• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    可利霉素對胰腺癌細胞生物學功能的影響

    2022-12-27 12:59:50白麗娜唐春曉樸紅心林貞花楊萬山金愛花2b
    臨床肝膽病雜志 2022年12期
    關鍵詞:細胞周期孵育霉素

    白麗娜,劉 穎,唐春曉,樸紅心,林貞花,楊萬山,金愛花,2b

    1延邊大學醫(yī)學院腫瘤研究中心,吉林 延吉 133000;2延邊大學附屬醫(yī)院a.感染性疾病科,b.消化內(nèi)科,吉林 延吉 133000

    胰腺癌(pancreatic cancer,PC)是一種惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤,其在我國發(fā)病率上升至第9位,死亡率位居第6位,5年生存率僅為7.2%[1-2]。由于PC發(fā)病隱匿和早期診斷困難等因素,約80%的患者確診時已為晚期,錯過最佳手術機會[3-4]。對于無法手術治療及術后轉(zhuǎn)移的晚期患者,化療是主要的治療方式,但化療引起的不良反應導致患者生存質(zhì)量嚴重下降[5]。因此,尋找具有良好抗腫瘤活性、較強組織滲透性和毒副作用小的抗PC藥物是臨床亟待解決的重要問題。

    可利霉素(Carrimycin)是我國首次利用合成生物學技術自主研發(fā)的基因工程藥物,擁有完全自主知識產(chǎn)權(quán),于2019年6月批準上市[6]。最新研究[7]發(fā)現(xiàn),可利霉素中的主要成分異戊螺旋霉素Ⅰ可抑制肝癌細胞的腫瘤生長,并初步揭示其通過下調(diào)細胞程序性死亡配體1表達抑制肝癌增殖、轉(zhuǎn)移的分子機制。Liang等[8]的研究結(jié)果也顯示,可利霉素在體內(nèi)和體外均能抑制口腔鱗狀細胞癌的細胞生物學活性。但其在PC惡性進展中是否發(fā)揮類似的抗癌作用仍有待闡釋。為此,本研究旨在探究可利霉素對PC細胞生物學功能的影響,從而為其在PC中的治療提供實驗基礎和理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 細胞株 PC細胞株MIA PaCa-2、BxPC-3、Panc-1和PATU 8988均由延邊大學腫瘤研究中心提供。

    1.1.2 主要試劑 DMEM液體培養(yǎng)基(C11330500BT)、胎牛血清(10100147)和胰蛋白酶(25200-072)均購自美國GIBCO公司;可利霉素(國藥準字號:H20190029)購自上海同聯(lián)制藥有限公司;青霉素/鏈霉素(15140-122)購自美國GIBCO公司;超敏ExPlus ECL化學發(fā)光檢測試劑盒(ZD310A)購自莊盟生物科技有限公司;EdU(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine)試劑盒(C10310)購自廣州銳博生物技術有限公司;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(D8371)與四甲基偶氮唑鹽[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT](M8180)購自北京索萊寶生物科技有限公司;BCA蛋白定量試劑盒(CW0014)購自北京康為世紀生物科技有限公司;兔抗上皮鈣黏素(E-cadherin)(ab15148)抗體購自美國Abcam公司;兔抗鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Snail)(sc-271977)購自美國Santa-Cruz公司;小鼠抗波形蛋白(Vimentin)(V6389)抗體購自美國Millipore公司;小鼠β-肌動蛋白(CW0096M)抗體購自康為世紀生物科技有限公司;細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A(P21)(28248-1-AP)購自美國Proteintech公司;HRP標記的山羊抗兔二抗(ZB-2301)和HRP標記的山羊抗小鼠二抗(ZB-2305)購自北京中杉金橋生物技術有限公司;山羊抗兔熒光二抗Alexa Fluor 488(A-11034)和山羊抗小鼠熒光二抗Alexa Fluor 568(A-11004)購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

    1.1.3 儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱(FormaTM系列Ⅱ3110)購自美國Thermo公司;臺式微量冷凍離心機(CT15RE)購自日本日立公司;全波長多功能酶標儀(Spark)購自瑞士Tecan公司;光學倒置顯微鏡(IX71)購自日本Olympus公司;熒光正置顯微鏡(BX53)購自日本Olympus公司;垂直電泳儀(PowerPac系列)購自美國BioRad公司;電轉(zhuǎn)儀(全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)1704150)購自美國BioRad公司;ChemiDoc成像系統(tǒng)(1708280)購自美國BioRad公司。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 細胞培養(yǎng) 將MIA PaCa-2、BxPC-3、Panc-1和PATU 8988細胞培養(yǎng)在含100 mL/L胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM液體培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育,當細胞長至90%時,以1∶3的比例進行傳代,待細胞處于對數(shù)生長期時進行后續(xù)實驗。

