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    脂肪非典型鈣黏蛋白4在胰腺癌組織中的表達(dá)水平及其與臨床病理特征的關(guān)系

    2022-12-27 12:59:50堯,張鍇,馬
    臨床肝膽病雜志 2022年12期
    關(guān)鍵詞:癌基因胰腺癌免疫組化

    張 堯,張 鍇,馬 超

    鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽胰外科,鄭州 450008

    胰腺癌是一類(lèi)早期確診率低,死亡率高的惡性腫瘤,近年來(lái),發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)出不斷攀升之勢(shì)[1]。胰腺癌的高死亡率與其早期即發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移密不可分,近年來(lái)有研究證實(shí),脂肪非典型鈣黏蛋白4(fat atypical cadherin 4,F(xiàn)AT4)基因可能作為抑癌基因,調(diào)控惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移,但有關(guān)FAT4與胰腺癌關(guān)系的探索卻少見(jiàn)報(bào)道。

    FAT4基因是果蠅ft基因的同源基因[2],ft基因在果蠅整個(gè)發(fā)育過(guò)程中參與調(diào)控Hippo通路和平面細(xì)胞極性,是果蠅7個(gè)抑癌基因中的一個(gè)。近年來(lái)全基因組測(cè)序證實(shí),F(xiàn)AT4基因在幾種類(lèi)型惡性腫瘤中反復(fù)突變,最常見(jiàn)于黑色素瘤中,突變率達(dá)40%,F(xiàn)AT4信使核糖核酸(mRNA)在乳腺癌細(xì)胞系、肺腺癌[3]中表達(dá)明顯下調(diào),下調(diào)與其啟動(dòng)子甲基化有關(guān)。已有研究表明FAT4表達(dá)與乳腺癌[4]、肺癌、胃癌[5]等惡性腫瘤相關(guān),通過(guò)直接抑制經(jīng)典Wnt/β-catenin通路或參與Hippo通路,發(fā)揮抑癌基因作用。

    然而FAT4在胰腺癌中的表達(dá)及具體功能仍不清楚。本研究檢測(cè)FAT4蛋白在胰腺癌組織和正常組織中的表達(dá),并分析FAT4蛋白在胰腺癌組織中的表達(dá)水平與臨床病理特征之間的關(guān)系。

    1 資料與方法

    1.1 研究對(duì)象 收集本院2015年1月—2017年1月期間79例行根治性手術(shù)切除,且術(shù)后病理確診為胰腺導(dǎo)管腺癌患者的胰腺癌組織及癌旁組織,其中胰頭癌60例,均行胰十二指腸切除術(shù);胰體尾癌19例,均行胰體尾切除+脾臟切除術(shù)。所有患者術(shù)前未接受放化療和免疫治療等其他治療。其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯情況來(lái)自病理免疫組化診斷報(bào)告。依據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer AJCC)第八版胰腺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[6]進(jìn)行腫瘤分期。

    1.2 免疫組化 所有標(biāo)本手術(shù)后30 min內(nèi)放入10%福爾馬林溶液中進(jìn)行充分固定,常規(guī)修剪、脫水、石蠟包埋,采用EnVision法免疫組化染色,嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作??乖迯?fù)、除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶后,滴加FAT4抗體[兔抗人FAT4多克隆抗體(NEP1-78381),購(gòu)自美國(guó)Novus Biological公司]稀釋至1∶150,4℃冰箱中過(guò)夜孵育,二抗孵育30 min后DAB顯色,復(fù)染、脫水后中性樹(shù)膠封片,顯微鏡下觀察。用已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照,以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

    1.3 免疫組化評(píng)分 本研究中,胰腺癌組織或癌旁組織中,細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核出現(xiàn)黃色或棕黃褐色顆粒狀、片狀染色則視為FAT4蛋白陽(yáng)性表達(dá)。由兩名具有高級(jí)職稱(chēng)的病理學(xué)醫(yī)師獨(dú)立盲法閱片后得出免疫組化結(jié)果,切片判讀使用200倍顯微鏡,每張切片觀察5個(gè)相鄰區(qū)域,每個(gè)視野至少包含100個(gè)細(xì)胞,每張切片重復(fù)評(píng)分3次,取平均值為最終結(jié)果,出現(xiàn)意見(jiàn)不一時(shí)則重新評(píng)估。

