貓傳染性腹膜炎診斷研究進展

劉一楠，陳奕熹，汪 剛，毛軍福，彭貴青

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，武漢 430070）

1 貓冠狀病毒概述

貓冠狀病毒（Feline coronavirus, FCoV）是家貓和野貓體內(nèi)普遍存在的病原體，分為通常只會引起貓輕微腹瀉的腸道冠狀病毒（Feline enteric coronavirus, FECV）[1]和致死性的貓傳染性腹膜炎病毒（Feline infectious peritonitis virus, FIPV）[2]。

FCoV屬于冠狀病毒科，與犬冠狀病毒（Canine coronavirus, CCoV）以及豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus, TEGV）同屬于冠狀病毒亞科α冠狀病毒屬，是有包膜的單股正鏈RNA病毒，其基因組約30 kb，有11個開放閱讀框（open reading frame, ORF），分別含有四種結(jié)構(gòu)蛋白：刺突蛋白（spike protein, S）、包膜蛋白（envelope protein, E）、膜蛋白（membrane protein,M）和核衣殼蛋白（nucleoprotein, N），以及七種非結(jié)構(gòu)蛋白：輔助蛋白3a、3b、3c、7a和7b，復(fù)制酶1a和1ab[3-4]。FCoV有Ⅰ、Ⅱ型兩種血清型，根據(jù)其致病性可分為FECV和FIPV，其中Ⅰ型FCoV難以在體外培養(yǎng)，Ⅱ型FCoV較易于在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長。

Ⅰ型FIPV是患病貓中最常見的血清型[5]，但就目前分離到的少數(shù)毒株而言，大部分為Ⅱ型。Ⅰ型FIPV的分離和培養(yǎng)困難給該疾病的研究帶來了阻礙。盡管對貓傳染性腹膜炎發(fā)病機制、傳播規(guī)律和防治進行了數(shù)十年的研究，但是FIP仍然是目前最常見的致命性的貓科疾病之一?？焖俣珳?zhǔn)的診斷對本病的預(yù)防和治療具有重要科學(xué)意義。

本文羅列了目前常見的幾種診斷方法，以期為今后的研究以及臨床診斷提供思路。

2 FIP的診斷

貓傳染性腹膜炎（feline infectious peritonitis,FIP）最常發(fā)生于兩歲以下的幼貓[6]。臨床癥狀為食欲不振，嗜睡，體重減輕，發(fā)熱，眼葡萄膜炎和神經(jīng)癥狀等[7]。FIP分為滲出型和非滲出型兩種，由于滲出型FIP可以檢測的指標(biāo)相對較多，有助于診斷[8]。但是FIP所具有的癥狀并非是該疾病的特異性癥狀，不能僅根據(jù)病史以及臨床癥狀確診，需將這些參數(shù)以及實驗室檢查結(jié)果相結(jié)合進一步做出診斷。

2.1 臨床診斷方法

2.1.1 臨床癥狀檢查 滲出型FIP，又稱濕性腹膜炎，患病貓腹部膨大，觸診有明顯的水樣波動；腹水呈粘性，稻草色，透明至中度渾濁[9]。大部分（69%）貓腹腔積液會伴有胸腔炎性滲出[10]；嗜睡，厭食，呼吸困難，黃疸，眼葡萄膜炎，少數(shù)出現(xiàn)神經(jīng)癥狀。非滲出型FIP：又稱為干性腹膜炎，表現(xiàn)為胸腹腔無滲出液，干性腹膜炎的臨床癥狀無特異性[6]，一般包括體溫升高、體重減輕、反應(yīng)遲鈍、食欲降低等，部分患病貓出現(xiàn)黃疸、眼內(nèi)有損傷等，診斷較為復(fù)雜。FIP引起的臨床癥狀沒有特異性，手術(shù)后繼發(fā)或器官損傷等均可引起胸腹水的產(chǎn)生，而嗜睡，呼吸困難，體溫升高，體重減輕等癥狀也多發(fā)于其他疾病，如貓呼吸系統(tǒng)疾病。因此只根據(jù)FIP的臨床癥狀難以確診。