    1.2.2 MTT實驗 將細胞常規(guī)消化、離心后以MIA PaCa-2每孔5×103個/100μL、BxPC-3每孔2×103個/100μL、Panc-1每孔3×103個/100μL和PATU 8988每孔5×103個/100μL的細胞數(shù)種植于96孔板中,每孔補充培養(yǎng)基至200μL,待細胞貼壁后,加入濃度為0、2、4、8和16μmol/L的可利霉素,每個藥物濃度設置5個平行復孔。分別培養(yǎng)24、48和72 h后,每孔加入20μL(5 mg/mL)MTT溶液,置于培養(yǎng)箱中孵育4 h后棄去上清液,每孔內(nèi)加入100μL的DMSO,震蕩10 min之后,使用全波長酶標儀于570 nm波長測定各培養(yǎng)孔的吸光值(A)。根據(jù)公式計算細胞生存率(%)=(可利霉素處理組吸光值/對照組吸光值)×100%,并繪制細胞增殖曲線計算半數(shù)抑制濃度(IC50)值。

    1.2.3 細胞分組 取對數(shù)生長期MIA PaCa-2、BxPC-3、Panc-1和PATU 8988細胞加入不同濃度可利霉素組,進行MTT實驗篩選細胞株。依據(jù)MTT實驗結(jié)果選擇BxPC-3和MIA PaCa2兩種細胞系在4、8和16μmol/L用藥濃度和48 h用藥時間進行后續(xù)實驗。

    1.2.4 EdU細胞增殖檢測實驗 將生長對數(shù)期細胞常規(guī)消化、離心后以MIA PaCa-2每孔1×104個/100μL、BxPC-3每孔5×103個/100μL的細胞數(shù)種植于96孔板中,待細胞貼壁后分別加入0、4、8和16μmol/L的可利霉素處理細胞48 h,然后每孔加入100μL 50μmol/L EdU,在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。PBS洗滌細胞2次,加入50μL 4%多聚甲醛室溫固定30 min,每孔加入50μL 2 mg/mL甘氨酸溶液搖床孵育5 min,PBS洗滌5 min,再加入100μL 0.5%Triton X-100搖床孵育10 min。再次洗滌細胞后每孔加入100μL 1×Apollo染色反應液后室溫避光搖床孵育30 min,棄染色反應液。洗滌細胞后每孔加入1×Hoechst33342反應液100μL,室溫避光孵育30 min。再次洗滌后每孔加入100μL PBS,最后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

    1.2.5 集落形成實驗 常規(guī)消化細胞后接種于6孔板,每孔接種1000個細胞,分別加入濃度為0、4、8和16μmol/L的可利霉素處理細胞繼續(xù)培養(yǎng)2周,當細胞生長至肉眼可見的細胞集落時,終止培養(yǎng)。吸去培養(yǎng)液,預冷PBS清洗2次,4%多聚甲醛固定細胞20 min,蘇木素染色30 min,棄蘇木素,蒸餾水返藍后于室溫下干燥,計數(shù)每孔集落形成數(shù)目。

    1.2.6 細胞周期檢測 取對數(shù)生長期且生長良好的MIA PaCa-2和BxPC-3細胞,常規(guī)消化制成單細胞懸液接種于6孔板中,待細胞貼壁后,分別加入濃度為0(對照組)、4、8和16μmol/L的可利霉素處理細胞48 h后常規(guī)消化,收集細胞懸液,用預冷PBS洗滌2次,再加入預冷的70%乙醇,4℃固定過夜。次日細胞離心、預冷PBS重懸后,每管加入1.5 mL PI染色液輕輕重懸均勻,37℃水浴鍋中避光孵育30 min后上機檢測。

    1.2.7 細胞劃痕愈合實驗 常規(guī)消化細胞并等量接種于6孔板中,細胞密度達到80%時,使用無菌槍頭在單層細胞上垂直劃痕。用PBS清洗漂浮的細胞后,分別加入濃度為0、4、8和16μmol/L的可利霉素處理細胞,分別培養(yǎng)0、12、24和48 h后觀察并拍照。

