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    胰腺癌動物模型的比較與選擇

    2022-12-27 13:00:08延張勵許小凡辛嘉萁
    臨床肝膽病雜志 2022年12期
    關(guān)鍵詞:動物模型原位造模

    延張勵,許小凡,辛嘉萁,張 紅,3

    1陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,陜西 西咸新區(qū) 712046;2慕尼黑工業(yè)大學(xué)伊莎河右岸醫(yī)院胰腺病研究所,德國 慕尼黑 81675;3陜西省免疫炎癥相關(guān)疾病中醫(yī)藥防治國際聯(lián)合研究中心,陜西 西咸新區(qū) 712046

    胰腺癌(pancreatic cancer,PC)是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,起病隱匿、惡性程度高、化療反應(yīng)差、疾病進展快,加之胰腺的解剖位置特殊、腫瘤切除率低,因此PC極易復(fù)發(fā)、預(yù)后極差[1]。當前急需尋找高效的治療手段遏制PC的進展,而開展大量臨床和基礎(chǔ)研究以明確PC的發(fā)病機制是提高其臨床療效的重要前提。目前,用于PC相關(guān)基礎(chǔ)研究的動物模型主要分為化學(xué)藥物誘導(dǎo)、移植瘤和基因工程三類。本文將對各種常用的PC動物模型進行比較,旨在為PC研究中動物模型的選擇提供一定的依據(jù)。

    1 化學(xué)藥物誘導(dǎo)模型

    化學(xué)藥物誘導(dǎo)模型是通過化學(xué)致癌劑使細胞發(fā)生惡變從而建立PC模型[2],常用的化學(xué)致癌劑有:N-亞硝基雙(2-氧丙基)胺[N-nitrosobis(2-oxopropyl)amine,BOP]、7,1 2-二甲基苯并蒽(7,1 2-dimethylbenzanthracene,DMBA)等。

    1.1 N-亞硝基雙(2-氧丙基)胺(BOP)誘導(dǎo) BOP是二正丙基亞硝胺(di-N-propyl nitrosamine)的一種β-代謝物,多種研究顯示,BOP具有“廣譜”致癌作用,但其致癌作用機制尚未完全清楚[3]。

    衛(wèi)積書等[3]采用BOP(20 mg/kg,1次/周,4周)對敘利亞倉鼠進行腹壁皮下注射,20周時倉鼠總體胰腺成瘤率僅為17.64%,且發(fā)現(xiàn)實驗鼠均不同程度產(chǎn)生了肝硬化,說明高劑量BOP的副作用較大,容易誘發(fā)其他器官病變,且PC的誘發(fā)率并不夠高。而馬青松等[4]在倉鼠皮下注射低劑量BOP(10 mg/kg,1次/周,7周),結(jié)果發(fā)現(xiàn)25周后總成瘤率為81.3%,部分實驗鼠出現(xiàn)了黃疸、體質(zhì)量減輕及遠處轉(zhuǎn)移等PC相關(guān)臨床表現(xiàn)。隨后大量實驗[5-6]表明,10 mg/kg BOP是目前誘導(dǎo)PC動物模型較為合適的給藥劑量,但適宜的給藥時間尚未形成統(tǒng)一共識。BOP皮下注射誘導(dǎo)PC操作較為簡單,但由于其廣譜致癌性,易導(dǎo)致并發(fā)其他器官的病變。

    1.2 DMBA誘導(dǎo) DMBA具有強力致癌作用,其在生物體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化的生成物可以與DNA共價結(jié)合,致使DNA損傷與染色體畸變,從而誘發(fā)癌基因和抑癌基因突變,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[7]。

    夏蜀珺[8]采用DMBA(5 mg)晶體縫合入SD大鼠胰腺被膜下,2周后18.8%實驗鼠鏡下可觀察到胰腺上皮內(nèi)瘤變,37.5%實驗鼠發(fā)生了PC,1個月后PC發(fā)生率約76.5%,該方法造模時間較短,且高效地呈現(xiàn)了不同時期的PC病變。

