活血通降方對反流性食管炎大鼠食管損傷和xCT/VEGF-B/GPX4信號通路的影響

劉琰，唐艷萍，李培彩，劉磊，劉茜，楊磊，郝旭雯

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津 301617；2.天津市南開醫(yī)院，天津 300100

反流性食管炎（reflux esophagitis，RE）是由胃內(nèi)容物反流進(jìn)入食管引起食管黏膜炎癥，造成食管細(xì)胞損傷的一種疾病。鐵死亡是Dixon等[1]發(fā)現(xiàn)的一種不同于細(xì)胞凋亡、自噬、焦亡和壞死的細(xì)胞死亡方式，在分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)等方面與其他細(xì)胞死亡方式有顯著差別。它是由于細(xì)胞內(nèi)鐵離子異常堆積，引起活性氧（ROS）含量升高，激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[2-3]。研究表明，鐵死亡與許多炎癥性疾病密切相關(guān)，如敗血癥、哮喘等[4-5]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，RE食管中存在過量的氧化應(yīng)激代謝產(chǎn)物丙二醛（MDA），其與食管炎癥程度呈正相關(guān)[6]。因此我們推測，RE可能與鐵死亡關(guān)系密切。活血通降方是課題組經(jīng)過長期臨床實踐總結(jié)出的治療RE有效方劑[7-8]。前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，活血通降方能通過激活SCF/c-kit信號通路、抑制p38MAPK/NF-κB信號通路，增加RE大鼠食管動力，緩解食管黏膜炎癥[9-10]。本研究觀察活血通降方能否通過影響鐵死亡相關(guān)通路減輕食管組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，緩解食管炎癥，修復(fù)黏膜損傷，為其治療RE提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級健康雄性Wistar大鼠48只，體質(zhì)量250～280 g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所動物房，溫度25℃、濕度（50±5）%環(huán)境，12 h明暗交替，自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料及飲水。

1.2 藥物及制備

活血通降方（白及30 g，丹參30 g，香附15 g，枳殼15 g，姜半夏10 g，旋覆花30 g），飲片由天津市南開醫(yī)院中草藥房提供，常規(guī)煎煮，制成原藥材濃度為1.47 g/mL混懸液，4℃冰箱保存。

1.3 主要試劑與儀器

蘇木精（批號H8070），北京賽因坦科技有限公司；MDA檢測試劑盒（批號A003-1-2）、谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒（批號A006-1-1）、ROS檢測試劑盒（批號E004-1-1），南京建成生物工程研究所；增強型化學(xué)發(fā)光試劑（批號36208ES60），翌圣生物科技（上海）股份有限公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號BL521A），安徽Biosharp公司；血管內(nèi)皮生長因子B（VEGF-B）抗 體（批 號MAB2595），美 國R&D Systerms公司；胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運體（xCT）抗體（批號26864-1-AP）、谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）抗體（批號67763-1-Ig）、GAPDH抗體（批號10494-1-AP），美國Proteintech公司；白細(xì)胞介素（IL）-1βELISA試劑盒（批號RK00006）、IL-17 ELISA試劑盒（批號RK00039）、IL-10 ELISA試劑盒（批號RK00016），武漢ABclonal生物科技有限公司。RM2126RT型病理切片機、DM4000B型光學(xué)顯微鏡，德國LEICA公司；3500型離心機，日本KUBOTA公司；ST36型酶標(biāo)儀，上?？迫A生物工程股份有限公司；1645050型電泳儀，美國Bio-Rad公司。

2 實驗方法

2.1 造模及分組

隨機取36只大鼠，采用改良部分賁門肌切開術(shù)+外置幽門部分結(jié)扎術(shù)制備RE大鼠模型[11]。大鼠造模前24 h禁食不禁水，將賁門肌切開，取直徑4 mm金屬棒放置于大鼠幽門部外側(cè)，將金屬棒連同幽門一起結(jié)扎，隨后將金屬棒取出，縫合皮膚。7 d后大鼠存活且組織學(xué)具有RE表現(xiàn)[12]為造模成功。將36只大鼠隨機分為模型組和活血通降方低、高劑量組，每組12只。另外12只未造模大鼠為空白組。

2.2 給藥及取材

活血通降方低、高劑量組分別予活血通降方混懸液3.68、7.35 g/（kg·d）灌胃[13]（相當(dāng)于成人臨床等效劑量的1、2倍），空白組和模型組予5 mL生理鹽水灌胃。每日早晚各1次，連續(xù)14 d。

末次給藥后，各組大鼠禁食不禁水24 h，水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈取血。取一部分食管組織進(jìn)行相應(yīng)試劑盒檢測，另一部分進(jìn)行肉眼、病理觀察和Western blot檢測。

