川崎病表觀遺傳學(xué)研究進(jìn)展

王琛玥，焦富勇，馮建英

(陜西省川崎病診療中心 陜西省人民醫(yī)院兒童病院 西安交通大學(xué)第三附屬醫(yī)院兒科，陜西 西安 710068)

川崎病(Kawasaki disease，KD)，又被稱為皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征，是由日本醫(yī)生川崎富作(Dr.Tomisaku Kawasaki)于1967年首次報道，主要的臨床表現(xiàn)為超過5天的持續(xù)性發(fā)熱、黏膜改變、皮疹、頸部淋巴結(jié)非化膿性腫大、雙側(cè)球結(jié)膜充血、手足硬性水腫及指趾末端脫皮等[1]。KD主要發(fā)生在5歲以下兒童，且具有較明顯的性別及地域差異，男性多于女性，亞裔兒童發(fā)病率高于歐洲和北美國家[1]。日本針對全國川崎病進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示2015—2016年5歲以下兒童川崎病的發(fā)病率為(309.0～330.2)/10萬[2]；韓國調(diào)查結(jié)果顯示，2014年5歲以下兒童川崎病的發(fā)病率為194.7/10萬[3]。我國尚未發(fā)現(xiàn)較新的、全國范圍內(nèi)的發(fā)病率數(shù)據(jù)，北京市調(diào)查結(jié)果顯示2000—2004年5歲以下兒童川崎病的發(fā)病率為(40.9～55.1)/10萬，上海市2008—2012年5歲以下兒童川崎病的發(fā)病率為(30.3～71.9)/10萬[4]。KD主要的病理改變是非特異性血管炎，累及全身中小血管，尤以冠狀動脈為主。KD目前的標(biāo)準(zhǔn)治療方案為丙種球蛋白聯(lián)合阿司匹林，雖然可以降低冠狀動脈瘤的發(fā)生率，但仍存在冠狀動脈損傷(coronary arteries abnormalities，CAAs)[5]。

近年來，國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)，KD發(fā)病與外源性感染、遺傳易感性及免疫反應(yīng)顯著相關(guān)。流行病學(xué)和臨床報告表明，KD可由鏈球菌、金黃色葡萄球菌、支原體、衣原體、麻疹病毒、博卡病毒、鼻病毒、輪狀病毒、腺病毒、細(xì)小病毒B19、真菌等誘發(fā)[6]。KD的易感性與遺傳因素密切相關(guān)。表觀遺傳學(xué)(epigenetics)在基因遺傳、環(huán)境因素相互影響疾病中的作用已被廣泛探索[7]。Waddington于1942年首先提出表觀遺傳學(xué)的概念，它是研究基因型如何產(chǎn)生表型的過程，是在不改變基因序列的前提下，通過DNA和組蛋白化學(xué)修飾、RNA干擾、染色質(zhì)重塑等多種機制影響和調(diào)節(jié)基因的功能及相關(guān)特性，決定基因的表達(dá)方式，并可以通過細(xì)胞分裂和增殖周期進(jìn)行遺傳[8]。目前國內(nèi)外針對表觀遺傳學(xué)的研究主要集中在基因表達(dá)變化的調(diào)控機制方面。有學(xué)者表明，表觀遺傳調(diào)控及功能障礙在生理疾病中的重要性日益增加，其在風(fēng)濕免疫疾病、腫瘤、心血管病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中作用顯著[9-12]。近年來，有學(xué)者對參與KD發(fā)病機制的基因表觀遺傳調(diào)控進(jìn)行了相關(guān)研究，表觀遺傳修飾可以通過幾種方式發(fā)生，包括胞嘧啶的共價修飾(如DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的甲基化)、組蛋白的轉(zhuǎn)錄后修飾(如乙?；?、磷酸化、甲基化、瓜氨酸化、泛素化、核糖化和亞基化)及基于RNA的轉(zhuǎn)錄機制的調(diào)節(jié)[13]。本文重點闡述KD相關(guān)的表觀遺傳學(xué)研究，進(jìn)而為KD的發(fā)病機制、早期識別、生物標(biāo)志物、新型治療等方面提供新的思路。

