轉(zhuǎn)移性宮頸癌細胞衍生的外泌體miR-21-5p 促進宮頸癌侵襲及轉(zhuǎn)移

楊翔 陳燁 鄭瑋 李虎 夏紅

宮頸癌是女性第四大常見惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)，每年有近30 萬女性死于宮頸癌［1］。近年來，非編碼RNA（ncRNA）已成為惡性腫瘤相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點［2-3］。微RNA-21-5p（miR-21-5p）作為腫瘤啟動子在許多類型的癌癥中發(fā)揮著作用［4-6］。許多研究顯示，miR 可以與mRNA 的3′-非翻譯區(qū)（3′-UTR）結(jié)合，從而負面地調(diào)節(jié)其匹配的靶基因，導(dǎo)致mRNA 降解或翻譯抑制［7］。據(jù)報道，快速發(fā)育生長因子同源蛋白2 抗體（SPRY2）在腫瘤細胞中表達異常，在細胞增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用［8］。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-21-5p 可以通過調(diào)節(jié)SPRY2 的表達來影響宮頸癌的增殖，但機制未明。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是目前已知的體內(nèi)最重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)體系。細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被認為是經(jīng)典的MAPK轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與了腫瘤的發(fā)生［9］。另外，腫瘤細胞釋放的外泌體（EXO）已被證明是有效傳遞的細胞間信號介質(zhì)［10］。成熟的miR 約占EXO 核酸含量的47%，在親代腫瘤細胞釋放的miR 可轉(zhuǎn)移至近端或者遠端的細胞進而進行基因調(diào)節(jié)［11］。由此推測，miR-21-5p 可能靶向SPRY2，通過ERK/MAPK 信號通路調(diào)控宮頸癌SiHa 細胞的增殖和遷移，并可能通過旁分泌的作用，將EXO 中miR-21-5p 傳遞到毗鄰的健康細胞，促進腫瘤的轉(zhuǎn)移。本研究對這一假設(shè)進行探索，旨在深入了解宮頸癌的致病、轉(zhuǎn)移機制，并為宮頸癌的治療提供新的治療靶點。

材料與方法

一、研究對象

選擇2019 年1 月至2020 年7 月廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院收治的22 例轉(zhuǎn)移性宮頸鱗癌患者手術(shù)標本（癌組織、癌旁組織）和血清標本（病例組），以及22 名健康體檢者的血清標本（對照組），標本取出后立即置于?80 ℃以下液氮保存。所有的宮頸鱗癌患者均為新發(fā)病例，術(shù)前均未接受放射治療和（或）化學(xué)治療，病理診斷由2 名病理學(xué)專家根據(jù)WHO 分類標準進行診斷，患者臨床信息見表1。本研究經(jīng)廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準［批件號：番醫(yī)倫審批（2018）第84號］，所有研究對象已簽署知情同意書。

表1 病例組和對照組的臨床特征［例（%）］

二、細胞及主要試劑

宮頸癌SiHa 細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司，胎牛血清、0.25%乙二胺四乙酸（EDTA）胰蛋白酶溶液、青鏈霉素、DMEM 培養(yǎng)基及磷酸鹽緩沖液（PBS）均購自美國Gibco 公司， miR-21-5p mimic、miR nc、miR-21-5p inhibitor、inhibitor nc 質(zhì)粒及逆轉(zhuǎn)錄-實時熒光定量PCR（RT-qPCR）試劑盒均購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司，EXO RNA 提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司，TRIzol 試劑購自廣州瑞真生物技術(shù)有限公司，PCR 所需引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司，lipofectamine 2000 試劑、蛋白免疫印跡法相關(guān)試劑及BCA 蛋白定量試劑盒均購自美國ThermoFisher 公司，磷酸化絲裂原和應(yīng)激激活的蛋白激酶（p-MSK）、磷酸化核糖體S6蛋白激酶（p-90RSK）、磷酸化原癌基因C-RAF（p-C-RAF）、磷酸化MAPK 激酶（p-MEK）和磷酸化MAPK（p-MAPK）兔來源單克隆抗體均購自美國CST 公司，噻唑藍（MTT）試劑盒、結(jié)晶紫染液購自北京索萊寶科技有限公司，PKH-26 染料購自美國Sigma 公司。