    DMBA誘導(dǎo)的PC不引起其他臟器腫瘤,且具有較高的基因突變發(fā)生率[9],與人類PC的病理進展過程相似,造??梢酝暾^察到各個階段PC病變發(fā)展,但手術(shù)操作較為復(fù)雜。目前造模常用劑量為7~9 mg。

    2 移植瘤模型

    移植瘤模型是指將PC細胞株或組織植入實驗動物胰腺或皮下,建立原位移植瘤模型或異位移植瘤模型[10]。

    2.1 原位移植瘤模型 研究[11]發(fā)現(xiàn),PC原位移植小鼠模型保持了人類腫瘤的結(jié)構(gòu)及其原始的抗原表型。王兆洪等[12]將瘤塊植入BALB/c小鼠胰體尾部,4周后成瘤率100%,腫瘤與周圍組織輕度黏連,未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。隨后張賀等[13]通過原位植入瘤塊于裸鼠胰腺,發(fā)現(xiàn)該方法所造模型臨床同質(zhì)性高,與人類PC的特征接近,有利于對PC療效進行全面、長期評估,更深入地研究PC發(fā)病機制。

    由于新鮮臨床PC標本較難獲取,目前多選用PC細胞系復(fù)制原位移植瘤模型。而小鼠胰腺原位注射是該模型制作中的難點,其原因在于小鼠胰腺結(jié)構(gòu)較薄,局部注射容易造成癌細胞泄漏,形成腹內(nèi)傳播[14]。因此,提高胰腺原位注射效率具有重要的意義。有研究采用Matrigel基質(zhì)膠重懸癌細胞解決這一難題,Matrigel被注射入活體組織后,可隨著局部組織溫度的升高轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀態(tài),從而有效防止注射點滲漏,降低了PC腹腔種植的風(fēng)險[15],且實驗對比發(fā)現(xiàn)Matrigel組小鼠成瘤率遠高于原發(fā)性膽汁性膽管炎組[16]。因此低溫Matrigel重懸癌細胞注射法是目前建立小鼠原位PC模型的有效方法。

    2.2 異位移植瘤模型 與腫瘤細胞的原位移植相比,皮下移植模型較為容易觀察腫瘤的生長情況。Guo等[17]將人源胰腺腫瘤組織碎片植入NSG裸鼠兩側(cè)腋下,6個月后約71%的小鼠成功產(chǎn)生移植瘤。除此之外,大量研究[18-19]也采用了皮下接種不同的腫瘤細胞系至BALB/c小鼠復(fù)制PC模型。

    近年來研究者采用多種免疫缺陷型小鼠(腫瘤細胞移植時免疫排斥反應(yīng)較弱,有利于形成腫瘤)構(gòu)建移植瘤模型,但免疫缺陷小鼠體內(nèi)存在多種免疫細胞功能障礙,而大量研究表明,腫瘤微環(huán)境與腫瘤的生長具有密切關(guān)系[20],所以此類模型可能無法模擬腫瘤細胞生長的微環(huán)境,在PC相關(guān)研究中存在一定的局限性。

    2.3 人源異種移植(patient-derived xenografts,PDX)模型 為解決上述問題,研究者建立了PDX模型[21],該模型依賴于將手術(shù)或活檢獲得的人源腫瘤標本直接移植到免疫低下的小鼠體內(nèi),當瘤塊長至2 cm時,取瘤塊移植于另一免疫缺陷小鼠,45 d左右即可成功構(gòu)建PDX模型。此模型保留了腫瘤內(nèi)異質(zhì)性和復(fù)雜的微環(huán)境,良好保存了患者腫瘤標本的形態(tài)特征,具有更可靠的臨床預(yù)測價值[22]。