    評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合染色強(qiáng)度和染色范圍兩方面綜合評(píng)定。染色強(qiáng)度:無(wú)染色為0分;黃色染色為1分;棕黃色染色為2分;棕褐色染色為3分。染色范圍:無(wú)染色或染色范圍<10%為0分;10%≤染色范圍<50%為1分;50%≤染色范圍<75%為2分;染色范圍≥75%為3分。每張切片分別就染色強(qiáng)度和染色范圍評(píng)分,評(píng)分結(jié)果相加,0分為陰性“-”;1~2分為弱陽(yáng)性“+”;3~4分為中等陽(yáng)性“++”;5~6分為強(qiáng)陽(yáng)性“+++”。其中,陰性(-)和弱陽(yáng)性(+)視為低表達(dá),中等陽(yáng)性(++)和強(qiáng)陽(yáng)性(+++)視為高表達(dá)。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 26.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。等級(jí)資料組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 一般資料 79例患者中男48例,女31例,年齡在60歲以上23例,年齡在60歲以下56例;腫瘤最長(zhǎng)徑≤4 cm者54例,腫瘤最長(zhǎng)徑>4 cm者25例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例;發(fā)生神經(jīng)侵犯41例,無(wú)神經(jīng)侵犯38例;組織學(xué)分級(jí):高分化15例,中分化42例,低分化22例。TNM分期Ⅰ期24例、Ⅱ期49例、Ⅲ期6例、Ⅳ期0例。

    2.2 FAT4蛋白在胰腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá) 根據(jù)免疫組化染色結(jié)果,F(xiàn)AT4蛋白主要在胰腺癌細(xì)胞和癌旁組織細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),表現(xiàn)為黃色或黃褐色點(diǎn)片狀染色(圖1)。

    圖1 FAT4蛋白在胰腺癌及癌旁組織中的表達(dá)情況(免疫組化,×200)Figure 1 Expression of FAT4 protein in pancreatic cancer tissue and para-carcinoma tissue(immunohistochemistry,×200)

    FAT4蛋白在胰腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)分布不同,具有顯著差異(P<0.001)。FAT4蛋白在胰腺癌組織中大多數(shù)呈陰性(-)、弱陽(yáng)性(+)表達(dá),為低表達(dá);FAT4蛋白在癌旁組織中大多數(shù)呈中等陽(yáng)性(++)、強(qiáng)陽(yáng)性(+++)表達(dá),為高表達(dá)(表1)。

    表1 FAT4蛋白在胰腺癌和癌旁組織中的表達(dá)分布Table 1 Distribution of FAT4 expression in pancreatic cancer tissue and para-carcinoma tissue

    胰腺癌組織中,F(xiàn)AT4蛋白低表達(dá)率72.15%(57/79),F(xiàn)AT4蛋白高表達(dá)率27.85%(22/79);癌旁組織中,F(xiàn)AT4蛋白低表達(dá)率21.52%(17/79),F(xiàn)AT4蛋白高表達(dá)率78.48%(62/79)(表2)??傮w而言,胰腺癌中FAT4呈低表達(dá),F(xiàn)AT4蛋白在胰腺癌中的表達(dá)低于癌旁組織中FAT4的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

    表2 FAT4在胰腺癌和癌旁組織中的表達(dá)Table 2 Expression of FAT4 protein in pancreatic cancer tissue and para-carcinoma tissue

    2.3 FAT4蛋白與胰腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系

    2.3.1 FAT4蛋白不同表達(dá)水平胰腺癌患者的一般臨床情況 FAT4蛋白表達(dá)情況與患者臨床資料對(duì)比顯示,患者背痛在FAT4蛋白低表達(dá)和高表達(dá)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.042),患者性別、年齡、術(shù)前黃疸、術(shù)前空腹血糖差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表3)。

    表3 FAT4蛋白表達(dá)與胰腺癌患者的一般臨床情況Table 3 Correlations between FAT4 expression and clinical features in pancreatic cancer patients

    2.3.2 FAT4蛋白表達(dá)情況與病理學(xué)資料的關(guān)系 納入的79例患者均已行根治性手術(shù)治療,根據(jù)術(shù)后病理報(bào)告及免疫組化結(jié)果,收集完整臨床病理資料,分析與FAT4蛋白表達(dá)情況的關(guān)系。結(jié)果顯示,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)浸潤(rùn)在FAT4蛋白低表達(dá)與高表達(dá)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.003、0.026)。其他臨床病理特征差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表4)。

    表4 FAT4蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Table 4 Correlations between FAT4 expression and clinicopathological characteristics in pancreatic cancer patients

    TNM分期和腫瘤分化程度是等級(jí)變量,采用Spearman秩相關(guān)系數(shù)再次分析兩者與FAT4蛋白表達(dá)的關(guān)系,結(jié)果提示FAT4蛋白表達(dá)與胰腺癌的TNM分期、分化程度無(wú)關(guān)(P值均>0.05)(表5、6)。

    表5 FAT4蛋白表達(dá)與TNM分期的關(guān)系Table 5 Correlations between FAT4 expression and TNM stage

    3 討論

    FAT基因最早由Mahoney等[2]在果蠅中發(fā)現(xiàn),作為鈣黏蛋白基因超家族中的一員,編碼一個(gè)巨大的跨膜蛋白,起到抑癌基因的作用。FAT基因家族包括:FAT1、FAT2、FAT3和FAT4。國(guó)內(nèi)外對(duì)FAT基因家族的研究多著眼于FAT1和FAT4。