2.1.2 血常規(guī)檢查與生化檢測 貓感染FIP后常見淋巴細(xì)胞減少、輕度至中度再生性貧血和由高球蛋白引起的高蛋白血癥[11]。當(dāng)患貓出現(xiàn)高蛋白血癥且血液中血清淀粉樣蛋白數(shù)值升高，白細(xì)胞數(shù)上升時，提示體內(nèi)有明顯炎癥。但是引起炎癥的原因和種類較多，僅根據(jù)血常規(guī)和生化檢測也難以診斷貓是否患有傳染性腹膜炎。以下是研究總結(jié)的數(shù)值可以進行輔助診斷。

有研究發(fā)現(xiàn)白蛋白與球蛋白的比值（Albumin:Globulin, A:G）可用于輔助診斷FIP，即當(dāng)這個比值<0.4時患FIP的可能性較大，而>0.8時患FIP的可能性較小[12]。另一個研究團隊在一群健康的貓群中檢測發(fā)現(xiàn)A:G>0.6，他們提出當(dāng)這一數(shù)值>0.6時可排除患有FIP，但這一數(shù)值<0.6卻無法說明患有FIP[13]。因此，筆者認(rèn)為A:G的比值越低提示患有FIP可能性越大。貓較少發(fā)生嚴(yán)重性貧血，在沒有肝酶活性升高或嚴(yán)重貧血的情況下，高膽紅素血癥的存在可增強貓患有FIP的可能性[14]。

APP稱為急性期蛋白，主要由炎癥引起巨噬細(xì)胞或者單核細(xì)胞釋放的一類細(xì)胞因子。α1-酸性糖蛋白（acid glycoprotein, AGP）是APP的一種，對其含量的測定有助于FIP的診斷，因為在FIP病例中常出現(xiàn)AGP水平升高（>1.5 mg/mL）的現(xiàn)象，因此AGP數(shù)值的升高可作為疑患FIP的指標(biāo)[15]。

血常規(guī)和生化檢測是動物醫(yī)院常用的檢測方法。上述所提到的檢測指標(biāo)適用于大部分感染FIPV的貓，指標(biāo)異常與臨床癥狀相結(jié)合對FIP的診斷起指導(dǎo)的作用，但是確診則需要多方面的考量。

2.1.3 影像學(xué)檢查 對患貓X光檢查可見腹部膨大，胸腹腔影像密度增高并呈大面積分布。超聲檢查患貓在膀胱前方與大腸周圍可見大量的無回聲區(qū)，伴隨肝腎指標(biāo)異常[16]?？赏ㄟ^X光和超聲等影像學(xué)檢查得知患貓胸腹腔是否有積液，同時能夠檢測腎臟和肝臟是否存在異常，特別是在貓患干性腹膜炎時，若無其他明顯癥狀，可優(yōu)先使用超聲檢測肝臟、腎臟來幫助進行FIP的診斷。

2.1.4 Rivalta實驗 對濕性腹膜炎而言，檢測腹水的成分能有助于疾病的診斷，腹水的測試比血液更有價值[8]。FIP腹水通常是透明、粘稠、微黃且富含蛋白質(zhì)的液體，總蛋白濃度>35 g/L（>50%球蛋白）。通過Rivalta的實驗陽性結(jié)果可證明腹水為滲出液。將腹水滴加到8 mLddH2O與一滴98%乙酸的混合液中，腹水若在混合液中保持渾濁液滴狀沉入底部則為陽性，若腹水形狀消失并與混合液融合則提示為陰性。雖然陽性結(jié)果無法直接診斷為FIP，但仍可作為一種有效的輔助診斷方法[17]。

2.1.5 腦脊液檢測 非滲出型的FIP患貓更容易出現(xiàn)神經(jīng)癥狀[6]，其腦脊液可以檢測到FIPV[18]，是診斷神經(jīng)型FIP最有效的方法。但腦脊液會因蛋白質(zhì)和炎癥細(xì)胞增多而變得粘稠[19]，使樣品的獲得存在一定難度，且操作不當(dāng)易形成腦疝，所以在進行腦脊液采樣的時候，要操作規(guī)范。對伴有神經(jīng)癥狀的貓進行腦脊液分析時，可見蛋白質(zhì)濃度和白細(xì)胞（主要是嗜中性細(xì)胞和單核細(xì)胞）數(shù)量上升[19-20]。有臨床流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)腦脊液抗體效價大于1∶640時可以確認(rèn)為FIP，但是該結(jié)果的價值有限，因為該研究未設(shè)立陰性對照[21]。一份研究報告通過健康貓與患有FIP的貓做RT-PCR檢測其腦脊液，發(fā)現(xiàn)只有患有FIP（部分出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀）的貓的腦脊液中能檢測到FIPV，而對照貓則無，因此運用RT-PCR的方法檢測腦脊液具有100%的特異性[22]。