    1.2.8 免疫蛋白印跡法(Western blot) 用藥處理結(jié)束后,收集細胞,加入裂解液提取總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測定各組蛋白的濃度。各組蛋白取30μg樣本進行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉1 h后,與一抗在4℃孵育過夜。次日用TBS-T洗膜,TBS-T稀釋二抗,于低速搖床上室溫孵育2 h后,用ECL法顯影、曝光,最后用Image J統(tǒng)計結(jié)果并分析。

    1.2.9 免疫熒光染色實驗 將細胞置于6孔板中培養(yǎng)48 h后,依次進行PBS洗滌、多聚甲醛固定、Triton-100透化、胎牛血清封閉后,以1∶100的比例稀釋兔抗Ecadherin抗體、小鼠抗Vimentin抗體。一抗4℃孵育過夜。次日,PBS洗滌后,以1∶400的比例稀釋山羊抗兔熒光二抗或山羊抗小鼠熒光二抗,室溫避光孵育2 h。PBS洗滌后,滴入含DAPI的封片劑封片。于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

    1.3 統(tǒng)計學方法 本實驗的結(jié)果均采用Graphpad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計學分析,計量資料數(shù)據(jù)以±s表示,多組間比較采用方差分析,進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。所有實驗均重復3次或3次以上。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 可利霉素抑制PC細胞的增殖活性 為了觀察可利霉素對PC細胞增殖活性的影響,MTT實驗檢測以0、2、4、8和16μmol/L的可利霉素處理PC細胞MIA PaCa-2、BxPC-3、Panc-1和PATU 8988于24、48和72 h后細胞的增殖活力,結(jié)果顯示:可利霉素可抑制PC細胞的增殖活性,且隨著藥物濃度的升高和用藥時間的延長,細胞活性逐漸降低,并呈藥物濃度與時間依賴性(P值分別<0.01、<0.001、<0.0001)(圖1);應用Graphpad Prism 8.0軟件計算得出可利霉素處理PC細胞48 h后MIA PaCa-2細胞的IC50值為6.67μmol/L;BxPC-3細胞的IC50值為5.76μmol/L;Panc-1細胞的IC50值為8.62μmol/L;PATU 8988細胞的IC50值為7.47μmol/L。根據(jù)這一結(jié)果,將選取MIA PaCa-2和BxPC-3細胞,0、4、8和16μmol/L用藥濃度和48 h用藥時間進行后續(xù)實驗。

    圖1 MTT法檢測0、2、4、8和16μmol/L的可利霉素對PC細胞系的細胞增殖活性。Figure 1 Cell viabilityof PC cells treated by Carrimycin for 0,2,4,8 and 16μmol/L was measured by MTT assay

    2.2 可利霉素抑制PC細胞的增殖和克隆形成能力 EdU細胞增殖實驗結(jié)果(圖2a)顯示:4、8、16μmol/L可利霉素分別與對照組比較,可顯著降低PC細胞MIA PaCa-2(t值分別為2.378、4.984、18.970,P值分別為<0.05、<0.01、<0.000 1)及BxPC-3(t值分別為4.879、6.089、9.521,P值分別為<0.01、<0.001、<0.000 1)的DNA復制能力;集落形成實驗結(jié)果(圖2b)表明,4、8、16μmol/L可利霉素處理PC細胞14 d后,分別與對照組比較,MIA PaCa-2(t值分別為5.889、11.240、15.840,P值分別為<0.001、<0.000 1、<0.000 1)和BxPC-3(t值分別為6.717、15.800、18.850,P值分別為<0.001、<0.000 1、<0.000 1)細胞的集落形成能力隨著藥物濃度的增加而明顯減少。以上結(jié)果提示,可利霉素能夠抑制PC細胞的增殖能力。