1 DNA甲基化

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分，是最早發(fā)現(xiàn)的、目前最典型的表觀遺傳學(xué)修飾，其在維持細(xì)胞生理結(jié)構(gòu)功能、遺傳因子和相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，是KD中研究最廣泛的表觀遺傳學(xué)修飾。DNA甲基化是由一組DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMTs)和其他輔助蛋白來調(diào)控，是在DNMTs的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸(sadenosylmethionine，SAM)作為甲基供體，與胞嘧啶的C5位結(jié)合形成5-甲基胞嘧啶(5-methylCytosine，5mC)的化學(xué)修飾過程[13]。這種修飾反應(yīng)主要發(fā)生在胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸(Cytidine-phosphatte-Guanonine oligodeoxynucleotides，CpG)位點上。管家基因的啟動子、部分外顯子及內(nèi)含子富含CpG的區(qū)域，被稱為CpG島。在全基因組中，CpG島通常位于基因的啟動子區(qū)域[14]。甲基與基因組的CpG島的共價結(jié)合可以在不改變基因序列基礎(chǔ)上調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，從而影響蛋白質(zhì)的表達(dá)。DNMTs家族系包括DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L、DNMT3L-AS1，DNMT1不僅能維持DNA甲基化水平，而且對T淋巴細(xì)胞分化的表達(dá)起重要作用，DNMT3A和DNMT3B主要功能為起始甲基化[15]，其表觀遺傳學(xué)的改變在免疫性疾病發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。在人類基因組中，甲基化的基因通常與轉(zhuǎn)錄活躍的基因相關(guān)，啟動子區(qū)域中CpG島的超甲基化可通過募集轉(zhuǎn)錄阻遏物或掩蓋轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)合而導(dǎo)致長期穩(wěn)定的基因抑制[16]。在全基因組或單個基因水平方面，DNA甲基化的動態(tài)變化對于正常發(fā)育和疾病中的細(xì)胞分化作用至關(guān)重要。

Huang等[17]對KD的基因組DNA甲基化和基因表達(dá)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)KD患者的DNMT1和DNMT3A的表達(dá)水平明顯低于正常對照組，短暫的DNA甲基化過程發(fā)生在KD的急性階段。Li等[18]對KD患者免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin，IVIg)給藥前后DNA甲基化的變化進(jìn)行了研究，證明用IVIg治療主要通過減少甲基化CpG標(biāo)記物來改變DNA甲基化，抑制免疫炎癥反應(yīng)。Chen等[19]發(fā)現(xiàn)KD患者與正常對照組二者的CpG區(qū)域甲基化具有明顯差異，不同的甲基化區(qū)域包含了參與炎癥反應(yīng)、先天免疫和趨化因子信號途徑的基因。在基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)、toll-樣受體(toll-like receptors，TLRs)、NOD樣受體(NOD-likereceptors,NLRs)、IgG的Fc組分低親和性IIa受體(Fc fragment of IgG,low affinity IIa receptor，F(xiàn)CGR2A)等基因中可以觀察到KD相關(guān)的表觀遺傳改變，為KD的病理生理學(xué)提供了新的依據(jù)。

TLRs不僅能激活人體天然免疫系統(tǒng)而且能調(diào)節(jié)獲得性免疫反應(yīng)，與免疫性疾病及炎性疾病密切相關(guān)。TLRs廣泛識別細(xì)菌(脂多糖)和病毒(dsDNA/RNA、ssDNA/RNA)上所存在的特征模式分子，通過激活蛋白激酶(如IRAK1/4、TBK和IKKi等)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子的生物合成。除KD急性期的TLR3和TLR7外，KD患者TLRs的mRNA表達(dá)都有所升高。然而，與正常對照組相比，KD患者急性期TLR1、2、4、6、8、9上的甲基化模式分子表達(dá)水平較低。在IVIg治療后，此差異更顯著[20]。已有研究證明，用脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激TLR2和TLR4可以調(diào)節(jié)KD小鼠模型中的IL-2、IL-6、IL-10、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和干擾素-β(interferon-beta，INF-β)的表達(dá)，這一觀察結(jié)果提供了KD是由細(xì)菌感染觸發(fā)的相關(guān)證據(jù)[21]。