2.3 食管黏膜評分

大鼠食管縱行剖開，用生理鹽水反復(fù)沖洗，肉眼觀察食管黏膜變化，根據(jù)黏膜發(fā)紅、糜爛、融合或潰瘍程度，將其分為正常（0分）、輕度（1分）、中度（2分）、重度（3分）[12]。切取1 cm食管下端組織，放入福爾馬林中浸泡固定，石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，并進(jìn)行病理學(xué)評分。根據(jù)食管組織有無鱗狀上皮增生、上皮細(xì)胞層內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤、黏膜固有層乳頭延伸、黏膜糜爛、潰瘍形成和Barrett食管改變將其分為輕度（1分）、中度（2分）、重度（3分）。

2.4 食管組織丙二醛、谷胱甘肽、活性氧含量檢測

取0.1 g食管組織，研磨成勻漿，用預(yù)冷生理鹽水將其稀釋為10%食管組織勻漿液，4℃、3 000 r/min離心15 min（離心半徑20 cm），取上清液，按照試劑盒說明書測定MDA、GSH、ROS含量。

2.5 Western blot檢測

取食管組織50 mg，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解，冰上孵育30 min，4℃、12 000 r/min離心10 min（離心半徑10 cm），取上清液，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。加入上樣緩沖液，95℃加熱10 min變性，取等量蛋白上樣，10%～15%電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入xCT、GPX4、VEGF-B、GAPDH一抗（1∶10 000），4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次5 min，滴加二抗（1∶10 000），室溫孵育1.5 h，TBST洗膜3次，每次5 min，增強型化學(xué)發(fā)光試劑顯影，采用Image J 1.48軟件對條帶進(jìn)行半定量分析。

2.6 ELISA檢測

取大鼠腹主動脈血3～5 mL至抗凝管中，室溫靜置30 min，4℃、3 000 r/min離心20 min（離心半徑20 cm），取上層血清，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)ELISA試劑盒說明書測定血清炎癥因子IL-1β、IL-17、IL-10含量。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以±s表示，滿足正態(tài)分布且方差齊時，組間比較用方差分析，兩兩比較用LSD法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 活血通降方對模型大鼠食管黏膜評分的影響

空白組大鼠食管黏膜完整、光滑，呈淡粉色，無肉眼可見病理改變；模型組大鼠食管黏膜充血明顯，表面粗糙，食管下段可見點片狀紅斑，并見散在針尖樣白色潰瘍，少數(shù)出現(xiàn)“樹皮樣”黏膜增生；活血通降方低劑量組大鼠食管黏膜充血緩解，色澤粉紅，可見少量散在充血點，食管下段黏膜病變較嚴(yán)重；活血通降方高劑量組大鼠食管黏膜較光滑，色澤粉紅，有輕微充血水腫，未見糜爛性潰瘍及增生白斑。見圖1。

圖1 各組大鼠食管黏膜形態(tài)

與空白組比較，模型組大鼠食管黏膜肉眼評分顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，活血通降方低、高劑量組大鼠食管黏膜肉眼評分顯著降低（P＜0.05）?；钛ń捣降汀⒏邉┝拷M間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠食管黏膜肉眼評分比較（±s，分）

表1 各組大鼠食管黏膜肉眼評分比較（±s，分）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

組別空白組模型組活血通降方低劑量組活血通降方高劑量組只數(shù)6 6 6 6肉眼評分0 2.29±0.76**1.14±0.70#0.71±0.76#

HE染色顯示，空白組大鼠食管黏膜可見非角化鱗狀上皮，層次清晰，細(xì)胞排列整齊，未見炎性細(xì)胞浸潤；模型組大鼠食管黏膜鱗狀上皮增生，表層角化過度，基底細(xì)胞大量聚集，上皮層可見大量炎性細(xì)胞浸潤和乳頭延伸；活血通降方低劑量組大鼠食管黏膜表層角化，基底細(xì)胞減少，黏膜固有層輕微水腫，伴淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤，乳頭延伸范圍縮?。换钛ń捣礁邉┝拷M大鼠食管黏膜鱗狀上皮表層角化較少，僅見少量散在炎性細(xì)胞，乳頭延伸范圍進(jìn)一步縮小，細(xì)胞排列較為整齊。見圖2。

圖2 各組大鼠食管黏膜形態(tài)（HE染色，標(biāo)尺=100μm）

與空白組比較，模型組大鼠食管黏膜病理評分顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，活血通降方低、高劑量組大鼠食管黏膜病理評分顯著降低（P＜0.05）?；钛ń捣降汀⒏邉┝拷M間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠食管組織病理評分比較（±s，分）