總之，腦脊液的檢測對于確診有很大的幫助，其中運用RT-PCR特異性可以達(dá)到100%，腦脊液中檢測到抗體也可以作為很好的確診依據(jù)。

2.1.6 眼部檢查 據(jù)報道，約有29%確診FIP貓的眼球出現(xiàn)以B淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤為主的化膿性肉芽腫、葡萄膜炎和脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎[10,23]。這些通常繼發(fā)于眼部結(jié)構(gòu)的炎癥和血-眼屏障的破壞，由于眼中存在感染FIPV的巨噬細(xì)胞，因此利用免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry, ICC）技術(shù)可以在房水中的巨噬細(xì)胞中檢測到FIPV抗原[24]。但房水穿刺術(shù)主要用于細(xì)胞學(xué)和臨床病理學(xué)檢測，對淋巴瘤的診斷更有意義[25-26]；對于在未感染FIPV的貓中葡萄膜炎診斷也很常見[27]，因此，僅靠眼球檢測不能作為確診依據(jù)。

2.2 實驗室檢測

2.2.1 RT-PCR 患FIP的貓比患FEC的貓更容易向外界排毒[28]。利用RT-PCR的方法，可檢測貓糞便、血液、滲出液和各種組織中的病毒核酸，其中腹腔積液和腦脊液樣品中FCoV的檢測可以幫助FIP的診斷。研究發(fā)現(xiàn)，用RT-PCR的方法檢測腸系膜、腸淋巴結(jié)、肝臟、腎臟、脾臟、大網(wǎng)膜等組織樣品，除淋巴結(jié)外，大多組織的敏感性都很高[29-30]。與血清相比，使用RT-PCR檢測外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）的敏感性更高[31]。

2012年的一項研究中，通過對FECV和FIPV氨基酸序列對比，發(fā)現(xiàn)在S蛋白的兩個氨基酸（M1058L和S1060A）位點出現(xiàn)差異，并證實利用這兩個氨基酸的差異可以在超過95%的病例中將FIPV與FECV區(qū)分開來[32]。類似的，2013年有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)IPV和FECV的S蛋白在弗林蛋白酶切割處有差異[33]。這些為FIP的鑒別診斷提供了新的思路。

有研究學(xué)者想通過S基因來鑒別診斷FIP與FEC，使用FCoV特異性引物對102只貓的組織樣品進行逆轉(zhuǎn)錄酶定量PCR（RT-qPCR），同時對RT-qPCR陽性樣品上的S基因進行測序，結(jié)果顯示這種方法并不能顯著增強檢測的靈敏度和特異性[28]。筆者認(rèn)為通過這種思路來鑒別FECV與FIPV是可行的，但還需要對FIPV的致病機制進行研究，了解FECV轉(zhuǎn)化為FIPV的突變位點。

總之，RT-PCR是實驗室常用的檢測手段，檢出率較高，但是目前大多只能檢出FCoV。在RTPCR結(jié)果為陽性的同時，結(jié)合臨床癥狀及生化指標(biāo)，通常可以判定貓是否患有FIP。

2.2.2 熒光環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫擴增 （reverse transcription loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP）有研究團隊探索這種方法來檢測FCoV的存在，通過瓊脂糖凝膠和羥基萘酚藍(lán)（hydroxynaphthol blue,HNB）染色來判定，結(jié)合RT-PCR以評估靈敏度和特異性。結(jié)果顯示，樣品總體特異性接近100%，但瓊脂糖凝膠和HNB的靈敏度分別為50%和54.5%。因此，RT-LAMP似乎是確認(rèn)病毒存在的很好方法，但不適合用于對陰性樣品的排除[34]。這種方法不需要昂貴的設(shè)備和復(fù)雜的操作，可減少診斷的時間且特異性強（97%），但是該種方法存在靈敏度低（58%），檢測結(jié)果有一定誤差的缺點[35]。

