國(guó)人卵巢癌DNA 損傷修復(fù)基因突變圖譜分析*

葉英楠 王珂 董莉 程亞楠 韓雷 張蕊 于津浦

卵巢癌是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，也是婦科腫瘤的第二大死因。由于篩查方法受限，早期發(fā)現(xiàn)困難，5 年生存率僅為 46%[1-2]。在我國(guó)，卵巢癌也是高發(fā)病率和高致死率的癌癥之一，嚴(yán)重威脅著女性的健康[2]。卵巢癌中90%為上皮性卵巢癌，其中最多見(jiàn)的是高級(jí)別漿液性卵巢癌（high-grade serous ovarian cancer，HGSOC）。在卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，基因突變發(fā)揮了重要作用。其中，乳腺癌易感基因（breast cancer susceptibility genes，BRCA）作為重要的同源重組修復(fù)（homologous recombination repair，HRR）基因，其變異與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展和臨床治療密切相關(guān)。

DNA 損傷修復(fù)（DNA damage repair，DDR）基因除同源重組（homologous recombination,HR）通路外，還包括錯(cuò)配修復(fù)（mismatch repair，MMR）通路、核苷酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair，NER）通路、堿基切除修復(fù)（base excision repair，BER）通路等[3]。其中HR 通路和MMR 通路是雙鏈DNA 和單鏈DNA修復(fù)的關(guān)鍵通路，在多種腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是備受關(guān)注的DNA 損傷修復(fù)通路[4]。有報(bào)道顯示，ATM、BRIP1、PALB2、RAD51C、RAD51D等HRR 基因與卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)[5-6]。也有報(bào)道認(rèn)為，MLH1、MSH2、MSH6 等MMR 基因增加卵巢癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[7]。因此，本研究參照NCCN 指南的推薦，利用高通量測(cè)序技術(shù)分析122 例卵巢癌中ATM、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、PALB2、RAD51C、RAD51D 等HRR 基因，EPCAM、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2 等MMR 基因，PTEN、STK11和TP53 等卵巢癌易感基因的胚系和體細(xì)胞變異圖譜，以明確DDR 基因突變?cè)谥袊?guó)卵巢癌人群中的分布及其與臨床病理特征的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本收集 本研究納入2019 年6 月至2020年6 月在天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院接受手術(shù)治療的卵巢癌患者122 例。收集全部患者的血液白細(xì)胞樣本及其中67 例患者的腫瘤組織標(biāo)本。同時(shí)收集122 例患者的臨床特征，包括發(fā)病年齡、既往史、家族史、病理類(lèi)型、FIGO 分期、鉑類(lèi)藥物的治療反應(yīng)以及復(fù)發(fā)情況。122 例病例中，患者中位年齡為56（30～77）歲。10 例既往患其他惡性腫瘤，其中7 例為乳腺癌。47例有腫瘤家族史，其中15 例有乳腺癌卵巢癌家族史。FIGO 分期：Ⅰ期12 例，Ⅱ期15 例，Ⅲ期46 例，Ⅳ期49 例。病理類(lèi)型：漿液性腺癌111 例，透明細(xì)胞癌9 例，子宮內(nèi)膜癌2 例，未納入其他病理類(lèi)型?；颊呓邮芰藵M(mǎn)意的卵巢細(xì)胞減滅術(shù)或新輔助化療聯(lián)合中間性腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)，且兩種治療方式的入組患者均接受鉑類(lèi)藥物化療，化療療程共6～8 個(gè)周期，隨訪(fǎng)時(shí)間12～24 個(gè)月。本研究獲得天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有納入受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.1.2 二代測(cè)序檢測(cè)試劑盒 本研究采用基于Ion Torrent S5TM平臺(tái)的針對(duì)19 個(gè)卵巢癌易感基因二代測(cè)序檢測(cè)試劑盒GO prep kits（安智因公司，中國(guó)北京），用于外周血白細(xì)胞樣本和腫瘤組織DNA 突變情況檢測(cè)。檢測(cè)覆蓋ATM、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CHEK2、EPCAM、MLH1、MSH2、MSH6、NBN、PALB2、PMS2、PTEN、RAD51C、RAD51D、STK11、TP53 基因的編碼序列和剪接區(qū)域（外顯子邊界±10 bp）。目標(biāo)區(qū)域大小為258 kb，99%的目標(biāo)區(qū)域被1 452 個(gè)擴(kuò)增子覆蓋。