表2 各組大鼠食管組織病理評分比較（±s，分）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

組別空白組模型組活血通降方低劑量組活血通降方高劑量組只數(shù)6 6 6 6病理評分0 2.14±0.70**1.29±0.76#0.71±0.49#

4.2 活血通降方對模型大鼠食管組織丙二醛、谷胱甘肽、活性氧含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠食管組織MDA、ROS含量顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），GSH含量顯著減少（P＜0.01）；與模型組比較，活血通降方低、高劑量組大鼠食管組織MDA、ROS含量顯著減少（P＜0.05，P＜0.01），活血通降方高劑量組大鼠食管組織GSH含量顯著增加（P＜0.05）；與活血通降方低劑量組比較，活血通降方高劑量組GSH含量顯著增加，ROS含量顯著減少（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠食管組織MDA、GSH、ROS含量比較（±s）

表3 各組大鼠食管組織MDA、GSH、ROS含量比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與活血通降方低劑量組比較，&P＜0.05

組別空白組模型組活血通降方低劑量組活血通降方高劑量組只數(shù)6 6 6 6 MDA/（nmol/mg）2.96±0.40 5.12±0.83*3.73±0.52#3.75±0.56#GSH/（mg/g）3.00±0.40 1.85±0.05**2.11±0.15 2.68±0.19#&ROS/（熒光強度/mg）130.90±7.58 208.30±18.70**174.70±5.24#152.90±8.45##&

4.3 活血通降方對模型大鼠食管組織胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運體、血管內(nèi)皮生長因子B、谷胱甘肽過氧化物酶4蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠食管組織xCT、VEGF-B、GPX4蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，活血通降方低、高劑量組大鼠食管組織xCT、VEGF-B、GPX4蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），活血通降方低、高劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3、表4。

圖3 各組大鼠食管組織xCT、VEGF-B、GPX4蛋白免疫印跡

表4 各組大鼠食管組織xCT、VEGF-B、GPX4蛋白表達(dá)比較（±s）

表4 各組大鼠食管組織xCT、VEGF-B、GPX4蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白組模型組活血通降方低劑量組活血通降方高劑量組只數(shù)6 6 6 6 xCT/GAPDH 0.79±0.07 0.37±0.06**0.59±0.06#0.69±0.05##VEGF-B/GAPDH 0.88±0.02 0.58±0.07**0.75±0.06#0.78±0.08#GPX4/GAPDH 0.89±0.03 0.70±0.02**0.80±0.03#0.81±0.03#

4.4 活血通降方對模型大鼠血清白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素-17、白細(xì)胞介素-10含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清促炎因子IL-1β、IL-17含量顯著增加（P＜0.01），抑炎因子IL-10含量顯著減少（P＜0.01）；與模型組比較，活血通降方低、高劑量組大鼠血清IL-1β、IL-17含量顯著減少（P＜0.05，P＜0.01），IL-10含量顯著增加（P＜0.01）；與活血通降方低劑量組比較，活血通降方高劑量組IL-17含量顯著減少，IL-10含量顯著增加（P＜0.05）。結(jié)果見表5。

表5 各組大鼠血清IL-1β、IL-17、IL-10含量比較（±s，pg/mL）

表5 各組大鼠血清IL-1β、IL-17、IL-10含量比較（±s，pg/mL）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與活血通降方低劑量組比較，&P＜0.05

組別空白組模型組活血通降方低劑量組活血通降方高劑量組只數(shù)12 12 12 12 IL-1β 47.02±4.99 62.19±4.66**51.88±3.36#49.50±1.96#IL-17 1.99±0.30 7.71±0.95**5.50±0.81#2.91±0.19##&IL-10 251.10±14.54 91.27±12.99**190.60±17.09##236.30±12.58##&

5 討論

RE臨床癥狀以反酸和燒心為主，屬中醫(yī)學(xué)“吐酸”“食管癉”“嘈雜”等范疇，是由肝膽疏泄失常，脾胃升降失調(diào)，胃氣上逆所致，肝失疏泄，氣滯血瘀，或疾病日久，氣病及血，因虛致瘀。活血通降方由白及、丹參、香附、姜半夏、枳殼、旋覆花組成。白及質(zhì)黏味澀，有消腫生肌、收斂止血之效，為君藥。臣以丹參，性微寒，祛瘀生新而不傷正。香附辛苦微甘，疏肝解郁、行氣止痛；姜半夏辛溫燥濕、和胃降逆，為止嘔要藥；枳殼味苦，消積化痰、理氣寬胸，主散胸膈痰郁；旋覆花辛開苦降，降氣化痰、降逆止呃。以上四藥共為佐使。全方具有活血生肌、消腫止痛、疏肝理氣、和胃降逆之效，使瘀去病愈。白及具有促進(jìn)傷口愈合及抗炎作用[14]；丹參可抗凝血、抗血小板聚集、抗氧化及抗炎，能有效促進(jìn)黏膜愈合[15]；香附、枳殼為消化系統(tǒng)常用藥，可促進(jìn)平滑肌收縮，增加胃腸動力[16-17]。

