基于大缸奶樣檢測(cè)兩病的應(yīng)用及挑戰(zhàn)

陳穎鈺，李 翔，郭愛(ài)珍

（1.國(guó)家動(dòng)物結(jié)核病專業(yè)實(shí)驗(yàn)室（武漢），武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，武漢 430070；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070；4. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，武漢 430070）

牛結(jié)核病和布魯菌病在民間俗稱“兩病”，是影響奶牛業(yè)發(fā)展的重要疫病。前者主要引起呼吸道癥狀，導(dǎo)致奶牛的消瘦和咳嗽，并有可能通過(guò)飛沫或未經(jīng)消毒的病牛奶傳染給人；后者主要引起孕畜的流產(chǎn)、死胎等繁殖障礙，也有通過(guò)接觸傳染給人的風(fēng)險(xiǎn)。因此，“兩病”不僅給養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還對(duì)公共衛(wèi)生造成巨大的威脅。

2016年《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012—2020年）》出臺(tái)，明確指出奶牛結(jié)核病及布魯菌病為優(yōu)先防治的動(dòng)物病種；到2020年需達(dá)到規(guī)劃設(shè)定的考核標(biāo)準(zhǔn)，牛發(fā)病率下降到4%以下，動(dòng)物發(fā)病率、死亡率和公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)顯著降低。加上民眾對(duì)“兩病”認(rèn)知程度的不斷提高，對(duì)乳品要求的不斷加大，養(yǎng)牛企業(yè)對(duì)兩病的防控意識(shí)也在不斷增加。“兩病防控”達(dá)到了空前的高度。

疫病防控的首要步驟是“監(jiān)測(cè)”。目前用于牛結(jié)核病的常用檢測(cè)方法主要有皮試法、干擾素-γ體外釋放法以及ELISA抗體檢測(cè)法。這三種方法中，皮試法基于動(dòng)物活體，需對(duì)牛進(jìn)行兩次保定并進(jìn)行皮厚檢測(cè)；干擾素-γ體外釋放法及ELISA抗體檢測(cè)法則基于血液，需要進(jìn)行采血后進(jìn)行檢測(cè)。用于牛布魯菌病的檢測(cè)方法主要有虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)及ELISA抗體檢測(cè)等。三種方法都依賴于血清學(xué)檢測(cè)，需要采血后進(jìn)行檢測(cè)。

無(wú)論是皮試還是采血，“兩病”的常規(guī)檢測(cè)方法均會(huì)對(duì)牛造成較大的應(yīng)激，導(dǎo)致產(chǎn)奶量下降等反應(yīng)，并需要大量的人力投入。在需要一年多次檢疫的高風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)則更是會(huì)導(dǎo)致較大的損失。

大缸奶（bulk tank milk, BTM）是相對(duì)于個(gè)體奶樣而言的，為多頭奶牛的混合奶樣。規(guī)?；膛?chǎng)多采樣自動(dòng)化擠奶設(shè)備將多頭奶牛的原奶通過(guò)管道系統(tǒng)直接混合貯存，樣本也極容易獲得。由于原奶中含有一定比例的免疫球蛋白，且易于獲得，相對(duì)血液而言能大大減少應(yīng)激，且混合奶樣的檢測(cè)，可以獲得與常規(guī)檢測(cè)相同的效果[1]，很多國(guó)家便將疫病監(jiān)測(cè)的對(duì)象瞄準(zhǔn)了大缸奶，通過(guò)監(jiān)測(cè)大缸奶樣中的抗體水平，對(duì)疫病的群體狀況進(jìn)行掌控。雖然該種監(jiān)測(cè)手段在很多國(guó)家已經(jīng)十分成熟，但在我國(guó)除普遍將奶樣檢測(cè)用于乳腺炎診斷外[2]，其他疫病方面卻少有應(yīng)用。

