豬源蓋塔病毒的分子生物學研究進展

朱世強，王帥勇，王 娟，姚 云，虞凌雪，單同領，周艷君，童 武，鄭 浩 ，童光志 ，于 海 ,2

（1.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

蓋塔病毒（Getah virus, GETV）屬于披膜病毒科甲病毒屬。GETV分布的地理區(qū)域比較廣泛，從歐亞大陸一直延伸到大洋洲，涉及到的宿主較為廣泛。蓋塔病毒主要感染豬和馬，病毒感染懷孕母豬后，可導致懷孕母豬胎兒死亡和流產等繁殖障礙癥狀，蓋塔病毒已被證實是引起母豬繁殖障礙的病原因子之一[1]。近年來我國多個省份豬場出現蓋塔病毒疫情，并造成一定的經濟損失。

1 蓋塔病毒概況

蓋塔病毒是一種由蚊蟲傳播的病毒，分類學上屬于披膜病毒科甲病毒屬。GETV于1955年在馬來西亞首次從庫蚊中分離出來[2]。隨后GETV先后在日本、澳大利亞、馬來西亞、中國、韓國和東北亞被報道，1964年我國海南省首次從蚊蟲中分離到GETV，隨后GETV在中國廣泛而迅速地傳播，病毒已從河北、海南、四川、甘肅等省和上海市的蚊子和牲畜中分離出來。目前，已有研究報道了GETV感染馬和豬的臨床癥狀，GETV感染馬匹后可引起短暫的發(fā)熱、皮疹和腿部水腫[3-4]；GETV感染豬只后可引起發(fā)熱、厭食癥、抑郁和腹瀉，并可導致胎兒死亡和生殖障礙[4-5]。有研究報道，在鳥類、牛、山羊等其他動物血清中也能檢測到GETV抗體[6-9]。日本科學家證明了感染GETV的豬能夠很快產生病毒血癥，因此豬群在自然界中被認為是GETV的主要放大宿主[10]。

2 蓋塔病毒病原學

2.1 GETV基因組結構 甲病毒的基因組為單鏈RNA，基因組全長約11 400～11 800 nt，蓋塔病毒全基因組長度約為11～12 kb，其中在基因組的79～7482位點編碼病毒非結構蛋白（nsP1、nsP2、nsP3、nsP4），基因組的7527～11 288位點編碼結構蛋白（C、E3、E2、6K、E1）。

蓋塔病毒粒子呈球形，直徑約50～70 nm，有囊膜及纖突。蓋塔病毒基因組是典型的甲病毒屬基因組結構，蓋塔病毒屬于單股正鏈RNA病毒。其基因組RNA 5'端具有甲基化的帽狀結構，3'末端具有ploy(A)的尾巴結構，編碼兩個均勻排列的開放閱讀框（open reading frames, ORFs）。5'端的ORF編碼4個非結構蛋白（nsP1、nsP2、nsP3和nsP4），3'末端的ORF編碼5種結構蛋白，包括C蛋白、E3蛋白、E2蛋白、6K蛋白、E1蛋白[11]。

甲病毒含有一個二十面體的核衣殼，被包裹在一個緊密的包膜中，其糖蛋白成分存在于二十面體晶格中[12]。核衣殼是由病毒的單股正鏈RNA基因組與多個30 kDa的單一衣殼蛋白裝配而成，其二十面體具有對稱性和開孔結構，使得衣殼內的RNA很容易被RNase降解。同時，病毒的核衣殼在受感染細胞的細胞質中組裝成不同的受體，其中衣殼蛋白分子組合與包裝信號結合，更多的衣殼蛋白被招募到結構中，這一反應可能與部分組裝殼層中已經存在的蛋白橫向互作。衣殼蛋白的N端與病毒RNA之間也存在靜電作用。N端的結構域與RNA的靜電結合可能是非特異性的，不需要特定的蛋白質結構，這個區(qū)域的電荷密度非常高，這可能是導致空殼無法組裝的原因，因為組裝可能需要中和這些電荷。相反，與其他衣殼蛋白的橫向相互作用可能是特異性的，并由蛋白保守的C端序列介導衣殼的組裝，具有一定的特異性。

2.2 GETV編碼的結構蛋白及其功能

2.2.1 衣殼蛋白（Cap） 甲病毒結構蛋白是從亞基因組26S mRNA翻譯而來的多聚蛋白。核衣殼蛋白屬于N端的多聚蛋白，具有絲氨酸蛋白酶活性，可以通過順式作用從新生多肽鏈中釋放自身。這種蛋白質被認為是在酶的活性部位與化學鍵發(fā)生折疊并被裂解，因此蛋白質水解非常迅速。當26S mRNA被翻譯后，Cap蛋白隨即產生。最近的研究表明，一種終止衣殼蛋白C端下游2個殘基的結構被正常裂解，從而產生的衣殼蛋白。另外，衣殼蛋白中有一些區(qū)域與RNA特異性結合，新合成的衣殼蛋白與大核糖體亞單位結合，這種結合反應可能在衣殼蛋白進入細胞后被激活[14]。