在KD急性期，巨噬細(xì)胞從M1到M2的活化已有所研究。近年來，使用基因芯片陣列對急性KD患者的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，除了與M2巨噬細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記物外，TLR2和IL2RA(M1巨噬細(xì)胞)的表達(dá)有所升高(例如MS4A4A、MS4A6A、TLR1、TLR8、TLR5、CD36、CCR2和ARG1)。這些基因的啟動子區(qū)域處于低甲基化狀態(tài)。對KD患者進(jìn)行的IVIg治療通過豐富低甲基化狀態(tài)，進(jìn)一步增強了這些基因的表達(dá)模式。中性粒細(xì)胞激活異常也與KD有關(guān)。在KD患者中觀察到具有異常甲基化模式的中性粒細(xì)胞激活標(biāo)記CD177表達(dá)增強。與IVIg敏感KD患者組的CD177水平相比，IVIg耐藥KD患者組的CD177水平相對較高[22]。

免疫細(xì)胞中的Fc受體[免疫受體酪氨酸基激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)相關(guān)受體家族]可與抗體或抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，幫助調(diào)理吞噬、脫粒和細(xì)胞因子生物合成[23]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)Fc受體的表達(dá)水平及其功能的改變與風(fēng)濕免疫疾病發(fā)生有關(guān)[24]。全基因組關(guān)研究(genome-wide association study，GWAS)已證實FCGR2A基因是KD的易感性基因。FCGR2A主要編碼在激活的免疫細(xì)胞中廣泛表達(dá)的免疫球蛋白IgG(Fc區(qū)域受體II-a)受體。研究表明，該基因的甲基化水平會影響IgG2與其受體的結(jié)合。一項最新的GWAS研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，KD患者的FCGR2A基因具有15.54%低甲基化模式的表觀遺傳調(diào)控。與IVIg敏感的KD患者相比，IVIg耐藥患者的低甲基化水平也顯著較高[25]。

2 microRNA

microRNAs(miRNAs)是內(nèi)源性，單鏈非編碼小RNAs(長約18～25個核苷酸)，在控制mRNA翻譯中發(fā)揮著重要作用。非編碼的RNA被轉(zhuǎn)錄但不轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)，而是作為一種表觀遺傳機制來調(diào)控基因表達(dá)。它們可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)，具有抑制靶mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯或者能夠剪切靶mRNA并促進(jìn)其降解的功能[26]。多數(shù)miRNA具有高度保守性、時序性和組織特異性。miRNA的表達(dá)受表觀遺傳機制控制，其本身也控制著表觀遺傳機制，組成一個“表觀遺傳學(xué)-miRNA調(diào)控回路”，其調(diào)控環(huán)節(jié)的異常與多種疾病相關(guān)[27]。

miRNA具有獨特的表達(dá)模式，因此被用作疾病診斷的新型非侵入性生物標(biāo)志物[28]。有報道稱miRNAs可在外周血中被釋放，這些miRNA與某些特定的病理生理狀態(tài)相關(guān)。因此，外周血清miRNA被廣泛用作各種疾病的診斷和治療性生物標(biāo)記物。據(jù)報道，異常的miRNAs表達(dá)與免疫性疾病、心血管疾病、炎癥和腫瘤密切相關(guān)，在KD的發(fā)病機制中也起著重要作用。研究表明，在KD的急性期，miR-143、miR-199b-5p、miR-618、miR-223和miR-145的表達(dá)明顯較高[29]。另一項研究表明，在KD患者中，血清miR-200c和miR-371-5p水平明顯高于健康對照組。這些miRNAs可能在KD的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，并可作為KD的潛在生物標(biāo)志物[30]。已有學(xué)者研究了血清miRNA，如miR-1246、miR-4436b-5p、miR-197-3p和miR-671-5p在KD中作為生物標(biāo)記物的作用[31]。Zhang等[32]對102例KD患者進(jìn)行研究，血清中miR-200c和miR-371-5p在KD急性期顯著升高；在IVIg耐藥的KD患者中，其水平也較高；研究還表明，經(jīng)過治療后，其水平較前下降。在一項研究中顯示，血漿miR-328、miR-575、miR-134和miR-671-5p已被證明是診斷KD和通過影響炎癥基因表達(dá)來預(yù)測IVIg治療結(jié)果的潛在生物標(biāo)志物。Wang等[33]研究顯示在KD中，hsa-let-7b-5p和hsa-miR-223-3p略有下調(diào)，而miR-200c、miR-197-3p和miR-671-5p水平有所上調(diào)。Li等[34]研究表明，與健康對照組相比，KD患者的血漿中的18個miRNA表達(dá)具有差異；miR-125a-5p在KD患者血漿中顯著增加，其通過調(diào)節(jié)靶基因MKK7誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，在KD的發(fā)病機制中發(fā)揮作用。