三、方 法

1. 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期的宮頸癌SiHa 細胞用于實驗。根據(jù)Lipofectamine2000 脂質(zhì)體說明書將5 μL miR-21-5p 模擬物、5 μL 陰性對照模擬物、5 μL miR-21-5p 抑制劑和5 μL 陰性對照抑制劑分別轉(zhuǎn)染到SiHa 細胞，轉(zhuǎn)染的細胞在恒溫箱培養(yǎng)48 h 后進行后續(xù)實驗。根據(jù)轉(zhuǎn)染物不同，實驗分為miR-21-5p模擬物（mimic-21）組、miR-21-5p 模擬物陰性對照（mimic nc）組、miR-21-5p 抑制劑（inhibitor-21）組和miR-21-5p 抑制劑陰性對照（inhibitor nc）組。

2. MTT 檢測

細胞轉(zhuǎn)染48 h 后，使用MTT 比色法檢測細胞的增殖能力。調(diào)節(jié)宮頸癌SiHa 細胞密度至1×104/孔，接種在96 孔板中，每組設(shè)置在5 個復(fù)孔。在37 ℃下培養(yǎng)2 h 后，酶標儀測量490 nm 處各孔吸光度（OD）值，從而計算細胞增殖指數(shù)。

3. RNA 分離和RT-qPCR

按照TRIzol 試劑盒的說明書提取細胞總RNA，SimpliNano 微量分光光度計檢測RNA 的濃度和純度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，逆轉(zhuǎn)錄合成模板DNA，進行RT-qPCR 檢測。引物序列：miR-21-5p 正向5′-CTCA ACTGGTGTCGTGGA-3′，反向5′-TCGGC AGGCAACAGC-3′；SPYR2 正 向5′-GGA CTGTGGCAAGTGCAAATGTA-3′，反 向5′-AAGGC ACTGCTTGTCGCAGA-3′；GAPDH 正 向5′-AGAAG GCTGGGGCTCATTTG-3′，反向5′-AGGGGCCATCC ACAGTCTTC-3′；U6 正向CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。采用2-△△Ct法計算相對表達量。

4. 細胞集落形成實驗

細胞轉(zhuǎn)染48 h 后，經(jīng)胰蛋白酶消化處理，以400 個細胞/孔的密度接種在6 孔板上。細胞培養(yǎng)7～14 d，每3 d 更換培養(yǎng)基。最后進行細胞固定并使用結(jié)晶紫染色測定法進行染色。

5. Transwell 遷移實驗

細胞轉(zhuǎn)染48 h 后制備細胞懸液，在無胎牛血清的培養(yǎng)基中將其密度調(diào)整為1×105/mL。取200 μL 細胞懸液均勻地鋪到Transwell 的內(nèi)室，外室加600 μL 完全培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)24 h 后，用無菌棉簽去除內(nèi)室細胞。4%多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色15 min。分別在顯微鏡下隨機選擇10個視野以計數(shù)遷移的細胞數(shù)并計算平均值。重復(fù)上述實驗3 次，每組3 孔。

6. 蛋白免疫印跡法

采用蛋白免疫印跡法檢測ERK / MAPK 信號通路的蛋白表達。使用增強化學(xué)發(fā)光（ECL）法檢測試劑盒顯影蛋白質(zhì)，以GAPDH 為對照，計算各蛋白的相對表達量。

7. 雙熒光素酶報告

取對數(shù)生長期細胞，接種于24 孔板，培養(yǎng)24 h后，將SPRY2 野生型（WT） 或突變型（MUT）分別與inhibitor nc、inhibitor、mimic nc、mimic 共轉(zhuǎn)染入SiHa 細胞中，48 h 后清洗、裂解細胞，按要求上機檢測熒光素酶相對活性。