    FAT1在不同腫瘤中雙向性表達(dá),在不同類(lèi)別的腫瘤中發(fā)揮截然不同的作用。FAT1基因在膠質(zhì)瘤中作為抑癌基因,經(jīng)過(guò)抑制Wnt/β-catenin通路,抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng),通過(guò)突變使FAT1失活可以促進(jìn)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)并影響患者生存[7]。同樣,F(xiàn)AT1失活后,乳腺癌、膽管癌細(xì)胞侵襲遷移得到促進(jìn),但也有研究表明,F(xiàn)AT1在肝癌[8]和頭頸鱗癌[9]中起促癌基因作用。

    不同于FAT1,F(xiàn)AT4主要發(fā)揮抑癌基因作用,在胃癌的研究[10]中,使用免疫組化法測(cè)定FAT4蛋白在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá),結(jié)果提示FAT4在胃癌癌組織中低表達(dá),與本研究結(jié)果在一定程度上相呼應(yīng)。為進(jìn)一步探索機(jī)制,使用FAT4-shRNA沉默F(xiàn)AT4,發(fā)現(xiàn)這種抑制導(dǎo)致磷酸化YAP增加和β-catenin的累積,促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移,加速細(xì)胞周期,且FAT4沉默細(xì)胞化療耐藥性更高?,F(xiàn)有研究推測(cè),F(xiàn)AT4通過(guò)調(diào)節(jié)保持平面細(xì)胞極性、Hippo信號(hào)傳導(dǎo)途徑、經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)和YAP1表達(dá),抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和黏附。

    表6 FAT4蛋白表達(dá)與腫瘤組織學(xué)類(lèi)型的關(guān)系Table 6 Correlations between FAT4 expression and TNM stage

    然而,在胰腺癌研究[11]中,僅檢測(cè)出FAT4基因在胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)缺失,可能與啟動(dòng)子高甲基化相關(guān),但FAT4在胰腺癌組織和正常組織中表達(dá)是否有顯著差異,以及FAT4表達(dá)在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中的作用,尚無(wú)報(bào)道。

    本研究的目的在于,通過(guò)免疫組織化學(xué)染色的方式,檢測(cè)FAT4蛋白在胰腺癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá),并初步探尋其臨床意義。

    結(jié)果發(fā)現(xiàn),F(xiàn)AT4蛋白在胰腺癌中顯著低表達(dá),分析FAT4蛋白在胰腺癌中表達(dá)情況和患者一般病例資料的關(guān)系發(fā)現(xiàn),F(xiàn)AT4蛋白的表達(dá)與患者年齡、性別、黃疸有無(wú)、術(shù)前血糖情況無(wú)關(guān),F(xiàn)AT4蛋白低表達(dá)與患者背痛癥狀發(fā)生相關(guān)。進(jìn)一步分析FAT4蛋白在胰腺癌中表達(dá)情況和患者臨床病理特征發(fā)現(xiàn),F(xiàn)AT4的表達(dá)與患者腫瘤位置、腫瘤大小、TNM分期、分化程度無(wú)關(guān),F(xiàn)AT4蛋白低表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和神經(jīng)浸潤(rùn)相關(guān)。提示FAT4可能參與調(diào)控胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移,也表明FAT4對(duì)胰腺癌的調(diào)控具有廣闊的研究前景和臨床應(yīng)用意義。

    本研究中,F(xiàn)AT4蛋白表達(dá)雖然在不同TNM分期中表現(xiàn)出了一定的傾向性,但數(shù)據(jù)分析無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能與本試驗(yàn)納入病例全為根治性手術(shù)切除病例有關(guān),79例病例中,無(wú)Ⅳ期病例,Ⅲ期僅有6例,存在一定的選擇偏倚,為進(jìn)一步探究FAT4蛋白表達(dá)與胰腺癌TNM分期的相關(guān)性,應(yīng)進(jìn)一步放寬標(biāo)本入組標(biāo)準(zhǔn),并且擴(kuò)大樣本量,再次分析驗(yàn)證結(jié)果。

    本研究也存在其他不足之處,應(yīng)該進(jìn)一步使用Western blot檢測(cè)對(duì)FAT4蛋白表達(dá)進(jìn)行測(cè)定,同時(shí),使用PCR驗(yàn)證FAT4 mRNA在胰腺癌中的表達(dá),同時(shí),應(yīng)該進(jìn)一步收集胰腺癌患者預(yù)后數(shù)據(jù),通過(guò)生存分析,評(píng)估FAT4是否可以作為胰腺癌患者預(yù)后生存時(shí)間的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

    利益沖突聲明:本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突。

    作者貢獻(xiàn)聲明:張堯負(fù)責(zé)收集組織標(biāo)本、完成試驗(yàn),撰寫(xiě)論文;張鍇參與查閱文獻(xiàn),指導(dǎo)試驗(yàn)、修改論文;馬超負(fù)責(zé)擬定寫(xiě)作方向,指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最終定稿。

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