2.2.2 E3蛋白 E2糖蛋白存在于包膜中，負責受體的附著。成熟的E2是由病毒成熟后期pE2前體蛋白的呋喃蛋白裂解形成，產生E3和E2。大多數甲病毒在病毒粒子中不保留E3。

2.2.3 E2蛋白 E2蛋白是一種長而薄的分子，在穗狀花序頂端有一個高度暴露的葉狀結構，隨后是較窄的莖，莖繞著E1蛋白分子旋轉[15]。E2蛋白的前260個氨基酸構成外域，約100個氨基酸形成莖區(qū)和30個氨基酸組成的跨膜螺旋。E2蛋白的羧基端結構域由33個與NC核相互作用的氨基酸組成[16-17]。其葉狀結構與E1糖蛋白結構域Ⅱ的遠端、E2的莖部與E1的Ⅰ、Ⅲ結構域之間存在著接觸。受體附著位點位于E2殘基附近，與E2殘基相關的碳水化合物位于大而突出的葉狀表面[18]。

圖1 病毒粒子結構和結構蛋白[13]Fig.1 Virion structure and structural proteins[13]

2.2.4 6K蛋白 6K是一種小的多肽，盡管相對于其他結構蛋白翻譯成等摩爾量的量，但仍以少量（730個拷貝）的形式被整合到病毒粒子中[19-20]。在低溫電子顯微鏡病毒粒子結構中，6K的存在和位置尚未確定。病毒粒子中存在的6K蛋白被認為是甲病毒粒子的必要結構成分[21]。在6K區(qū)域引入 的幾個變化，包括減少6K棕櫚?；耐蛔僛19,22]，或編碼該肽序列的缺失[23]，導致感染性病毒的產量大大降低。然而，分離出來的病毒顆粒完全不含6K，并且在結構上與野生型顆粒難以區(qū)分。缺乏6K蛋白的SFV突變體的生長對受感染的宿主細胞有很強的依賴性，哺乳動物細胞在裝配過程中受到的影響要比昆蟲細胞大得多。在合成后不久，6K蛋白與pE2/E1異質二聚體結合，然后被轉運到病毒在質膜組裝的位點[19]。由于在pE2蛋白的C端存在一個信號序列，6K蛋白在ER膜上發(fā)生共翻譯易位，包括一個16-氨基酸腔域和兩個跨膜域，兩個跨膜域由一個短的（8個氨基酸）細胞質環(huán)連接。

2.2.5 E1蛋白 甲病毒E1蛋白將病毒表面蛋白轉化為細胞膜上的離子滲透孔，負責病毒進入時病毒包膜與宿主內體膜融合[24]。這些孔被認為對Na+、K+和Ca2+離子具有滲透性，并允許核內體質子流入細胞質以交換K+離子。這種生理機制可能導致內泌體附近的pH降低，從而導致病毒基因組的局部核心解體和翻譯。E1在內胚體酸化過程中使融合能力增強。酸性環(huán)境導致病毒糖蛋白的重新排列，暴露了先前隱藏在E1中的融合肽。將E1融合肽插入宿主內體膜被認為是一個協(xié)同的過程，產生由5～6個同源三聚體組成的環(huán)[25]。交聯(lián)研究表明，融合后的三聚體由E1-E1相互作用維持，這一結果與發(fā)現一致，即病毒包膜與細胞膜融合后E1-E2異質二聚體解體，產生E2單體和E1同型三聚體[26]。通常隱藏在中性pH下的其他E1區(qū)域（融合肽除外）也暴露在融合活性構象中[27]。位于位置3的組氨酸殘基在膜融合過程中調節(jié)E1的低pH依賴性重折疊[28]。融合環(huán)阻斷細胞融合（G91D）的突變，是由于膜融合后期的一個阻斷，涉及E1同三聚體缺乏有效的形成[29-30]。進入時暴露在低pH值環(huán)境中可能不是蚊子細胞感染過程中的一個強制性步驟。