    2.3 可利霉素促進PC細胞周期阻滯 通過流式細胞術分析可利霉素是否通過調(diào)控細胞周期抑制PC細胞的增殖,結(jié)果(圖3a)顯示:與對照組比較,4、8、16μmol/L可利霉素處理后MIA PaCa-2細胞G1期比例(t值分別為9.071、12.280、19.360,P值均<0.000 1)及BxPC-3細胞G1期比例(t值分別為3.061、4.962、8.868,P值分別為<0.05、<0.01、<0.000 1)均增加,MIA PaCa-2細胞S期比例(t值分別為2.316、4.165、5.562,P值分別為<0.05、<0.01、<0.001)及BxPC-3細胞S期比例(t值分別為2.424、3.264、5.744,P值分別為<0.05、<0.05、<0.001)均降低。Western blot實驗(圖3b)進一步證實,與對照組比較,周期相關蛋白P21在MIA PaCa-2(t值分別為5.437、6.453、8.799,P值分別為<0.001、<0.001、<0.000 1)和BxPC-3細胞(t值分別為25.13、44.75、52.96,P值均<0.000 1)中的表達水平隨可利霉素用藥濃度增加而逐漸上調(diào)。上述結(jié)果表明,可利霉素促進G1期細胞周期阻滯、上調(diào)P21表達抑制PC細胞的增殖。

    圖3 細胞周期和Western Blot實驗檢測不同濃度的可利霉素對MIA PaCa-2和BxPC-3細胞周期的影響Figure 3 Cell cycle and Western Blot experiments were performed to examine the effects of different concentrations of Carrimycin on the cell cycle of MIA PaCa-2 and BxPC-3 cells

    2.4 可利霉素抑制PC細胞的遷移和上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)進程 劃痕愈合實驗結(jié)果(圖4a、b和表1)顯示,0和4、8、16μmol/L可利霉素處理12、24和48 h PC細胞MIA PaCa-2(P值分別為<0.05、<0.01、<0.001、<0.000 1)及BxPC-3(P值分別為<0.05、<0.001、<0.000 1)的橫向遷移能力明顯減弱。Western Blot實驗結(jié)果(圖4c)顯示,與對照組比較,4、8、16μmol/L可利霉素處理后MIA PaCa-2(t值分別為2.388、4.899、5.819,P值分別<0.05、<0.01、<0.001)及BxPC-3細胞(t值分別為2.533、5.836、6.774,P值分別<0.05、<0.001、<0.001)中上皮標志物E-cadherin的表達明顯上調(diào),同樣地,4、8、16μmol/L可利霉素處理后MIA PaCa-2(t值分別為12.440、14.830、16.800,P值均<0.000 1)及BxPC-3細胞(t值分別為5.039、5.893、7.725,P值分別為<0.01、<0.001、<0.000 1)中間質(zhì)標志物Snail的表達水平顯著下調(diào),4、8、16μmol/L可利霉素處理后MIA PaCa-2(t值分別為3.105、7.752、11.200,P值分別為<0.05、<0.000 1、<0.000 1)及BxPC-3細胞(t值分別為2.555、4.883、9.153,P值分別為<0.05、<0.01、<0.000 1)中間質(zhì)標志物Vimentin的表達水平也顯著下調(diào);與上述結(jié)果一致,免疫熒光結(jié)果(圖4d)進一步亦證實,可利霉素處理組的E-cadherin熒光信號明顯增強,而Vimentin的熒光信號則明顯減弱。這些結(jié)果表明,可利霉素通過EMT進程抑制PC細胞的遷移。

    圖4 不同濃度的可利霉素對MIA PaCa-2和BxPC-3細胞遷移及EMT進程的影響Figure 4 Effects of different concentrations of Carrimycin on migration and EMT progression of MIA PaCa-2 and BxPC-3 cells

    表1 不同濃度的可利霉素對MIA PaCa-2細胞和BxPC-3細胞遷移的影響Table 1 Effect of carrimycin at different concentrations on the migration of MIA PaCa-2 cells and BxPC-3 cells migration

    3 討論

    在腫瘤治療過程中,隨著抗癌藥物的廣泛應用,腫瘤細胞對其產(chǎn)生不可忽視的耐藥性,致使人們對不同藥物重新定位,挖掘潛在的臨床價值。令人鼓舞的是,許多臨床批準的非癌癥藥物在生物學實驗中甚至臨床上都顯示出較好的抗腫瘤活性,其中關于大環(huán)內(nèi)酯類藥物的相關研究較多。例如,大環(huán)內(nèi)酯類藥物雷帕霉素能抑制PC、肝癌、肺癌等多種腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲能力,并能促進細胞周期阻滯,誘導腫瘤細胞凋亡,從而抑制腫瘤形成[9]。有研究[10-12]報道顯示,大環(huán)內(nèi)酯類化合物埃博霉素與微管蛋白結(jié)合,影響腫瘤細胞的有絲分裂過程,進而抑制腫瘤生長。可利霉素作為一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素新藥,不僅具有良好的抗菌效果,還具有抑制腫瘤細胞增殖及其轉(zhuǎn)移的作用[13]。后續(xù)研究[7]發(fā)現(xiàn),可利霉素可通過抑制PI3K/mTOR信號通路,降低IL-6和IL-8水平,抑制腫瘤細胞細胞程序性死亡-配體1的表達,從而抑制調(diào)節(jié)性T淋巴細胞特異性活化,繼而發(fā)揮抑癌作用,還具備誘導M2型巨噬細胞向M1型巨噬細胞轉(zhuǎn)化的功能。但其具體抑癌機制尚不明確。為此,本研究主要探討大環(huán)內(nèi)酯類抗生素可利霉素對PC細胞體外增殖及轉(zhuǎn)移能力是否有抑制作用,并進一步研究其可能的機制,為今后治療PC提供新思路。