在我國(guó)全面啟動(dòng)兩病凈化的形勢(shì)下，無(wú)論是污染場(chǎng)、控制場(chǎng)或是凈化場(chǎng)，定期進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)都是必不可少的環(huán)節(jié)。大缸奶監(jiān)測(cè)作為一種低應(yīng)激、易跟蹤、有效的檢測(cè)方法，值得大規(guī)模推行。

1 大缸奶樣檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)

對(duì)于奶牛場(chǎng)而言，泌乳奶牛在牛場(chǎng)中所占比例是比較大的。大量的臨床經(jīng)驗(yàn)都已經(jīng)證實(shí)，無(wú)論是進(jìn)行皮試檢測(cè)，還是采血進(jìn)行檢測(cè)，都將對(duì)奶牛造成較大應(yīng)激，造成產(chǎn)奶量的下降及品質(zhì)的降低。通過(guò)檢測(cè)奶樣中的抗體，能夠完全降低對(duì)奶牛的應(yīng)激，不會(huì)有任何的副作用。并且大缸奶樣的檢測(cè)，更是能夠有效降低成本和勞力。對(duì)檢測(cè)結(jié)果而言，能夠獲得與常規(guī)檢測(cè)相同的效果，并對(duì)整群的抗體流行狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并且能夠?yàn)樾掳l(fā)傳染病提供預(yù)警。因此應(yīng)該作為疫病監(jiān)測(cè)的重要手段，值得關(guān)注與應(yīng)用。

2 大缸奶抗體水平具備作為疫病監(jiān)測(cè)的能力

利用奶樣進(jìn)行動(dòng)物疫病的檢測(cè)具有顯而易見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)：應(yīng)激少、樣品易獲得。因此很多國(guó)家都已利用奶樣，甚至大缸奶樣進(jìn)行多種疫病的監(jiān)測(cè)。通常認(rèn)為，奶樣中抗體水平比血樣中的抗體水平要低一個(gè)數(shù)量級(jí)（即約為血清中抗體水平的1/10）。因此奶樣中抗體水平能否反映，或者有多大能力反映血清中的抗體水平一直是國(guó)際上大缸奶抗體研究的重點(diǎn)。

早在1991年，瑞典學(xué)者就已提出大缸奶中的抗體檢測(cè)完全可以作為奶牛場(chǎng)病毒性腹瀉病的監(jiān)測(cè)手段，大缸奶抗體與血樣中抗體有著非常好的相關(guān)性[3]。斯堪的納維亞半島國(guó)家更是利用大缸奶對(duì)牛病毒性腹瀉病進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并配合使用血清學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行確診，成功控制并根除了該病[4]；比利時(shí)、丹麥、葡萄牙國(guó)家也早就將大缸奶及個(gè)體奶樣檢測(cè)作為牛支原體病常規(guī)檢測(cè)及監(jiān)測(cè)的重要手段[5-7]；我國(guó)也有利用大缸奶抗體檢測(cè)牛病毒性腹瀉病流行情況的報(bào)道，結(jié)果顯示77.8%的奶牛群體為陽(yáng)性牛群[8]；愛(ài)爾蘭通過(guò)檢測(cè)奶樣中的抗體水平確定奶牛支原體乳腺炎的流行狀況[9]；丹麥則以一個(gè)非常系統(tǒng)的流行病學(xué)模型證實(shí)了牛奶中的抗體完全能夠作為副結(jié)核病低流行率場(chǎng)的評(píng)估手段，且大缸奶樣監(jiān)測(cè)是最為經(jīng)濟(jì)有效的監(jiān)測(cè)手段[10]；德國(guó)則早在二十世紀(jì)九十年代就官方授權(quán)許可了牛副結(jié)核病的奶樣ELISA抗體檢測(cè)方法，美國(guó)已開(kāi)發(fā)出商業(yè)化檢測(cè)試劑盒[11]。在澳大利亞，用于防控牛支原體的一個(gè)非常重要的生物安全措施就是對(duì)奶樣進(jìn)行PCR或ELISA抗體監(jiān)測(cè)[12]。

