腎透明細胞癌組織中PGC-1α表達及與患者預后的相關性

尤校雷，劉 煒，南力賓，黃少鵬

(邯鄲市中心醫(yī)院泌尿外科，河北邯鄲 056001)

腎透明細胞癌是泌尿外科常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤第2位[1]。據(jù)報道，在中國腎透明細胞癌每年新增病例可達30.4萬，死亡病例可達3.1萬[2]。腎透明細胞癌的發(fā)生是一個緩慢的過程，涉及多種基因表達及多種信號通路，但具體發(fā)生的分子遺傳機制尚不清楚[3]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)是PGC-1家族的第一個成員，它最初被鑒定為一個能與核受體過氧化物酶體增殖物激活受體γ共同作用的含798個氨基酸的蛋白[4]。PGC-1α是線粒體生物合成的關鍵調(diào)控因子，其在多種代謝性疾病中扮演著重要的角色，是氧化代謝和合成代謝的關鍵節(jié)點，參與了腫瘤代謝的調(diào)節(jié)，可以從氧化代謝和合成代謝2個方面調(diào)控腫瘤細胞的存活、增殖和遷移[5]。但PGC-1α的表達是否可參與腎透明細胞癌發(fā)病及患者預后尚不明確。因此，本文通過檢測腎透明細胞癌組織中PGC-1α的表達水平，并分析其與預后的關系，以期為臨床上評估腎透明細胞癌患者預后奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料連續(xù)性選取2014年2月—2016年12月于邯鄲市中心醫(yī)院泌尿外科接受手術治療的90例腎透明細胞癌患者，取其腎透明細胞癌組織和癌旁正常腎組織。手術標本切除后立即凍入液氮中，再置于-80 ℃冰箱中保存?；颊咧心行?9例，女性31例；年齡38～75(56.16±9.37)歲，<56歲54例，≥56歲36例；腫瘤直徑<5 cm 48例，≥5 cm 42例；有淋巴結轉(zhuǎn)移43例，無淋巴結轉(zhuǎn)移47例；TNM分期[6]：Ⅰ期27例、Ⅱ期19例、Ⅲ期30例、Ⅳ期14例；Fuhrman分級[6]：Ⅰ～Ⅱ級50例、Ⅲ～Ⅳ級40例。納入標準：①符合《中國腎癌診治指南2013版》[6]中的腎透明細胞癌診斷標準，術后癌組織經(jīng)病理檢查證實為腎透明細胞癌組織；②均接受根治性腎切除術，術前未接受放、化療及其他治療；③患者臨床資料完整。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②有嚴重感染者；③肝、腎功能嚴重異常者。本研究通過邯鄲市中心醫(yī)院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1實時熒光定量PCR(realtimefluorescencequantitativePCR，qRT-PCR)法檢測腎透明細胞癌組織和癌旁正常腎組織中PGC-1α信使RNA(messengerRNA，mRNA)的表達水平 參照Trizol試劑(浙江聯(lián)碩生物科技有限公司，批號960189)說明書提取腎透明細胞癌組織和癌旁正常腎組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(廣州東盛生物科技有限公司，批號SJ-50791H)合成cDNA，然后采用qRT-PCR試劑盒(SYBR Green qPCR Mix，浙江聯(lián)碩生物科技有限公司，批號50172)進行反應。PCR反應體系共20 μL：SYBR Green qPCR Mix 10 μL，cDNA 1 μL，正、反向引物各1 μL，去離子水7 μL。PGC-1α以GAPDH為內(nèi)參，引物均由天津鼎賽生物基因科技有限公司合成，引物序列見表1。擴增條件：95 ℃，2 min；95 ℃，20 s、60 ℃，20 s、72 ℃，40 s，循環(huán)40次。PGC-1α mRNA的表達水平以2-ΔΔCt法計算。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.2免疫組織化學法檢測腎透明細胞癌組織和癌旁正常腎組織中PGC-1α蛋白的表達水平 制作腎透明細胞癌組織和癌旁正常腎組織石蠟切片，脫蠟，再修復抗原，然后用體積分數(shù)為3%的H2O2浸泡10 min，阻斷切片中H2O2酶活性，加入兔抗人PGC-1α單克隆抗體，室溫下孵育1 h，再置于4 ℃過夜，然后用磷酸鹽緩沖液清洗1次，然后加入二抗孵育20 min，最后用蘇木素復染，脫水、封片，顯微鏡觀察。結果判定[7]：隨機選取5個視野(×400)，由2位專業(yè)人員完成評定。染色強度：無(0分)、淺黃色(1分)、棕黃色(2分)、棕褐色(3分)；陽性細胞占比：<5%(0分)、5%～25%(1分)、26～50%(2分)、51%～75%(3分)、>75%(4分)。以染色強度評分×陽性細胞占比評分值作為判斷PGC-1α蛋白陽性的依據(jù)，兩者乘積≤2分為陰性，>2分為陽性。