脂質(zhì)過氧化與多種免疫反應(yīng)有關(guān)，鐵死亡由脂質(zhì)過氧化介導(dǎo)，因此被認(rèn)為可以調(diào)節(jié)和維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)[18]。大量研究表明，在胃腸道疾病機制中，氧自由基生成和脂質(zhì)過氧化參與組織損傷過程[19-20]。當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激時，機體會產(chǎn)生過多ROS，刺激炎癥小體產(chǎn)生炎癥因子，以調(diào)控炎癥反應(yīng)[21-22]。本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠食管黏膜損傷嚴(yán)重，病理評分升高，ROS水平升高，且血清促炎因子IL-1β、IL-17含量增加，抑炎因子IL-10含量減少。經(jīng)活血通降方灌胃后，食管黏膜損傷修復(fù)，病理評分降低，ROS水平降低，血清IL-1β、IL-17含量減少，IL-10含量增加，且活血通降方高劑量組作用更明顯。提示活血通降方可以清除食管中過多ROS，抑制IL-1β、IL-17分泌，促進(jìn)IL-10分泌，修復(fù)食管黏膜損傷。

鐵死亡是一種由脂質(zhì)過氧化驅(qū)動的非凋亡性細(xì)胞死亡，MDA是氧化應(yīng)激過程中的代謝產(chǎn)物，可以評估機體過氧化損傷程度。各種抗氧化系統(tǒng)在防止脂質(zhì)過氧化介導(dǎo)的鐵死亡中發(fā)揮重要作用，尤其是xCT/GSH/GPX4信號通路[23]。GSH和GPX4具有抗氧化作用，能及時清除細(xì)胞內(nèi)過多ROS，維持細(xì)胞完整和穩(wěn)態(tài)，GSH也是GPX4發(fā)揮抗氧化作用的輔助因子[24]。研究發(fā)現(xiàn)，xCT是鐵死亡的負(fù)調(diào)節(jié)因子，當(dāng)xCT被抑制時，可減少細(xì)胞內(nèi)胱氨酸的攝取，導(dǎo)致GSH合成減少，GSH水平降低可使GPX4失活，進(jìn)而誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化損傷和ROS異常堆積，最終導(dǎo)致鐵死亡[25]。本研究中，模型組大鼠食管組織xCT、GPX4蛋白表達(dá)和GSH水平降低，MDA水平升高，活血通降方低、高劑量組大鼠食管組織xCT、GPX4蛋白表達(dá)和GSH水平升高，MDA水平降低，表明活血通降方可通過上調(diào)食管組織xCT蛋白表達(dá)，使GSH消耗減少，從而維持GPX4抗氧化活性，降低MDA水平，抑制食管細(xì)胞鐵死亡。

VEGF-B是血管內(nèi)皮生長因子家族一員，主要參與調(diào)控脂代謝、神經(jīng)營養(yǎng)及神經(jīng)保護(hù)等多個生物學(xué)過程[26]。在脂代謝方面，VEGF-B是一種有效的內(nèi)源性抗氧化劑，可以清除細(xì)胞內(nèi)過多ROS，抑制細(xì)胞鐵死亡[27-28]。VEGF-B能上調(diào)多個抗氧化基因，特別是GPX家族，從而形成抗氧化防御機制。研究顯示，當(dāng)GPX活性喪失時，VEGF-B對機體內(nèi)外的保護(hù)作用也隨之降低[29]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠食管組織VEGF-B、GPX4表達(dá)降低，活血通降方低、高劑量組大鼠食管組織VEGF-B、GPX4表達(dá)升高，表明活血通降方可能通過激活VEGF-B/GPX4信號通路，提高細(xì)胞抗氧化能力，清除食管中過多ROS，從而抑制細(xì)胞鐵死亡。

綜上，活血通降方可能通過激活xCT/VEGF-B/GPX4信號通路調(diào)節(jié)食管細(xì)胞鐵死亡，減輕脂質(zhì)過氧化程度，調(diào)控相關(guān)炎癥因子水平，從而緩解大鼠食管黏膜炎癥，達(dá)到治療RE目的。