    腫瘤細胞異常增殖是促進癌細胞發(fā)生發(fā)展進程中的重要因素,因此,抑制腫瘤細胞增殖能有效調(diào)控癌細胞發(fā)生發(fā)展過程。本研究利用濃度和時間梯度可利霉素處理PC細胞,觀測可利霉素對PC細胞活力、增殖及細胞周期的影響。研究結(jié)果顯示,可利霉素隨著藥物濃度的增加和用藥時間的延長能有效抑制PC細胞的體外增殖、集落形成能力及DNA復制能力并誘導PC細胞周期阻滯于G1期,進一步的Western Blot實驗證實了細胞周期相關標志蛋白P21的表達隨可利霉素用藥濃度增加而逐漸上調(diào),上述結(jié)果均可表明可利霉素能夠抑制PC細胞的增殖能力。這與Jin等[7]和Liang等[8]的研究結(jié)果相一致。

    有報道[14]證實EMT進程是參與胰腺炎向PC轉(zhuǎn)變以及PC轉(zhuǎn)移的重要機制。當腫瘤細胞EMT進程得到促進時,下調(diào)上皮標志物E-cadherin蛋白和過量表達間質(zhì)標志物Snail與Vimentin蛋白,導致腫瘤細胞的運動能力變強,進而在宏觀上表現(xiàn)為癌癥全身轉(zhuǎn)移擴散,從而加劇了腫瘤的治療難度[15-17]。因此,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,抑制或逆轉(zhuǎn)EMT進程對幫助腫瘤患者抑制疾病和治療疾病等均起著重要作用。于是通過劃痕愈合實驗、Western Blot和免疫熒光實驗研究可利霉素對PC細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果顯示,與對照組相比,可利霉素呈濃度和時間依賴性的方式抑制PC細胞的遷移,同時上調(diào)上皮標志物E-cadherin的表達,下調(diào)間質(zhì)標志物Snail和Vimentin的表達水平,提示可利霉素可通過逆轉(zhuǎn)EMT進程抑制PC細胞的遷移能力。而PC的侵襲轉(zhuǎn)移是一個多基因參與、多因素影響的多步驟復雜過程[18],對于EMT進程在侵襲轉(zhuǎn)移中的機制及可能存在的其他與轉(zhuǎn)移相關的信號通路還有待進一步發(fā)掘和探討。

    綜上所述,可利霉素可通過有效抑制PC細胞的增殖和遷移等生物學進程發(fā)揮其抗腫瘤的生物學活性。并且深入探究可利霉素在PC發(fā)生與發(fā)展過程中的作用及機制,可為PC的治療進一步提供基礎研究和新的希望,但可利霉素抑制PC細胞可能涉及多條信號通路,其具體的作用機制和臨床應用仍需更深入地研究探討。

    利益沖突聲明:本研究不存在研究者及與公開研究成果有關的利益沖突。

    作者貢獻聲明:白麗娜負責實驗設計、實施、論文撰寫及數(shù)據(jù)分析;劉穎、唐春曉負責實驗設計、實施及論文修改;楊萬山負責實驗設計與論文修改;金愛花、樸紅心、林貞花負責擬定寫作思路,指導撰寫文章并最后定稿。