    3 基因工程模型

    基因工程小鼠模型是利用基因敲入、替換或敲除技術(shù),替換、敲入或敲除某些特定基因從而誘導(dǎo)實驗動物產(chǎn)生相應(yīng)的表型變化。

    RAS基因是第一個被發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤基因,RAS基因突變后可使RAS蛋白持續(xù)處于活化狀態(tài),導(dǎo)致細胞持續(xù)增生而發(fā)生腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)95%的胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)患者存在RAS家族成員KRAS基因突變[23],KRAS基因突變已經(jīng)被認為是PC中突變最早、概率最大的原癌基因。PC典型的突變是KRAS基因第12位點密碼子的突變激活,即K-RasG12D[24]。

    P53是人類最常見的抑癌基因,突變的p53可促進WNT/βcatenin信號傳導(dǎo),驅(qū)動PDAC轉(zhuǎn)移。Kim團隊[25]采用P53基因的突變體Trp53R172H與KRAS基因的突變體K-RasG12D組合構(gòu)建了LSL-KrasG12D;p53wmR172H/+小鼠,發(fā)現(xiàn)與體細胞p53缺失相比,突變體p53R172H顯著增加了PDAC在小鼠體內(nèi)的侵襲轉(zhuǎn)移。近來研究[26]發(fā)現(xiàn),造血信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子Vav1在PDAC中表達較高,Salaymeh等[27]研究發(fā)現(xiàn)與K-RasG12D轉(zhuǎn)基因小鼠相比,Vav1/K-RasG12D共表達轉(zhuǎn)基因小鼠可觀察到腺泡-導(dǎo)管化生(ADM)啟動的顯著增加,胰腺惡性腫瘤發(fā)病率更高,惡性病變出現(xiàn)的時間更短,停止Vav1的表達后胰腺腫瘤惡性病變顯著消退,表明Vav1是產(chǎn)生和維持ADM所必需的,Vav1與KRasG12D共表達可促進模型向PC發(fā)生發(fā)展。

    轉(zhuǎn)基因小鼠模型給癌癥研究帶來了革命性的變化,但由于小鼠胰腺體積與人的胰腺存在巨大差異,限制了PC小鼠模型在外科或放射治療研究中的應(yīng)用[28]。相比于嚙齒動物,Principe等[29]認為豬在解剖學(xué)、生理學(xué)和免疫學(xué)方面與人類的親緣關(guān)系更近,并有可能更準確地模擬人類的各種疾病,該課題組所誘導(dǎo)的豬胰腺腫瘤具有與人類PDAC一致的形態(tài)特征,同樣伴有致密的促結(jié)締組織增生性腫瘤間質(zhì)病變,加之人和豬免疫系統(tǒng)之間具有相似性,因此轉(zhuǎn)基因豬有可能為臨床前免疫治療提供一個更好的平臺。

    基因工程PC模型的轉(zhuǎn)移模式與人類PC相似,可用于研究早期PC的發(fā)生發(fā)展,該模型極大地擴展了臨床對PC的認識,且基因工程模型可根據(jù)研究需要特定敲除或敲入某一特定基因[30],有望成為識別和評估新的基因靶向治療策略的重要工具,但由于基因工程模型設(shè)計難度較大,操作復(fù)雜,難以大量造模,且成本較高。以上局限性限制了此種模型在PC發(fā)生機制和治療策略研究中的應(yīng)用。

    4 類器官培養(yǎng)模型

    目前,對PC發(fā)病機制的認識還不夠深入,迫切需要一種合適的模式來探討PC發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機制。長期以來腫瘤機制探討中使用的細胞學(xué)研究多為傳統(tǒng)的2D(二維)細胞培養(yǎng)方式[31],這種單一細胞培養(yǎng)模式無法模擬腫瘤組織的關(guān)鍵特征,且物種間的差異可能導(dǎo)致許多在動物宿主中成功的治療方法對人類無效[32]。近年來,類器官培養(yǎng)實現(xiàn)了患者腫瘤細胞體外培養(yǎng)的重大突破。類器官模型通過3D(三維)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)進行培養(yǎng)[44],形成與體內(nèi)來源的組織或器官高度相似的細胞球體,包含多種細胞,更適宜模擬腫瘤組織微環(huán)境[33-34]。