2.2.3 血清抗體檢測 FCoV感染后機體會產(chǎn)生特異性的抗體[36]，實驗性感染最早在7～28 d可檢測到抗體[37-38]，因此抗體檢測可以在疾病的早期進行。但是患有FIP的貓大約有10%沒有血清抗體的產(chǎn)生[39]，在這些貓中，可能是炎癥導(dǎo)致血液成分（包括抗體）外滲，因此，無法通過抗體測定法來判定[40]。最近一項研究表明，F(xiàn)CoV病毒血癥甚至不能說明FIP，因為測試發(fā)現(xiàn)FCoV呈陽性的健康貓在測試的6個月內(nèi)均未出現(xiàn)FIP或臨床疾病[41]，所以從腹水中或者腦脊液中檢測到FIPV病毒會比血清中檢測到病毒更有助于診斷。

FCoV的血清抗體檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）法、間接免疫熒光抗體檢測（immunoinfluscent assay test,IFAT）法和快速免疫遷移試驗[42]。這些檢測方法都是以抗原（例如：FCoV感染的貓細(xì)胞）作為底物，來檢測不同稀釋倍數(shù)的血清。間接免疫熒光是檢測FCoV的金標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)檢測結(jié)果為陰 性時則提示貓不會排毒，而血清檢測結(jié)果呈陽性時，則提示貓已被FCoV感染且產(chǎn)生抗體（感染2～3周后）。Ⅰ、Ⅱ型FCoV和豬傳染性 胃腸炎病毒都可以利用間接免疫熒光的方法進行檢測。值得注意的是，在個別情況下檢測結(jié)果會受到影響，比如并發(fā)感染（FIV與全身性真菌?。?、自身免疫疾病、近期免疫接種和使用治療甲狀腺機能亢進的藥物（甲巰咪唑、他巴唑、甲硫咪唑）等，因此，應(yīng)使用未感染的正常細(xì)胞作為陰性對照，若結(jié)果為陽性且正常、細(xì)胞為陰性，則可證明底物與FCoV結(jié)合[40]。

2.2.4 抗體檢測試劑盒 抗體檢測方法靈敏度高、專一性強，是未來最有可能大量應(yīng)用于市場的檢測方法。有研究團隊對這些檢測方法進行評估，包括IFAT和ELISA。間接免疫熒光抗體測試的靈敏度可達(dá)96%，而ELISA在樣品量較少時是最佳的選擇[42]。目前市場上已有FCoV抗體的檢測試劑盒，但是這些試劑盒還無法精確檢測FIPV，因此還需要進一步研發(fā)針對FIPV檢測的試劑盒。

2.2.5 腹水的免疫檢測實驗 將腹水樣品作為底物來檢測是否存在FIPV抗體的方法所得結(jié)果差異性大，有研究者提出抗體檢測和RNA檢測相結(jié)合可用于濕性腹膜炎的診斷[40,43]。

將腹腔滲出液離心得到的細(xì)胞沉淀用福爾馬林固定，再用石蠟包埋，通過免疫組化（immunohistochemistry, IHC）的方法來進行檢測，盡管處理時間較長，但可以提高FCoV抗原檢測的可靠性，且已有報道用腦脊液離心得到的巨噬細(xì)胞做免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry, ICC）可檢測到FCoV[44]。

腹水的產(chǎn)生作為濕性腹膜炎重要的臨床癥狀，獲得腹水對診斷有很大的幫助，但是FCoV也有可能會存在于沒有患FIP的貓滲出液中[35,45]。所以單獨的腹水病毒檢測并不能作為確診依據(jù)，需要多方面一起考慮。