8. EXO 分離、鑒定及SiHa 細胞攝取的檢測

采用高速離心法提取EXO，提取出來的EXO用適量的PBS 重懸后，取10 μL 用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。EXO 用透射電子顯微鏡鑒定其形態(tài)，納米顆粒跟蹤分析（NTA）技術(shù)測定其粒徑范圍，蛋白免疫印跡法檢測EXO 標志物CD9、CD63 及Alix 的表達情況。

用PKH26 染料標記EXO，孵育完成后，在4 ℃、120 000×g 的條件下離心90 min，再次重懸，混入完全培養(yǎng)基后與人臍靜脈內(nèi)皮細胞避光共培養(yǎng)24 h。24 h 后，避光條件下，棄去舊培養(yǎng)基，細胞用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3 次；4%多聚甲醛溶液室溫下固定30 min，PBS 再洗3 次；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） 染色10 min，PBS 洗3次；滴入抗熒光猝滅封片劑，熒光顯微鏡下拍照。

9. EXO RNA 提取

血清EXO RNA 提取過程中加入miR-39 作為外參，提取后加尾、逆轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄過程，參照miDETECT A TrackTMmiRNA RT-qPCR Starter Kit（Ribobio）說明書操作。

10. miR 靶基因預(yù)測

使用miRTarBase 數(shù)據(jù)庫對靶基因進行預(yù)測，數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址為https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0 分析。正態(tài)分布的計量資料以 表示，組間比較采用t 檢驗，多組間比較用方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t 檢驗；非正態(tài)分布的資料用M（P25，P75）表示，癌旁組織與癌組織間比較用配對秩和檢驗。受試者操作特征（ROC）曲線和統(tǒng)計圖分別使用SPSS 21.0 和GraphPad Prism 8.0 繪制。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、轉(zhuǎn)移性宮頸鱗癌組織中miR-21-5p 的表達

RT-qPCR 結(jié)果顯示 ，miR-21-5p 在10 對轉(zhuǎn)移性宮頸鱗癌組織中的表達為2.426（1.697，5.753），高于癌旁組織的0.288（0.019，1.873），兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z = 2.797，P = 0.004），見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)移性宮頸鱗癌組織與癌旁組織中miR-21-5p 的表達水平

二、miR-21-5p 促進宮頸癌SiHa 細胞集落形成

轉(zhuǎn) 染48 h 后，mimic-21 組SiHa 細 胞 克 隆集 落 數(shù) 為585.30±29.37， 多 于mimic nc 組 的399.30±27.02（t = 8.073，P ＜0.01）；inhibitor-21組SiHa 細胞克隆集落數(shù)為269.30±16.5，少于inhibitor nc 組的393.00±23.58（t = 7.442，P ＜0.01），見圖2。

圖2 miR-21-5p 促進SiHa 細胞集落形成

三、miR-21-5p 增強宮頸癌SiHa 細胞遷移、增殖能力

Transwell 遷移實驗結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示，mimic-21 組遷移細胞數(shù)為2233.33±155.67，較mimic nc 組 的1013.43±80.83 增 多（t = 12.047，P ＜0.001），inhibitor-21 組 的 細 胞 遷 移 數(shù) 為248.00±45.57， 較inhibitor nc 組 的1341.33±227.74 減少（t = 8.154，P ＜0.01），見圖3A、B。MTT 實 驗 結(jié) 果 顯 示， mimic-21 組 細 胞OD 值 為1.768±0.078，較mimic nc 組的0.771±0.032 升高（t = 26.473，P ＜0.001）；inhibitor-21 組細胞OD 值為0.464±0.062，較inhibitor nc 組的0.845±0.041降低（t = 11.443，P ＜0.001），見圖3C。

