繡球菌水提物的免疫促進(jìn)作用

呂國(guó)英，王富根，李云濤，張作法*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，浙江 杭州 310021； 2.杭州千島秀菇生物科技有限公司，浙江 淳安 311701；3.常山豪鋒農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司，浙江 常山 324200)

繡球菌隸屬于擔(dān)子菌門(mén)、傘菌綱、多孔菌目、繡球菌科，是一種珍稀的特色食藥用菌。繡球菌口感脆嫩清香，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，被稱(chēng)為“萬(wàn)菇之王”。繡球菌富含β-葡聚糖，據(jù)報(bào)道，繡球菌中葡聚糖含量達(dá)到47.7%[1]。另外氨基酸種類(lèi)齊全，其中以谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸含量較高。另外，繡球菌中含有豐富的維生素，其中VB3和VE含量居菌藻類(lèi)食物前列[2]。

豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)賦予了繡球菌卓越的藥理活性，據(jù)報(bào)道繡球菌在抗腫瘤[3]、降血糖[4]、保護(hù)神經(jīng)[5]、保護(hù)腸胃[6]及美容[7]方面具有很好的藥理作用。目前，繡球菌在我國(guó)主要作為食材，相關(guān)功能產(chǎn)品的種類(lèi)很少，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究繡球菌提取物的免疫促進(jìn)作用，為其深加工產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

繡球菌水提物，由杭州千島湖頗益農(nóng)產(chǎn)品專(zhuān)業(yè)合作社聯(lián)合社提供；臨用前以飲用水配成相應(yīng)濃度(7.5、15和30 mg·mL-1)，按20 mL·kg-1灌胃給藥。人參水煎液的制備：生曬參(華東醫(yī)藥股份有限公司)，粉碎后加10倍量水，浸泡30 min，煎煮提取1 h，濾過(guò)，濾渣加8倍量水，煎煮提取0.5 h，濾過(guò)，濾渣加6倍量水，煎煮提取0.5 h，濾過(guò)，合并濾液，水浴濃縮至生藥含量為0.1 g·mL-1的人參水煎液，4～8 ℃冷藏保存，作為免疫試驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照用藥。

環(huán)磷酰胺針(安道生)，規(guī)格為每支0.2 g(批號(hào)7F174A，德國(guó)Baxter Oncology GmbH)，臨用時(shí)用生理鹽水稀釋。噻唑藍(lán)(MTT，ST316)購(gòu)自碧云天；刀豆蛋白ConA購(gòu)自Solarbio公司(C8110)；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司(8117008)；胎牛血清購(gòu)自四季青；紅細(xì)胞裂解液為自配(配方：NH4Cl 0.373 5 g，Tris 0.13 g，溶于50 mL雙蒸水，0.22 μm過(guò)濾除菌后使用)。

1.2 動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境

ICR雄性小鼠，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(浙)2014-0001。飼養(yǎng)于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物房(清潔級(jí))，溫度18～24 ℃，相對(duì)濕度60%～80%，全價(jià)顆粒飼料來(lái)源于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 方法

1.3.1 對(duì)非特異性免疫功能方面的影響

雄性ICR小鼠60只，體重18～22 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為正常對(duì)照、模型對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照組(人參水提液2.0 g·kg-1)、繡球菌水提物3個(gè)劑量組(150、300和600 mg·kg-1)，每組10只，分別灌胃給予相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)15 d，給藥容積均為20 mL·kg-1體重，對(duì)照組給予等容積蒸餾水，給藥第11 d除正常對(duì)照組外均皮下按0.01 mL·g-1劑量注射環(huán)磷酰胺50 mg·kg-1，每天1次，連續(xù)4 d，末次給藥后1 h尾靜脈按0.01 mL·g-1劑量注射1∶4稀釋的墨汁，注射2 min和10 min后于小鼠左右眶后靜脈取血20 μL，置于預(yù)先盛有2 mL 0.1% Na2CO3溶液的試管中混勻，取0.1 mL于96孔板在600 nm處測(cè)定吸光度(OD)；同時(shí)取小鼠胸腺、脾臟、肝臟稱(chēng)重，以每1 g小鼠的脾重和胸腺重作為脾指數(shù)和胸腺指數(shù)，并計(jì)算K值和吞噬指數(shù)。