1.2 方法

使用QIAamp DNA Blood Mini Kit（凱杰公司，德國(guó)）提取白細(xì)胞和腫瘤組織樣本的基因組DNA。使用GO prep kits 構(gòu)建目標(biāo)區(qū)域DNA 文庫(kù)。制備的文庫(kù)通過(guò)Ion Torrent S5TM平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)TMAP（v5.10）將合格的讀數(shù)與人類(lèi)參考基因組hg19 進(jìn)行比對(duì)。白細(xì)胞樣本目標(biāo)區(qū)域的測(cè)序深度不低于200×，腫瘤樣本的測(cè)序深度不低于1 000×。使用TVC軟件（v5.10）進(jìn)行變異檢測(cè)（SNV/small InDel＜22 bp）。使用Ensembl Variant Effect Predictor 軟件（http://grch37.ensembl.org/info/docs/tools/vep/index.html）進(jìn)行變異注釋?zhuān)?HGVS 表示法、來(lái)自GnomAD 的人口等位基因頻率（http://gnomad.broadinstitute.org/）和1K 基因組計(jì)劃（http://www.1000genomes.org），臨床意義狀態(tài)由HGMD（http://www.hgmd.cf.ac.uk/）、ClinVar（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）、BRCAexchange（https://brcaexchange.org/）和BIC（https://research.nhgri.nih.gov/bic/）數(shù)據(jù)庫(kù)信息進(jìn)行判讀。根據(jù)《ACMG 遺傳變異分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)與指南》，所有突變被分為致病性（pathogenic，P）、可能致病性（likely pathogenic，LP）、臨床意義未明（variant of uncertain significance，VUS）、可能良性（likely benign，LB）和良性（benign，B）。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，計(jì)數(shù)資料用表示。計(jì)量資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌患者胚系突變特征

122 例卵巢癌患者中共檢出胚系突變位點(diǎn)107 個(gè)，其中致病性位點(diǎn)36 個(gè)（33.64%），可能致病性位點(diǎn)2個(gè)（1.87%），臨床意義不明位點(diǎn)69 個(gè)（64.49%）（圖1A）。在全部的突變位點(diǎn)中主要的突變類(lèi)型為錯(cuò)義突變（61.68%），但在致病和可能致病性位點(diǎn)中，主要的突變類(lèi)型為移碼突變（63.16%，圖1B）。這些位點(diǎn)中80.37%為HRR 基因，包括ATM、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CHEK2、NBN、PALB2、RAD51D；其余19.63%為MMR 基因，包括EPCAM、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2（圖1C，1D）。檢出的38 個(gè)致病和可能致病性位點(diǎn)主要集中于BRCA1、BRCA2、ATM、RAD51D。MMR 通路基因未檢出致病或可能致病性突變，這表明卵巢癌患者胚系突變致病基因主要為HRR 基因。