圖3 Transwell 檢測 miR-21-5p 對SiHa 細胞遷移能力的影響（光學(xué)顯微鏡，×100）

四、miR-21-5p 靶向調(diào)控SPYR2

設(shè)計序列（圖4A）。miRTarBase 數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-21-5p 和SPRY2 之間存在結(jié)合位點。RT-qPCR 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后mimic-21 組miR-21-5p mRNA 表達水平為9.38±0.39，高于mimic nc組 的0.79±0.55、inhibitor-21 組 的0.82±0.05 和inhibitor nc 組的1.21±0.34，見圖4B。雙熒光素酶驗證結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染MUT 基因的SPRY2 相對熒光強度在mimic-21 組為0.58±0.14，在mimic nc組為0.63±0.10，在inhibitor-21 組為 0.58±0.14，在inhibitor nc 組為0.52±0.09，4 組細胞的熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F = 0.436，P >0.05）；共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T 基因的SPRY2 相對熒光強度在inhibitor-21 組為0.50±0.08，較mimic-21 組的0.23±0.04、mimic nc 組 的0.41±0.09 和inhibitor nc 組的0.34±0.09 提高（F = 14.151，P ＜0.001），見圖4C。

圖4 miR-21-5p 靶向調(diào)控SPYR2

五、miR-21 表達變化對SiHa 細胞ERK/MAPK信號通路蛋白表達的影響

蛋白免疫印跡法檢測顯示，mimic-21 組p-MSK、p-90RSK、p-C-RAF、p-MEK 和p-MAPK蛋白表達較mimic nc 組上調(diào)，而inhibitor-21 組蛋白表達較inhibitor nc組下調(diào)（P均＜0.05），見圖5。

圖5 改變miR-21-5p 表達對各組細胞ERK/MAPKS 信號通路蛋白表達的影響

六、血清EXO 形態(tài)、標志蛋白及細胞攝取實驗

高速離心法提取血清EXO，電鏡下見所提取的囊泡大部分為類圓形或圓形，見圖6A；NTA 結(jié)果顯示，囊泡粒徑分布范圍30～150 nm，見圖6B；蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，囊泡中的Alix、CD9、CD63 表達均呈陽性，見圖6C。上述結(jié)果提示提取的囊泡為EXO。PKH26 標記EXO 與人臍靜脈內(nèi)皮細胞共孵育24 h，免疫染色結(jié)果顯示，EXO 進入細胞內(nèi)部沿核周分布，提示EXO 可以很好地被細胞攝取，見圖6D。

圖6 EXO 形態(tài)、標志蛋白及細胞攝取

七、 miR-21-5p 在轉(zhuǎn)移性宮頸鱗癌患者血清EXO 中的表達

RT-qPCR 顯示血清EXO 中miR-21-5p 相對表達量在轉(zhuǎn)移性宮頸鱗癌患者中為6.26±2.32，高于其在健康體檢者中的1.27±0.39（t = -3.670，P =0.021）。

八、血清EXO 中miR-21-5p 對宮頸鱗癌轉(zhuǎn)移的診斷價值

ROC 曲線分析顯示曲線下面積為0.9375，表明血清EXO miR-21-5p 對宮頸鱗癌轉(zhuǎn)移有較好的診斷能力（P ＜0.05），見圖7。

圖7 血清EXO miR-21-5p 預(yù)測宮頸鱗癌細胞轉(zhuǎn)移的ROC 曲線

討 論

宮頸癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移機制非常復(fù)雜，然而具體的分子調(diào)控機制仍有待進一步探討。miR-21-5p是一種具有癌基因特性的促癌miR，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要調(diào)控因素，而其是否參與宮頸癌的生長及轉(zhuǎn)移尚無確切的證據(jù)。

