xì)胞特征細(xì)胞的過(guò)程[14]。E-cadherin是黏附連接的關(guān)鍵成分，在維持細(xì)胞黏附和上皮表型中不可或缺，其表達(dá)下調(diào)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間的黏附力降低，使細(xì)胞失去極性，是主要的上皮標(biāo)志物[15]。vimentin是間質(zhì)細(xì)胞骨架的主要組成部分，也是主要的間充質(zhì)標(biāo)志物，正常上皮細(xì)胞中vimentin表達(dá)較少，當(dāng)發(fā)生EMT時(shí)上皮細(xì)胞角蛋白轉(zhuǎn)化為以vimentin為主的細(xì)胞骨架，具有間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和游走能力[16]。Akt磷酸化可調(diào)控細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子與E-cadherin結(jié)合，可導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)下降，進(jìn)而誘導(dǎo)EMT發(fā)生[17—18]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和檸檬苦素低、高劑量組大鼠肝組織中Akt、p-Akt、vimentin蛋白表達(dá)水平及p-Akt/Akt比值均顯著降低，E-cadherin蛋白表達(dá)水平（檸檬苦素低劑量組除外）均顯著升高，表明檸檬苦素能抑制Akt蛋白磷酸化，逆轉(zhuǎn)EMT進(jìn)程。

綜上所述，檸檬苦素能改善大鼠肝纖維化，作用機(jī)制可能與其抑制Akt磷酸化及逆轉(zhuǎn)EMT進(jìn)程有關(guān)。