1.3 預后指標及隨訪方法所有患者均于手術后采用電話或患者入院復查等方式進行5年隨訪，隨訪起始日期為術后第1天，隨訪終止日期為5年隨訪期滿或者隨訪期內(nèi)患者死亡時。記錄隨訪5年內(nèi)腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移及患者死亡情況，統(tǒng)計無進展生存率和總生存率。無進展生存期：腎透明細胞癌患者術后第1天至隨訪到腫瘤進展(復發(fā)或轉(zhuǎn)移)、因任何原因死亡或隨訪期滿的時間；總生存期：腎透明細胞癌患者術后第1天至因任何原因死亡或隨訪期滿的時間。

2 結 果

2.1 腎透明細胞癌組織和癌旁正常腎組織中PGC-1α mRNA和蛋白表達水平比較PGC-1α蛋白陽性主要表達于細胞核，呈棕黃色或棕褐色(圖1)。與癌旁正常腎組織比較，腎透明細胞癌組織中PGC-1α mRNA表達水平和PGC-1α蛋白陽性表達率較低(P<0.05，表2)。

2.2 腎透明細胞癌組織中PGC-1α蛋白表達與患者臨床病理特征的關系PGC-1α蛋白表達均與淋巴結轉(zhuǎn)移、TNM分期、Fuhrman分級相關(P<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤直徑無關(P>0.05，表3)。

A：腎透明細胞癌；B：癌旁正常腎組織。圖1 腎透明細胞癌及癌旁正常腎組織中PGC-1α蛋白表達(免疫組織化學染色，×400)

表2 腎透明細胞癌組織和癌旁正常腎組織中PGC-1α mRNA和蛋白表達水平的比較

表3 腎透明細胞癌組織中PGC-1α蛋白表達與患者臨床病理特征的關系 [例(%)]

2.3 腎透明細胞癌組織中PGC-1α蛋白表達與患者預后的關系90例腎透明細胞癌患者經(jīng)過5年隨訪，無進展生存39例，總生存57例，死亡33例(因其他原因死亡4例，因腫瘤進展死亡29例)；隨訪期間復發(fā)21例，轉(zhuǎn)移26例，其中41例患者行術后輔助治療(35例行靶向治療)，局部復發(fā)灶切除術12例。PGC-1α蛋白陰性患者5年無進展生存率為36.11%(26/72)低于PGC-1α蛋白陽性患者72.22%(13/18)(χ2=7.217，P=0.007，圖2A)；PGC-1α蛋白陰性患者5年總生存率為56.94%(41/72)低于PGC-1α蛋白陽性患者88.89%(16/18)(χ2=5.278，P=0.022，圖2B)。

A：5年內(nèi)無進展生存率；B：5年內(nèi)總生存率。圖2 腎透明細胞癌組織中PGC-1α蛋白表達與患者預后的關系

2.4 影響腎透明細胞癌患者預后的危險因素分析logistic單因素分析顯示，淋巴結轉(zhuǎn)移、TNM分期、Fuhrman分級、PGC-1α蛋白均是影響腎透明細胞癌患者預后不良的危險因素(P<0.05，表4)；logistic多因素分析顯示，TNM Ⅲ～Ⅳ期、Fuhrman Ⅲ～Ⅳ級、PGC-1α蛋白陰性是影響腎透明細胞癌患者預后不良的獨立危險因素(P<0.05，表5)。