    猜你喜歡
    細胞周期孵育霉素
    阿奇霉素在小兒百日咳的應用
    桑葉中1-脫氧野尻霉素的抗病毒作用研究進展
    紅霉素聯(lián)合順鉑對A549細胞的細胞周期和凋亡的影響
    三物黃芩湯組分(群)配伍在大鼠肝微粒體孵育模型中的相互作用
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:27
    Identifying vital edges in Chinese air route network via memetic algorithm
    大鼠肝微粒體孵育體系中2種成分的測定及其代謝
    中成藥(2017年5期)2017-06-13 13:01:12
    NSCLC survivin表達特點及其與細胞周期的關系研究
    X線照射劑量率對A549肺癌細胞周期的影響
    癌癥進展(2016年10期)2016-03-20 13:15:43
    兒科臨床應用中阿奇霉素的不良反應的探討
    熊果酸對肺癌細胞株A549及SPCA1細胞周期的抑制作用
    激情视频va一区二区三区| 亚洲成国产人片在线观看| a级片在线免费高清观看视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲熟女毛片儿| 一本综合久久免费| 高潮久久久久久久久久久不卡| 久久久久久久久免费视频了| 免费在线观看日本一区| 亚洲色图综合在线观看| 99久久综合免费| 婷婷色综合www| netflix在线观看网站| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲精品日本国产第一区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 丰满饥渴人妻一区二区三| 超碰97精品在线观看| 91成人精品电影| 一个人免费看片子| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| kizo精华| www.av在线官网国产| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产免费现黄频在线看| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 免费高清在线观看日韩| 国产伦人伦偷精品视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 女性生殖器流出的白浆| 九草在线视频观看| 国产熟女欧美一区二区| a级毛片在线看网站| 亚洲五月婷婷丁香| 波多野结衣一区麻豆| 99精品久久久久人妻精品| 国产成人91sexporn| 桃花免费在线播放| 国产成人91sexporn| 亚洲免费av在线视频| 成年女人毛片免费观看观看9 | 老司机靠b影院| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 飞空精品影院首页| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 精品国产一区二区三区四区第35| 赤兔流量卡办理| 高清视频免费观看一区二区| videosex国产| 日本a在线网址| 日韩av不卡免费在线播放| 国产极品粉嫩免费观看在线| 大片电影免费在线观看免费| av欧美777| 蜜桃国产av成人99| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 99久久人妻综合| 久热这里只有精品99| 夫妻性生交免费视频一级片| av视频免费观看在线观看| 中文字幕高清在线视频| 美女福利国产在线| 丰满少妇做爰视频| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲熟女毛片儿| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 美女主播在线视频| 桃花免费在线播放| svipshipincom国产片| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲欧美一区二区三区国产| 午夜视频精品福利| 欧美精品高潮呻吟av久久| 成人午夜精彩视频在线观看| 宅男免费午夜| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产精品 国内视频| 国产精品一国产av| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲免费av在线视频| 亚洲国产精品一区三区| 午夜91福利影院| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产深夜福利视频在线观看| 国产成人系列免费观看| 国产av一区二区精品久久| 老司机影院毛片| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 人人妻人人澡人人看| 男女边吃奶边做爰视频| 最近手机中文字幕大全| 欧美日韩亚洲高清精品| 午夜影院在线不卡| 国产av一区二区精品久久| 亚洲中文av在线| 丝袜人妻中文字幕| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 女人精品久久久久毛片| 欧美另类一区| 脱女人内裤的视频| 国产成人a∨麻豆精品| 欧美人与性动交α欧美软件| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 飞空精品影院首页| 国产成人系列免费观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 美女大奶头黄色视频| 后天国语完整版免费观看| 少妇人妻久久综合中文| av一本久久久久| netflix在线观看网站| 水蜜桃什么品种好| 老熟女久久久| 午夜福利一区二区在线看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| a级毛片在线看网站| 国产成人av教育| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲五月色婷婷综合| 丁香六月天网| 国产伦理片在线播放av一区| 男女之事视频高清在线观看 | 午夜久久久在线观看| 日日夜夜操网爽| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产午夜精品一二区理论片| 夫妻性生交免费视频一级片| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产麻豆69| 青春草亚洲视频在线观看| 一级毛片我不卡| 欧美日韩亚洲高清精品| 久热这里只有精品99| 成在线人永久免费视频| 嫁个100分男人电影在线观看 | 亚洲国产精品国产精品| kizo精华| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲av成人精品一二三区| √禁漫天堂资源中文www| 热re99久久国产66热| 99热全是精品| 在线观看人妻少妇| 国产精品二区激情视频| 久久免费观看电影| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 