有數(shù)據(jù)顯示，血清和奶樣抗體ELISA結(jié)果間有著非常強(qiáng)的相關(guān)性。當(dāng)以血清抗體檢測(cè)作為參考方法進(jìn)行比對(duì)時(shí)，奶樣ELISA檢測(cè)的敏感性為60.9%，特異性高達(dá)94.6%[13]。一項(xiàng)基于奶牛副結(jié)核病檢測(cè)的研究報(bào)告指出，在高陽(yáng)性率群體中（血清學(xué)流行率≥10%），大缸奶樣檢測(cè)的敏感性為85.7%～71.4%。在陰性群體中，大缸奶樣檢測(cè)的特異性為70.5%～53%[14]。施馬倫貝格病毒的血樣及大缸奶樣抗體檢測(cè)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，兩種方法表現(xiàn)為高度相關(guān)（r=0.807，R2= 0.832）[15]，尤其對(duì)抗體低度高的群體，奶樣檢測(cè)具有非常強(qiáng)的預(yù)測(cè)能力。

當(dāng)然，在利用大缸奶進(jìn)行預(yù)測(cè)評(píng)估時(shí)，還必須要考慮到個(gè)體之間的差異。如干奶或育成?？赡芤?yàn)闆](méi)有收集奶樣而缺乏檢測(cè)，新產(chǎn)犢牛的母牛奶中抗體變化又較其他類型奶牛更大等，這些都有可能造成檢測(cè)上的偏差。因此在進(jìn)行群體預(yù)測(cè)后，仍需要對(duì)這部分個(gè)體進(jìn)行個(gè)體水平的評(píng)估。

3 大缸奶樣監(jiān)測(cè)在兩病監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

事實(shí)上牛布魯菌病的檢測(cè)很早就已經(jīng)涉及了奶樣：全乳環(huán)狀試驗(yàn)很早就成為了牛布魯菌病檢測(cè)的經(jīng)典方法[16]。同樣的，全乳環(huán)狀試驗(yàn)同樣可以用在大缸奶的檢測(cè)上，多用作牛布魯菌病的篩檢手段，對(duì)大缸奶檢測(cè)出來(lái)的問(wèn)題牛群再進(jìn)行進(jìn)一步的確診[17]。在抗體檢測(cè)方面，印度已將牛奶抗體檢測(cè)作為牛布魯菌病監(jiān)測(cè)的重要方法，不僅評(píng)估了牛布魯菌病的流行情況，更利用該方法對(duì)其風(fēng)險(xiǎn)因子進(jìn)行了分析[18]。大缸奶用于布魯菌病的監(jiān)測(cè)，是英國(guó)法定控制體系的組成部分[19]，我國(guó)也有利用奶樣檢測(cè)牛布魯菌病的研究[20]。有文獻(xiàn)報(bào)道，奶樣PCR可以檢測(cè)出不少于100個(gè)布魯菌的感染；而奶樣ELISA則可以實(shí)現(xiàn)當(dāng)1份陽(yáng)性奶樣混合在200頭陰性奶樣（大缸奶）中時(shí)，檢測(cè)結(jié)果仍為陽(yáng)性[1]；流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果證實(shí)了奶樣ELISA抗體檢測(cè)與間接ELISA及競(jìng)爭(zhēng)ELISA具有較高的一致性，且大缸奶的檢測(cè)靈敏度較高，與血清檢測(cè)結(jié)果保持一致，符合率分別為98.78%和97.56%[21]。