表4 影響腎透明細胞癌患者預后的單因素分析

表5 影響腎透明細胞癌患者預后的多因素分析

3 討 論

腎細胞癌約占原發(fā)腎腫瘤的85%，而腎透明細胞癌約占腎細胞癌的67.4%～83.2%，臨床上癥狀少，發(fā)現(xiàn)時多為中晚期，其惡性程度較高，且轉(zhuǎn)移早、預后較差，其發(fā)生、發(fā)展是一個涉及多過程、多基因、多原因累加的繁瑣過程[8]。

PGC-1α是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，其充當轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，但沒有DNA結合結構域；PGC-1α可與識別其靶基因中特定序列的各種轉(zhuǎn)錄因子和核受體結合，雖然其他轉(zhuǎn)錄共激活因子具有促進染色質(zhì)重塑和基因轉(zhuǎn)錄的內(nèi)在組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，但缺乏酶活性；因此，PGC-1α通過充當其他具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性蛋白質(zhì)的錨平臺，并通過促進轉(zhuǎn)錄機制的組裝以觸發(fā)基因轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮其對基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)功能[9-10]。PGC-1α主要存在于高能量需求且富含線粒體的組織中，如心臟、骨骼肌、褐色脂肪組織、腦、肝、腎等，其他組織則表達較少或幾乎無表達[11-12]。在氧化代謝活躍的器官和組織中PGC-1α的表達量比較高，說明PGC-1α與機體的能量代謝有著密不可分的聯(lián)系[13-14]。CHANG等[15]研究顯示，PGC-1α在肝細胞癌中發(fā)揮抑癌基因的作用。YIN等[16]研究顯示，PGC-1α在胰腺癌細胞中呈低表達，抑制PGC-1α水平可抑制胰腺癌細胞增殖，誘導其凋亡。本研究結果顯示，腎透明細胞癌組織中PGC-1α mRNA表達水平和PGC-1α蛋白陽性表達率低于癌旁正常腎組織，與上述研究結果[15-16]相似，提示PGC-1α異常低表達可能與腎透明細胞癌的發(fā)病有關。進一步研究發(fā)現(xiàn)，PGC-1α蛋白表達與淋巴結轉(zhuǎn)移、TNM分期、Fuhrman分級相關，表明PGC-1α可能影響腎透明細胞癌的發(fā)展。

PGC-1α是氧化代謝的主要調(diào)節(jié)劑，癌癥治療(如放射和化學療法)已被證明會在腫瘤中誘導氧化應激，而氧自由基的產(chǎn)生可以通過涉及抗氧化酶的機制誘導細胞死亡或?qū)χ委煹牡挚?，因此PGC-1α的調(diào)節(jié)可能會干擾對治療的反應[17]。PAKU等[18]研究報道，sirtuins家族去乙?；?可通過調(diào)控超氧化物歧化酶2和PGC-1α影響結直腸癌細胞的化療耐藥，是結直腸癌患者的獨立預后因素。另有研究顯示，結直腸癌組織中PGC-1α mRNA低表達，PGC-1α mRNA高表達患者具有更高的3年生存率[19]。本研究顯示，PGC-1α蛋白陰性患者5年無進展生存率及總生存率均低于PGC-1α蛋白陽性患者，與王婷婷等[19]研究類似；同時研究發(fā)現(xiàn)，TNM Ⅲ～Ⅳ期、Fuhrman Ⅲ～Ⅳ級、PGC-1α蛋白陰性是影響腎透明細胞癌患者預后不良的獨立危險因素，表明PGC-1α在腎透明細胞癌進程中發(fā)揮作用，可作為腎透明細胞癌患者預后不良的一個參考指標，臨床在關注腎透明細胞癌TNM分期及Fuhrman分級的同時，還需關注PGC-1α異常表達對患者預后的影響。

綜上所述，腎透明細胞癌組織中PGC-1α呈低表達，與腫瘤的淋巴結轉(zhuǎn)移、TNM分期、Fuhrman分級以及患者預后密切相關。但本研究尚未深入探討PGC-1α與腎透明細胞癌預后不良病理機制的關系，仍需進一步研究。