色播在线永久视频| 麻豆乱淫一区二区| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 欧美激情 高清一区二区三区| 最近中文字幕2019免费版| 成人手机av| 激情五月婷婷亚洲| 丰满少妇做爰视频| 午夜精品国产一区二区电影| 国产午夜精品一二区理论片| 成人免费观看视频高清| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 99久久综合免费| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 一个人免费看片子| 国产在线视频一区二区| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲免费av在线视频| 国产1区2区3区精品| 又紧又爽又黄一区二区| 波多野结衣av一区二区av| 1024香蕉在线观看| 久久久亚洲精品成人影院| 极品人妻少妇av视频| 久久ye,这里只有精品| 国产老妇伦熟女老妇高清| 成人国产一区最新在线观看 | 久久久久精品国产欧美久久久 | 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 欧美黑人精品巨大| 亚洲人成77777在线视频| 69精品国产乱码久久久| 久久午夜综合久久蜜桃| 9热在线视频观看99| tube8黄色片| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 免费一级毛片在线播放高清视频 | 久久久久精品人妻al黑| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 青春草视频在线免费观看| 久久久国产精品麻豆| 久久亚洲精品不卡| 国产精品.久久久| 亚洲熟女精品中文字幕| 久久精品久久精品一区二区三区| 丝袜在线中文字幕| 午夜福利,免费看| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 超碰97精品在线观看| 午夜福利,免费看| 丝袜人妻中文字幕| 多毛熟女@视频| 亚洲一区中文字幕在线| 自线自在国产av| 国产伦理片在线播放av一区| 美女大奶头黄色视频| 成年女人毛片免费观看观看9 | 日本wwww免费看| 国产成人欧美在线观看 | 精品第一国产精品| 国产精品久久久久成人av| 欧美在线黄色| 宅男免费午夜| cao死你这个sao货| 国产激情久久老熟女| 亚洲欧美清纯卡通| 国产日韩欧美亚洲二区| 欧美激情极品国产一区二区三区| 九草在线视频观看| 一个人免费看片子| 国产片特级美女逼逼视频| 国产高清视频在线播放一区 | 在线观看人妻少妇| 精品免费久久久久久久清纯 | 中文字幕高清在线视频| 18禁观看日本| 国产高清不卡午夜福利| 两人在一起打扑克的视频| 中文字幕高清在线视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 久久精品成人免费网站| 国产人伦9x9x在线观看| 国产视频一区二区在线看| 久久av网站| 久久精品亚洲av国产电影网| 两个人看的免费小视频| 蜜桃国产av成人99| 一区二区日韩欧美中文字幕| 永久免费av网站大全| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产精品久久久人人做人人爽| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产成人av激情在线播放| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | av国产久精品久网站免费入址| 黄色 视频免费看| 黄片小视频在线播放| 99国产精品一区二区蜜桃av | 十分钟在线观看高清视频www| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲熟女毛片儿| 欧美激情 高清一区二区三区| 日韩一本色道免费dvd| 一级毛片电影观看| 我要看黄色一级片免费的| 精品人妻一区二区三区麻豆| 色网站视频免费| 女警被强在线播放| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 国产xxxxx性猛交| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 这个男人来自地球电影免费观看| 久久久久精品国产欧美久久久 | 免费一级毛片在线播放高清视频 | 日韩精品免费视频一区二区三区| cao死你这个sao货| 夫妻午夜视频| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲成人国产一区在线观看 | 久久人人爽人人片av| 国产精品国产av在线观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| av在线播放精品| 亚洲图色成人| 欧美日韩综合久久久久久| 人人妻人人澡人人看| 丝袜美足系列| tube8黄色片| 日韩大码丰满熟妇| 91老司机精品| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产精品人妻久久久影院| 欧美国产精品一级二级三级| 九色亚洲精品在线播放| 97在线人人人人妻| 大话2 男鬼变身卡| 国产一区二区在线观看av| 精品一区二区三区av网在线观看 | 伊人亚洲综合成人网| e午夜精品久久久久久久| 精品久久久精品久久久| 男女午夜视频在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产视频首页在线观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 亚洲国产日韩一区二区| 国产国语露脸激情在线看| 中文字幕av电影在线播放| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产av精品麻豆| 日韩中文字幕视频在线看片| 国产精品99久久99久久久不卡| a级片在线免费高清观看视频| 麻豆国产av国片精品| 国产1区2区3区精品| 国产成人系列免费观看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 午夜免费鲁丝| 99久久人妻综合| 51午夜福利影视在线观看| 一级毛片电影观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 又大又爽又粗| svipshipincom国产片| 美女视频免费永久观看网站| 久久国产精品大桥未久av| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲,欧美,日韩| 精品视频人人做人人爽| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| av福利片在线| 啦啦啦在线免费观看视频4| 好男人电影高清在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 晚上一个人看的免费电影| 国产亚洲精品久久久久5区| 国产一区亚洲一区在线观看| 97精品久久久久久久久久精品| 99re6热这里在线精品视频| 