圖1 卵巢癌患者胚系突變特征

2.2 卵巢癌患者胚系BRCA 基因突變與臨床病理特征相關(guān)性

122 例卵巢癌患者中共檢出BRCA 致病或可能致病胚系突變陽(yáng)性（BRCA+）29 例（23.77%），其中22例為BRCA1 突變，7 例為BRCA2 突變。對(duì)比BRCA+和BRCA-患者的臨床特征（表1），發(fā)現(xiàn)BRCA+患者有腫瘤家族史和乳腺癌卵巢癌家族史的比例均顯著高于BRCA-患者（55.17%vs.33.33%，P=0.035；27.59%vs.7.53%，P=0.008），說(shuō)明BRCA 基因胚系突變與家族聚集有關(guān)。BRCA+患者病理類(lèi)型為漿液性腺癌的比例顯著高于陰性患者（100%vs.88.17%，P=0.043），并且BRCA+患者的病理類(lèi)型全部為HGSOC。表明BRCA 基因胚系突變與HGSOC 病理類(lèi)型有關(guān)，BRCA+患者對(duì)鉑類(lèi)藥物治療敏感的比例增高（82.76%vs.72.04%），但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 122 例卵巢癌患者胚系BRCA 基因突變與臨床病理特征相關(guān)性

2.3 卵巢癌患者HRR 基因胚系突變與臨床病理特征的相關(guān)性

122 例卵巢癌患者中共檢出38 例（31.15%）攜帶HRR 致病或可能致病胚系突變患者（gHRR+），其中22 例為BRCA1 突變，7 例為BRCA2 突變，8 例為RAD51D 突變，1 例ATM 突變。對(duì)比gHRR+和gHRR-患者的臨床特征（表2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)gHRR+患者55 歲前發(fā)病的比例高于gHRR-患者（57.89%vs.36.90%，P=0.030）。gHRR+患者中有家族史和有乳腺癌卵巢癌家族史的比例均高于gHRR-患者（55.26%vs.30.95%，P=0.011；26.31%vs.5.95%，P=0.003），說(shuō)明gHRR+發(fā)病較早，與家族聚集有關(guān)。gHRR+患者病理類(lèi)型為漿液性腺癌的比例顯著高于陰性患者（100%vs.86.90%，P=0.013），且gHRR+患者的病理類(lèi)型均為HGSOC。gHRR+患者對(duì)鉑類(lèi)化療藥物治療敏感性更高（86.84%vs.69.05%，P=0.037），提示HRR 基因胚系突變與卵巢癌的病理分型和治療效果有關(guān)。

表2 122 例卵巢癌患者HRR 基因胚系突變與臨床特征相關(guān)性

2.4 卵巢癌患者腫瘤組織突變特征

122 例卵巢癌患者中有67 例同時(shí)檢測(cè)了腫瘤組織樣本，共檢出突變位點(diǎn)119 個(gè)，其中致病性位點(diǎn)40 個(gè)（33.61%），可能致病性位點(diǎn)26 個(gè)（21.85%），臨床意義不明位點(diǎn)53 個(gè)（44.54%）（圖2A）。在全部的突變位點(diǎn)中，主要的突變類(lèi)型為錯(cuò)義突變（63.87%）；在致病和可能致病性位點(diǎn)中，主要的突變類(lèi)型為錯(cuò)義突變（40.91%），其次是移碼突變（30.30%，圖2B）。這些位點(diǎn)致病和可能致病性位點(diǎn)主要集中于TP53、BRCA1、BRCA2、ATM、RAD51D、PALB2 和PMS2（圖2C）。致病和可能致病性DDR基因變異位點(diǎn)與胚系變異位點(diǎn)的分布不同，胚系致病性突變主要集中在以BRCA1/2 為主的HRR 基因；而組織層面檢出的致病性突變主要集中在TP53（59.09%），其次是HRR基因（39.39%），僅有1.52%為MMR 基因（圖2D）。