在牛結(jié)核病檢測(cè)方面，韓國(guó)學(xué)者對(duì)用大缸奶檢測(cè)奶牛結(jié)核病抗體水平進(jìn)行了評(píng)價(jià)。當(dāng)采用MPB70抗原進(jìn)行牛結(jié)核病檢測(cè)時(shí)，血樣與奶樣檢測(cè)結(jié)果間表現(xiàn)出非常顯著的相關(guān)性，R2為0.83。當(dāng)采用皮試法作為參考方法時(shí)，奶樣檢測(cè)及血樣檢測(cè)的敏感性分別為87.8%和81.8%，特異性分別為97.7%和100%。當(dāng)采用大缸奶對(duì)群體進(jìn)行篩檢時(shí)，陽(yáng)性群的檢出率比皮試高出約2倍[17]，表現(xiàn)出了良好的陽(yáng)性群體預(yù)測(cè)能力，且大大節(jié)省了人力及降低了奶牛的應(yīng)激。有學(xué)者對(duì)185個(gè)來(lái)自美國(guó)密西根的無(wú)結(jié)核病牛群和來(lái)自墨西哥的17個(gè)結(jié)核感染牛群的大缸奶樣進(jìn)行了ELISA抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示，所有的陰性牛群的大缸奶檢測(cè)結(jié)果均為陰性，82.4%的感染牛群大缸奶檢測(cè)為陽(yáng)性[22]。除抗體檢測(cè)外，大缸奶檢測(cè)在抗原檢測(cè)也有一定的應(yīng)用。巴西某學(xué)者從個(gè)體奶和大缸奶水平評(píng)價(jià)了結(jié)核分支桿菌復(fù)合群的流行率，結(jié)果顯示，西北地區(qū)大缸奶中陽(yáng)性率為2.15%，個(gè)體陽(yáng)性率為1.91%，南部地區(qū)大缸奶中陽(yáng)性率為1.91%，個(gè)體陽(yáng)性率為1.6%[23]。進(jìn)一步證實(shí)了大缸奶對(duì)奶牛結(jié)核病抗原的診斷價(jià)值。

4 大缸奶檢測(cè)方法的挑戰(zhàn)與應(yīng)用建議

基于大缸奶檢測(cè)的好處是顯而易見(jiàn)的：降低成本、節(jié)約時(shí)間。但是也不可避免的存在一定的問(wèn)題。其中最為關(guān)鍵的應(yīng)該是大缸奶檢測(cè)的敏感性。雖然部分研究顯示大缸奶檢測(cè)有較好的敏感性，但當(dāng)群體中存在少量的陽(yáng)性及大量的陰性個(gè)體時(shí)，大缸奶的混合則導(dǎo)致對(duì)陽(yáng)性奶樣的稀釋而呈現(xiàn)假陰性結(jié)果。如何去對(duì)大缸奶檢出的結(jié)果做出正確的判斷，奶樣與真實(shí)抗體水平究竟有什么樣的推演關(guān)系，是目前學(xué)者們熱烈討論的問(wèn)題，更是進(jìn)行大缸奶檢測(cè)過(guò)程中建模的重點(diǎn)。

由于大缸奶樣的敏感性存在有一定的局限，因此在應(yīng)用時(shí)并不適合作為牛病檢測(cè)的確診，但基于該方法的特異性較高，因此更適合將大缸奶樣檢測(cè)法作為篩選方法或作為預(yù)警，對(duì)其檢測(cè)出來(lái)的陰性樣本，認(rèn)為是潔凈群體，對(duì)陽(yáng)性樣本則通過(guò)血清學(xué)或其他敏感性更高的方法進(jìn)行確診來(lái)降低對(duì)個(gè)體的誤判，減少隨之帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失。

在動(dòng)物疫病不斷更新的形勢(shì)下，早期、準(zhǔn)確的對(duì)動(dòng)物疫病進(jìn)行判斷，同時(shí)減少由多次檢測(cè)帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失是養(yǎng)牛行業(yè)的新的追求。作為一種國(guó)際上成熟的，我們國(guó)家也正在趨向成熟的監(jiān)測(cè)、預(yù)警方法，大缸奶樣檢測(cè)對(duì)兩病的監(jiān)測(cè)必將對(duì)兩病的控制、根除及凈化起到積極的推動(dòng)作用，具有極為廣闊的應(yīng)用前景。