1.3.2 對(duì)細(xì)胞免疫功能的影響

取雄性ICR小鼠5只，體重18～22 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，脫頸椎處死，75%乙醇滅菌后無(wú)菌解剖，取脾臟裝于含PBS的培養(yǎng)皿中，以5 mL注射塞碾磨后混勻，200目滅菌雙層尼龍篩過(guò)濾。合并濾液，1 500 r·min-1離心5 min，棄上清，彈勻后加少量破紅裂解液，以PBS中和破紅，1 500 r·min-1離心5 min后棄上清，以含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液輕輕吹打重懸沉淀，采用流式進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。用于增殖實(shí)驗(yàn)測(cè)定。

增殖實(shí)驗(yàn)：調(diào)整小鼠脾細(xì)胞為1×107個(gè)·mL-1，每孔100 μL種板于96孔中。設(shè)立空白組、正常對(duì)照組、ConA組、繡球菌水提物各劑量組、繡球菌水提物各劑量聯(lián)合ConA組，每孔加入藥物100 μL，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h后，每孔加入MTT(5 mg·mL-1)20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h。2 000 r·min-1離心5 min，以移液槍小心吸去上清，每孔加入150 μL DMSO，37 ℃孵育20 min，490 nm測(cè)定OD值，計(jì)算增殖指數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

所有計(jì)量數(shù)據(jù)均表示為X±SD，采用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)非特異性免疫功能方面的影響

與正常組相比，環(huán)磷酰胺注射后小鼠體重下降，其中模型組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。與模型組相比，各給藥組和陽(yáng)性組吞噬指數(shù)升高，其中繡球菌水提物300和600 mg·kg-1處理組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 繡球菌水提物對(duì)小鼠碳廓清試驗(yàn)的影響

與正常組相比，模型組肝臟系數(shù)有增加，各組均無(wú)顯著差異，但各組脾臟和胸腺系數(shù)極顯著下降

(表2)。與模型組相比，繡球菌水提物300和600 mg·kg-1處理組和陽(yáng)性組胸腺系數(shù)呈增加趨勢(shì)，其中陽(yáng)性組與模型組有顯著差異。與模型組相比，繡球菌水提物各處理組和陽(yáng)性組脾臟指數(shù)升高，其中繡球菌水提物300 mg·kg-1處理組和陽(yáng)性組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明繡球菌水提物能夠促進(jìn)胸腺和脾細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能。

表2 繡球菌水提物對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響

2.2 對(duì)細(xì)胞免疫功能的影響

如表3所示，單獨(dú)給藥時(shí)，繡球菌水提物0.4和0.8 mg·mL-1具有促淋巴細(xì)胞增殖趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，當(dāng)濃度達(dá)到1.6和3.2 mg·mL-1時(shí)呈現(xiàn)抑制淋巴細(xì)胞增殖趨勢(shì)，尤其濃度為3.2 mg·mL-1時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。ConA(5 μg·mL-1)單獨(dú)處理組對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖有一定的促進(jìn)作用，與正常組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。聯(lián)合給藥時(shí)，繡球菌水提物各劑量組刺激脾淋巴細(xì)胞增殖程度均較單獨(dú)給藥時(shí)有顯著升高，尤其在0.4和0.8 mg·mL-1劑量下與ConA有協(xié)同促進(jìn)作用，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，當(dāng)濃度升高到1.6 mg·mL-1時(shí)，較ConA(5 μg·mL-1)單獨(dú)處理組無(wú)明顯差異，當(dāng)濃度達(dá)3.2 mg·mL-1時(shí)，呈現(xiàn)抑制淋巴細(xì)胞增殖作用。本試驗(yàn)條件下，繡球菌水提物具有一定的免疫功能促進(jìn)作用。

表3 繡球菌水提物對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞體外增殖活性的影響

3 討論

目前已經(jīng)有多個(gè)關(guān)于繡球菌多糖在提高免疫力方面的報(bào)道，謝添等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，繡球菌多糖能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞RAW264.7的增殖，具有潛在的免疫調(diào)節(jié)作用，這可能與其通過(guò)細(xì)胞表面受體TLR4激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，增強(qiáng)下游細(xì)胞因子的釋放來(lái)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的免疫功能有關(guān)[9]。郝晨陽(yáng)等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，繡球菌多糖對(duì)免疫低下小鼠腸道免疫功能具有很好的調(diào)節(jié)作用。張迪等[11]也報(bào)道了繡球菌多糖具有促進(jìn)大鼠脾淋巴細(xì)胞體外增殖的免疫活性。因此，在本研究中繡球菌水提物對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠免疫下降具有保護(hù)作用，可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，同時(shí)對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖有一定的促進(jìn)作用，這些免疫促進(jìn)活性可能與水提物中的多糖有關(guān)。