圖2 卵巢癌患者體細(xì)胞突變特征

2.5 卵巢癌患者HRR 基因體細(xì)胞突變與臨床病理特征的相關(guān)性

上述67 例患者中，46 例組織層面檢出致病或可能致病性突變，其中20 例患者檢出2 個(gè)突變。26 例患者腫瘤組織層面檢出HRR 基因突變（tHRR），39 例患者檢出TP53 基因突變，1 例患者檢出PMS2 突變。在腫瘤組織tHRR 突變的患者中有22 例在胚系層面檢出了HRR 基因突變（84.66%），4 例患者未檢出胚系HRR 突變，僅檢出體細(xì)胞HRR 突變，說(shuō)明組織層面tHRR 檢測(cè)可以提高檢出率，使更多患者受益。比較tHRR+和tHRR-患者的臨床特征（表3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)tHRR+患者55 歲之前發(fā)病的比例顯著高于tHRR-患者（53.85%vs.34.14%），并且，tHRR+患者中有家族史和有乳腺癌卵巢癌家族史的比例均高于tHRR-患者（53.85%vs.14.63%，P=0.001；19.23%vs.2.44%，P=0.029）。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，tHRR+患者對(duì)鉑類(lèi)化療藥物治療敏感性更高（88.46%vs.56.10%，P=0.005），且復(fù)發(fā)比例更低（19.23%vs.51.22%，P=0.009），提示HRR基因體細(xì)胞突變與卵巢癌的治療效果和預(yù)后有關(guān)。MMR 基因致病性或可能致病性突變檢出較少，僅1例患者檢出了PMS2 突變。39 例患者檢出TP53突變，通過(guò)對(duì)比tTP53+和tTP53-患者的臨床病理指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)tTP53+患者有乳腺癌卵巢癌家族史的比例較高，其余指標(biāo)均無(wú)顯著差異。說(shuō)明目前針對(duì)卵巢癌患者腫瘤組織的DDR 的基因檢測(cè)中，HRR 基因檢測(cè)的價(jià)值較高。

表3 67 例卵巢癌患者體細(xì)胞HRR 基因突變與臨床病理特征的相關(guān)性

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，67 例患者中22 例攜帶胚系突變（gMut+），24 例未檢出胚系突變但檢出體細(xì)胞致病或可能致病性突變（gMut-tMut+），21 例患者兩個(gè)層面均未檢出突變（WT）。對(duì)比三組患者的臨床特征（表4），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，gMut+患者在這三組中，有腫瘤家族史和有乳腺癌卵巢癌家族史的比例最高（54.54%vs.29.17%vs.4.76%，P=0.001；22.72%vs.4.17%vs.0，P=0.014），說(shuō)明攜帶胚系突變的患者家族聚集性最明顯，gMut+患者鉑類(lèi)化療藥物治療敏感性更高（90.90%vs.52.38%vs.61.90%，P=0.012），也正因?qū)︺K類(lèi)藥物的響應(yīng)，其復(fù)發(fā)比例在三組中最低（13.64%vs.50.00%vs.52.38%，P=0.008）。

表4 67 例卵巢癌患者基因突變與臨床病理特征相關(guān)性

3 討論

DDR 基因與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，本研究中納入19 個(gè)DDR 基因，涵蓋HR 通路、MMR 通路以及與卵巢癌發(fā)病相關(guān)的易感基因。眾多DDR 基因中，HRR 基因發(fā)揮了重要的作用[8]，《NCCN 遺傳性/家族性高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指南：乳腺和卵巢》中指出，HRR 基因中的ATM、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、PALB2、RAD51C、RAD51D 等基因明確或可能增加卵巢癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[9]。同時(shí)，MMR 基因EPCAM、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2 明確增加卵巢癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。MMR基因的胚系突變可導(dǎo)致林奇綜合征，使罹患卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)增加9%～14%[10]。本研究納入的卵巢癌易感基因PTEN、STK11 和TP53 分別被認(rèn)為是Cowden 綜合征、Peutz-Jeghers 綜合征、Li-Fraumeni 綜合征的致病基因，可增加卵巢癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。本文研究在BRCA 胚系突變陰性的患者中檢出ATM 和RAD51D的胚系突變，占整體的7.38%，提示BRCA 陰性的患者中仍有部分存在HR 通路缺陷，但是本研究未檢出胚系MMR 基因或易感基因的致病或可能致病性突變。