本研究首先將miR-21-5p 的mimics 及inhibitor轉(zhuǎn)染至SiHa 細胞，通過調(diào)節(jié)miR-21-5p 的表達水平，利用集落形成實驗及MTT 比色法觀察細胞的生長、Transwell 法檢測細胞遷移能力、蛋白免疫印跡法檢測ERK/MAPK 信號通路蛋白表達的變化，結(jié)果顯示SiHa 細胞轉(zhuǎn)染mimics-21 后的生長、遷移能力增強。轉(zhuǎn)染mimics-21 后細胞生長受到抑制，遷移能力減弱。這說明miR-21-5p 可能通過促進宮頸癌細胞生長，增強遷移及侵襲能力，在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮癌基因的作用，接著通過miRTarBase 數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-21-5p 可以靶向結(jié)合SPRY2 蛋白，雙熒光素酶實驗也驗證了這一點，兩者在細胞內(nèi)表達呈負相關(guān)，這與既往研究結(jié)論一致。

眾所周知，MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在許多腫瘤細胞的生長及遷移等過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［12］。ERK 信號通路被認為是經(jīng)典的 MAPK 通路。其活化過程是通過Ras →Raf →MEK 通路作用于ERK，活化的ERK 作用于某些關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，起到調(diào)節(jié)細胞生長、侵襲、遷移和調(diào)控細胞周期等作用［13-14］。許多miR 是通過MAPK 信號通路來發(fā)揮其功能［15］。例如，miR-378 通過抑制MAPK 信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達，從而抑制心肌細胞增殖［16］。本研究顯示，轉(zhuǎn)染mimic-21 后，ERK 信號通路中p-RSK、p-MSK、p-RAF、p-MEK 和p-MAPK蛋白的相對表達量升高，相反轉(zhuǎn)染inhibitor-21 后，ERK 信號通路中上述蛋白的相對表達量明顯降低，與陰性對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。據(jù)此推測，改變miR-21-5p 的表達可能影響人宮頸癌SiHa 細胞的生長和遷移，其機制可能是通過調(diào)節(jié)ERK/MAPK 信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達來實現(xiàn)的。

EXO 是一種具有雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡，其內(nèi)含有大量的活性物質(zhì)如蛋白質(zhì)和核酸［17］。EXO 可由體內(nèi)多種細胞分泌，在信息傳遞方面也起著重要作用。腫瘤細胞通常比正常細胞產(chǎn)生更多的EXO，來源于腫瘤細胞的EXO 具有很強的能力來改變局部和遠處的微環(huán)境［10，18-19］。為 了探究miR-21-5p 是否通過EXO 的傳遞促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移及擴散，本研究通過RT-qPCR 檢測轉(zhuǎn)移性宮頸鱗癌患者血清EXO 中miR-21-5p 的相對表達量，發(fā)現(xiàn)miR-21-5p在血清EXO 的相對表達量高于健康體檢者。為進一步證明EXO miR-21-5p 在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移中的作用，本研究繪制宮頸鱗癌患者血清EXO miR-21-5p預(yù)測腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的ROC 曲線，曲線下面積為0.9375。因此，miR-21-5p 是促進宮頸鱗癌細胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵致癌miR，而EXO 則是充當腫瘤轉(zhuǎn)移過程中信息交流的重要媒介，因此EXO 中miR-21-5p 可作為宮頸癌細胞轉(zhuǎn)移的預(yù)測因子。

本研究有兩點不足：①組織樣本量不夠大；②未使用ERK/MAPK 通路抑制劑和SPRY2 蛋白抑制劑驗證逆轉(zhuǎn)miR-21-5p 過表達對人宮頸癌細胞生長和遷移的促進效應(yīng)；③未通過動物模型對miR-21-5p 在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用進行體內(nèi)研究。后續(xù)筆者團隊將通過相關(guān)實驗驗證并進一步闡明。

綜上所述，轉(zhuǎn)移性宮頸癌組織源性miR-21-5p通過EXO 的傳遞促進腫瘤轉(zhuǎn)移，其機制與靶向SPRY2 調(diào)控ERK/MAPK 信號通路的激活有關(guān)。