3 甲病毒復制機制

目前，對于蓋塔病毒研究有限，已知的蓋塔病毒可以在節(jié)肢動物宿主和脊椎動物宿主中復制，在節(jié)肢動物中產生持續(xù)終生的感染，而在脊椎動物中導致急性感染，通常是短期感染。這種情況也反映在細胞培養(yǎng)中，甲病毒在蚊子細胞中產生持續(xù)感染，在這種情況下，細胞存活并繼續(xù)在低水平上產生病毒，但在脊椎動物細胞能夠產生細胞溶解性感染。由于該病毒不能抑制宿主大分子合成，且產生的病毒產物水平較低，因此在蚊子細胞中持續(xù)感染的研究一直較為困難。在感染甲病毒的脊椎動物細胞中，宿主大分子合成受到抑制，病毒產物大量產生，很容易被觀察到。甲病毒在蚊子細胞中的復制對達契霉素等抑制劑敏感[14]，在去核細胞中復制能力降低，這表明感染需要一個功能核[31]。在脊椎動物細胞中，即使有達契霉素等抑制劑存在，也可以獲得正常復制。雖然沒有證據表明在感染過程中需要細胞核，但脊椎動物細胞經長時間的達契霉素等抑制劑處理后產生較低的病毒量，這表明病毒在這些細胞中復制也需要細胞核編碼功能。此外，研究發(fā)現許多病毒基因組的突變對不同細胞系的病毒復制有不同的影響，這表明病毒與宿主蛋白之間存在相互作用[14]。

甲病毒感染脊椎動物細胞的一個標志是能夠在不影響病毒蛋白和核酸合成的情況下關閉宿主轉錄和翻譯。這些功能的關閉導致宿主細胞IFN-α/β產生減少，先天免疫系統(tǒng)減弱。這些功能似乎部分地映射到舊世界病毒中的nsP2和新世界病毒中的CP[32]。宿主細胞翻譯起始因子eIF2α磷酸化可能介導宿主細胞相關蛋白質合成的關閉，dsRNA病毒的宿主蛋白激酶翻譯sRNA，病毒次基因組RNA的翻譯不需要宿主eIF2α[33]。隨著宿主大分子合成的停止，細胞病變效應的發(fā)展也隨之發(fā)生。脊椎動物細胞感染甲病毒通常會誘導凋亡通路[34]。這一途徑已被證明對受感染生物體神經元發(fā)病機制的研究具有重要意義[35]。在一些甲病毒中，細胞的凋亡已經被證明是膜融合的過程，該過程通過病毒包膜蛋白的表達完成，或通過nsP2和RNA復制的表達發(fā)生[36-37]。目前研究又發(fā)現了宿主細胞凋亡能夠促進病毒復制但不誘導細胞凋亡的突變體，通過轉染具有復制但增殖缺陷的病毒RNA，從而消除病毒粒子進入的過程，也能誘導細胞凋亡。因此，有多種機制被認為參與了甲病毒感染誘導細胞凋亡的過程，可能同時涉及宿主和病毒誘導的細胞凋亡。甲病毒與凋亡的研究在近年來的研究中得到了廣泛綜述[37-38]。在感染過程中，甲病毒主要利用宿主生物膜結構，其中內溶酶體膜和溶酶體膜被重新排列成液泡結構。這些被稱為細胞病變液泡，直徑12 μm，被認為是病毒復制復合體[39]。

圖2 病毒復制模式圖[40]Fig.2 Pattern of GETV replication[40]

4 小結

甲病毒在哺乳動物細胞中引起細胞溶解性感染，同時在蚊子細胞中引起非細胞病變的持續(xù)性感染。蚊媒對甲病毒的適應是甲病毒流行株傳播的主要因素。雖然對受感染的哺乳動物細胞進行了甲病毒的廣泛研究，但甲病毒在蚊蟲細胞中的復制和組裝的形態(tài)學和結構學仍然知之甚少。近年來，蓋塔病毒已經成為危害畜牧業(yè)的一個潛在威脅，國內于2018首次報道了湖南省某豬場暴發(fā)蓋塔病毒病疫情，經濟損失嚴重，隨后在山東某豬廠也出現蓋塔病毒疫情，而國內對于蓋塔病毒的研究相對較少[41]。同時相關宿主蛋白在病毒生命周期中的作用以及宿主與病毒蛋白作用還有待探究。因此對宿主因子在宿主抗病毒活動的進入、復制、組裝和調節(jié)方面的功能進行詳細解析，將會有助于更好地了解宿主與蓋塔病毒的相互作用。目前，對甲病毒E2蛋白的研究已經相對成熟，加深了我們對病毒粒子結構的理解，而對剩余非結構蛋白結構的闡明可能會對其活性和相互作用產生新的思路。甲病毒作為一種病毒載體在分子生物學和治療學中的應用也在不斷發(fā)展。含有熒光蛋白與單個非結構蛋白融合的病毒結構已經產生，這可能有助于進一步探索非結構蛋白和復制復合物的功能和定位。甲病毒已經被證明在哺乳動物系統(tǒng)中表達異種蛋白方面是有用的，而甲病毒復制子將繼續(xù)為疫苗和基因治療提供載體。此外，以甲病毒成熟的研究背景為基礎，也將有利于闡明蓋塔病毒的侵襲機制。