2.2.6 病理變化 病變組織內(nèi)FCoV抗原的免疫組織化學(xué)染色被認(rèn)為是用于診斷FIP的另一種金標(biāo)準(zhǔn)[10]，對貓活檢常使用兩種方法：Tru-cut活檢（TCB）和細(xì)針穿刺活檢（FNAB）。有研究團隊實驗，將組織樣品固定后切片，通過免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC）或免疫熒光（IF）對組織（通常為積液）樣品進行染色，利用抗體與FCoV抗原的結(jié)合，通過顏色變化（ICC）或產(chǎn)生熒光（IF）來判定結(jié)果，但是，用這些方法檢測結(jié)果顯示靈敏度低[46]，作者對此的解釋是由于細(xì)胞損傷使獲得的樣品不足[47]。此外，在腸系膜淋巴結(jié)樣本中發(fā)現(xiàn)假陽性免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果，導(dǎo)致特異性僅為91%。因此，僅由FNA或TCB獲得的樣品做免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC）無法確診FIP[46-47]。

通過FIP引起的組織病理變化對巨噬細(xì)胞做免疫組化（IHC），敏感性可達(dá)97%～100%[48]。IHC還被用于檢測異常組織或非家養(yǎng)貓科動物巨噬細(xì)胞中的FCoV抗原。例如，在兩只由FIP引起的具有非典型皮膚損傷的貓的皮膚中檢測到FIPV抗原[48]，在獅子的眼組織中檢測到FCoV抗原[49]。

總之，目前最常用、有效的檢測方法是RTPCR，結(jié)果判定為陽性后結(jié)合臨床生化血常規(guī)檢測可以確診是否感染FCoV，特別是用腹水和腦脊液作為樣品所得的陽性結(jié)果可以幫助對FIP的診斷。FCoV突變性高，不同毒株之間基因差異大，因此對RT-PCR引物的設(shè)計要求高。實驗室還可以利用血清學(xué)抗體檢測的方法，這種方法有著方便快捷、特異性強、靈敏度高的優(yōu)點，相信在未來這種方法能夠得到更多的應(yīng)用。

3 診斷路線圖

總結(jié)之前的診斷思路，作出以下的診斷路線圖供獸醫(yī)師參考。

圖1 診斷路線參考圖Fig.1 Diagnostic route reference

4 展望

目前我們無法基于一項診斷方法來確診FIP，需要綜合疑似患有FIP貓的病史、臨床特診和臨床病理指標(biāo)來判斷。根據(jù)實際情況，使用多種測試方法，對每只病貓進行常規(guī)血液學(xué)，血清生化檢查以及滲出液分析，尤其是對病毒的檢測。對于具有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的貓，進行腦脊液分析可以起到幫助確診的作用。

近年來，大部分研究者都把目光聚焦在S蛋白上。S蛋白可以誘導(dǎo)膜融合，對病毒的入侵起到重要作用[50-51]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)IPV和FECV S蛋白的部分氨基酸會出現(xiàn)穩(wěn)定差異[32]，這些差異可以通過測序進行比較，進一步確定是FECV感染還是FIPV感染，為診斷FIP提供了新的思路。筆者認(rèn)為具有特異性的突變位點的發(fā)現(xiàn)將對FIP的診斷提供廣泛的應(yīng)用價值。

FECV的RNA廣泛存在于全身各處，但是患FECV和患FIPV的貓所帶的病毒量有明顯差異[28]，因此定量分析病毒含量可以為鑒別診斷提供幫助。

最近有研究者在貓冠狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp3上發(fā)現(xiàn)有兩種肽對區(qū)分FECV和FIPV有潛在價值[52]。也有研究表明，3c基因的截短能夠引起FECV向FIPV轉(zhuǎn)變，是FECV-FIPV轉(zhuǎn)換的決定性因素[1,4,53-54]。

綜上，本文闡述了目前針對FIP的臨床診斷方法，以及實驗室常用的檢測手段。討論了FIPV與FECV的區(qū)別與轉(zhuǎn)化的觀點，這些為之后尋找FIPV與FECV之間的差異提供思路；本文還討論了FECV與FIPV的差異包括患貓體內(nèi)的病毒量的不同等。研究顯示S蛋白對FECV與FIPV毒力的強弱起到關(guān)鍵作用[55]，所以S蛋白在區(qū)分這兩種病毒上具有潛在研究價值。隨著對貓冠狀病毒研究的不斷深入，我們相信，在不久的將來，F(xiàn)IP的鑒別診斷、預(yù)防及治療能夠更加高效、特異。