3 長鏈非編碼RNA

長鏈非編碼RNAs(lncRNAs)是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA分子，通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄參與細(xì)胞內(nèi)多種過程的調(diào)控。在人類基因組中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過27 000個lncRNAs，有新研究證明它們的功能與人類疾病的發(fā)展具有密切相關(guān)性[35]。Ko等[36]研究了37例KD患者lncRNA表達(dá)的變化，結(jié)果顯示，XLOC_006277的轉(zhuǎn)錄在IVIg敏感的KD患者中，急性期表現(xiàn)過高，IVIg治療后下降；在之后發(fā)展為CAAs的KD患者中也發(fā)現(xiàn)了更高水平的XLOC_006277轉(zhuǎn)錄。

研究發(fā)現(xiàn)lncRNA可以通過增加促炎細(xì)胞因子及其他炎癥靶基因的轉(zhuǎn)錄或增強炎癥信號來加強炎癥反應(yīng)。THRIL(TNF-和hnRNPL相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)性lncRNA)是TLR2激活后誘導(dǎo)的許多l(xiāng)ncRNA之一。CXCL10是目前已被發(fā)現(xiàn)的由THRIL調(diào)節(jié)的基因之一，在KD患者急性期水平上調(diào)，已被證實為KD的生物標(biāo)志物[37]。在一項17例KD患者的研究中發(fā)現(xiàn)，在KD急性期，當(dāng)TNF-α水平升高時，linc1992/thirl表達(dá)較低，故linc1992/thril被認(rèn)為可能是KD免疫激活的一種新的生物標(biāo)志物。

lncRNAs在炎癥反應(yīng)時被誘導(dǎo)表達(dá)，并在炎癥反應(yīng)過程中調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。目前有關(guān)KD與lncRNAs的研究較少，但研究已經(jīng)表明KD與lncRNAs表達(dá)的變化密切相關(guān)。在深入了解lncRNAs在KD中的生物學(xué)功能和作用方面，仍需更多的研究，以發(fā)現(xiàn)更多的生物標(biāo)志物及探索新的治療方案，

綜上所述，KD作為兒童較為常見的免疫炎癥性疾病，常伴冠狀動脈損害，甚至發(fā)生冠狀動脈瘤破裂、心肌梗死及猝死等嚴(yán)重并發(fā)癥，其影響患兒正常生長發(fā)育，并給患兒家庭帶來較沉重的心理和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。故減少KD發(fā)生、控制其發(fā)展尤為重要。KD受遺傳及環(huán)境雙重控制，外界環(huán)境的變化密切影響著KD的發(fā)生發(fā)展，故需在表觀遺傳學(xué)方面對本病做進(jìn)一步研究。

目前關(guān)于KD中表觀遺傳學(xué)的研究及認(rèn)知處于初步階段，本文闡述了幾種關(guān)于KD診斷和疾病預(yù)測的新的生物標(biāo)志物，其中大多數(shù)研究是基于有限患者數(shù)量的單中心研究，還需更大的樣本量來進(jìn)行驗證。表觀遺傳學(xué)作為基因調(diào)控的開關(guān)，對表觀遺傳學(xué)調(diào)控機制進(jìn)行相關(guān)的研究，可以為KD的發(fā)病機制、早期識別、生物標(biāo)志物、新型治療等方面提供新的思路。