BRCA 基因與卵巢癌的發(fā)病年齡、家族性、遺傳性相關(guān)[11-12]。本文研究發(fā)現(xiàn)不僅是BRCA，HRR 基因胚系突變的患者也具有明顯的遺傳發(fā)病特征，呈現(xiàn)典型的家族聚集現(xiàn)象，并且HRR 基因突變的患者55 歲之前發(fā)病比例較高。有研究表明BRCA1/2 基因突變與HGSOC 有關(guān)[13]，本文研究發(fā)現(xiàn)不僅BRCA1/2 基因，HRR 基因突變也與HGSOC 相關(guān)。但是，本研究發(fā)現(xiàn)HRR 基因突變與鉑類(lèi)藥物治療敏感性相關(guān)，HRR 基因突變患者對(duì)鉑類(lèi)藥物治療更敏感[14-15]，提示開(kāi)展HRR 多基因檢測(cè)對(duì)于指導(dǎo)卵巢癌患者精準(zhǔn)治療有重要價(jià)值。

除了胚系突變，體細(xì)胞突變也具有重要的檢測(cè)價(jià)值，其能更加直觀地反映腫瘤組織的突變情況。體細(xì)胞層面檢測(cè)出致病性突變最多的基因是TP53，多數(shù)腫瘤組織攜帶TP53 突變，卵巢癌組織中TP53 也是最主要的突變基因，然而目前卵巢癌中并無(wú)針對(duì)TP53 有效的治療方法[16-18]。本文也分析了TP53 與卵巢癌患者臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TP53 與卵巢癌患者治療和預(yù)后無(wú)顯著相關(guān)。本文僅檢出1 例患者攜帶MMR 基因致病突變，提示攜帶MMR 基因突變的患者比例可能較低，組織層面檢出的HRR 突變大部分來(lái)源于胚系，這與腫瘤的“二次打擊”學(xué)說(shuō)一致，攜帶胚系突變的人群罹患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)更高。但是仍有4例患者為gHRR-、tHRR+（這些位點(diǎn)發(fā)生于ATM、BRCA1 和PLAB2 基因），其中2 例胚系中檢出NBN基因VUS 突變。現(xiàn)階段對(duì)于BRCA 以外的其他HRR 基因VUS 突變認(rèn)識(shí)仍有不足，提示某些HRR基因的VUS 突變可能具有致病性，仍有待進(jìn)一步研究。另外2 例患者除了攜帶tHRR，還檢出tTP53 突變，這提示腫瘤組織的驅(qū)動(dòng)基因突變可能在卵巢癌發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮作用。組織層面檢出tHRR 的患者與gHRR 的患者在發(fā)病年齡和家族史方面具有相同的特征，并且對(duì)鉑類(lèi)藥物治療敏感。本研究還發(fā)現(xiàn)，tHRR突變有利于降低患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。有文獻(xiàn)報(bào)道攜帶以BRCA 為主的HRR 突變的患者短期生存優(yōu)勢(shì)明顯[19-22]，這與本文研究結(jié)果一致，說(shuō)明腫瘤組織的HRR 基因檢測(cè)有助于增加鉑類(lèi)獲益人群的檢出，并輔助評(píng)估卵巢癌患者的遠(yuǎn)期預(yù)后。

聚ADP-核糖聚合酶（poly-ADP ribose polymerase，PARP）抑制劑已經(jīng)獲批應(yīng)用于BRCA 突變和同源重組修復(fù)缺陷（homologous recombination repair deficiency，HRD）患者的治療[23-26]。因此，可以預(yù)見(jiàn)，開(kāi)展基于二代測(cè)序的DDR 多基因檢測(cè)可使更多的卵巢癌患者從中受益，指導(dǎo)卵巢癌精準(zhǔn)診療，并輔助遠(yuǎn)期預(yù)后的評(píng)估。