    Boj等[35]將腫瘤組織剪碎,在含Wnt3a、RSPO1、50 ng/mL的表皮生長因子等的完全培養(yǎng)液中消化為單細胞后,將細胞包埋于GFR Matrigel中,用添加1μmol/L的前列腺表E2培養(yǎng)液進行培養(yǎng)形成類器官,將其原位移植于免疫缺陷小鼠后,觀察到腫瘤類器官從癌前病變逐步發(fā)展為浸潤性和轉(zhuǎn)移性癌,重現(xiàn)了腫瘤發(fā)展的全過程,因此可通過類器官建立不同階段PC模型,為PC不同發(fā)展階段機制的研究提供新的平臺。Huang等[36]使用外科手術(shù)切除的20個原發(fā)腫瘤標本建立類器官培養(yǎng),在Matrigel中誘導(dǎo)細胞分化,使用含1%B27,50μg/mL抗壞血酸,100 ng/mL FGF2等的DMEM進行培養(yǎng)后,腫瘤類器官模型的成功率可以達到80%以上,該研究還發(fā)現(xiàn)類器官不僅與原發(fā)腫瘤表現(xiàn)出相似的形態(tài)和細胞結(jié)構(gòu),還表達其來源的原發(fā)腫瘤的分化標志物,如KRT19、GATA6和SOX9,因此認為胰腺腫瘤類器官可被用來監(jiān)測PC的臨床治療反應(yīng),為PC的個性化治療提供支撐。

    類器官模型與體內(nèi)來源組織或器官高度相似,可以保留來源組織或器官的基因組特征和部分生理功能[37],但截至目前該模型造模技術(shù)尚未成熟,造模所需的基質(zhì)膠、生長因子及具體操作步驟還未實現(xiàn)標準化,PC類器官模型所構(gòu)建的腫瘤微環(huán)境仍缺乏血管及免疫細胞不足,這與PC患者的腫瘤微環(huán)境還存在一定的差距,需要進一步深入探索[38]。

    以上所述相關(guān)的PC造模方法各有優(yōu)缺點,現(xiàn)將其整理為表1。

    表1 幾種PC造模方式優(yōu)缺點比較Table 1 Comparison of advantages and disadvantages of several PC modeling methods

    5 問題與展望

    理想的動物模型對闡明PC的發(fā)病機制、優(yōu)化PC的診斷和治療方案具有重要的意義。目前已有的動物模型可以模擬多數(shù)人類PC的特征,在此基礎(chǔ)上所開展的大量研究推動了PC的研究進展,但上述相關(guān)動物模型各有優(yōu)缺點,目前常用的造模方法為裸鼠皮下移植,異位移植模型操作簡單,便于檢測腫瘤情況,但無法模擬胰腺腫瘤微環(huán)境,而PDX模型的發(fā)展解決了這一問題,且沈曄華等[39]通過建立PC PDX模型發(fā)現(xiàn),清胰化積方可誘導(dǎo)癌細胞凋亡,從而增強吉西他濱的療效,并在此前期研究的基礎(chǔ)上,將清胰化積方用于臨床治療[40],發(fā)現(xiàn)清胰化積方確實可有效增強患者的帶瘤生存時間。為了更靶向地研究PC相關(guān)基因,基因工程小鼠模型應(yīng)運而生,但其造價昂貴,無法進行大規(guī)模實驗。類器官技術(shù)的發(fā)展為PC研究提供了新思路,有望創(chuàng)造出更加接近于人類PC病理結(jié)構(gòu)和微環(huán)境改變的動物模型,為PC的研究和臨床診療提供更加有力的支撐。

    利益沖突聲明:所有作者均聲明不存在利益沖突。

    作者貢獻聲明:延張勵負責(zé)搜集數(shù)據(jù),撰寫論文;辛嘉萁參與修改論文;張紅、許小凡負責(zé)指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。

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