一区二区av电影网| 超碰成人久久| 一区二区日韩欧美中文字幕| 成人手机av| netflix在线观看网站| 日韩电影二区| 十八禁人妻一区二区| 国产成人免费无遮挡视频| 久久精品国产a三级三级三级| 大型av网站在线播放| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲精品国产av蜜桃| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| xxx大片免费视频| 超碰97精品在线观看| 黑丝袜美女国产一区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 亚洲欧美精品自产自拍| 伦理电影免费视频| 亚洲图色成人| 男女边摸边吃奶| 在线观看免费高清a一片| 男女午夜视频在线观看| 这个男人来自地球电影免费观看| 精品高清国产在线一区| 天天影视国产精品| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 在线观看免费高清a一片| 午夜免费观看性视频| 人人妻人人澡人人看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 在线精品无人区一区二区三| 七月丁香在线播放| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲国产中文字幕在线视频| 美女视频免费永久观看网站| 欧美激情高清一区二区三区| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲av欧美aⅴ国产| 高清不卡的av网站| 美女中出高潮动态图| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 又黄又粗又硬又大视频| 两个人免费观看高清视频| 免费在线观看黄色视频的| 美国免费a级毛片| 亚洲成人国产一区在线观看 | 国产日韩欧美亚洲二区| 电影成人av| 色播在线永久视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 在线av久久热| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 日韩av不卡免费在线播放| 人妻人人澡人人爽人人| 欧美日本中文国产一区发布| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| av天堂在线播放| 亚洲美女黄色视频免费看| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 丁香六月天网| 欧美日韩综合久久久久久| 国产在线免费精品| 狂野欧美激情性xxxx| 成人国产一区最新在线观看 | 我要看黄色一级片免费的| 亚洲人成77777在线视频| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 纯流量卡能插随身wifi吗| 精品福利永久在线观看| 高清不卡的av网站| 国产午夜精品一二区理论片| 美女主播在线视频| 男人爽女人下面视频在线观看| 高清视频免费观看一区二区| 婷婷丁香在线五月| 丝瓜视频免费看黄片| 久久精品亚洲av国产电影网| 曰老女人黄片| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产一区二区 视频在线| 午夜免费成人在线视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 日韩 亚洲 欧美在线| 伊人亚洲综合成人网| av不卡在线播放| 色网站视频免费| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 在现免费观看毛片| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 一区二区三区四区激情视频| 在线精品无人区一区二区三| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲,欧美,日韩| 在线av久久热| 国产日韩欧美在线精品| 国产成人免费观看mmmm| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 一级片免费观看大全| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产在线免费精品| 国产高清国产精品国产三级| 久热这里只有精品99| 午夜久久久在线观看| 欧美97在线视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 国产一级毛片在线| 香蕉国产在线看| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲av欧美aⅴ国产| 日韩免费高清中文字幕av| 精品少妇黑人巨大在线播放| 欧美大码av| 亚洲图色成人| 大香蕉久久成人网| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产av一区二区精品久久| 色综合欧美亚洲国产小说| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 中文字幕人妻丝袜制服| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 性高湖久久久久久久久免费观看| 亚洲国产精品一区三区| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲精品第二区| 视频区欧美日本亚洲| 国产激情久久老熟女| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 日本午夜av视频| 国产精品久久久久久精品电影小说| 男女床上黄色一级片免费看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 亚洲av成人精品一二三区| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 欧美人与善性xxx| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲成人国产一区在线观看 | 亚洲av男天堂| 久久国产亚洲av麻豆专区| 一区二区日韩欧美中文字幕| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 婷婷成人精品国产| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 9热在线视频观看99| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 女性生殖器流出的白浆| 美女福利国产在线| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲国产最新在线播放| 中文字幕人妻丝袜制服| www日本在线高清视频| a级片在线免费高清观看视频| svipshipincom国产片| 成年动漫av网址| av又黄又爽大尺度在线免费看| 欧美 日韩 精品 国产| 中文字幕人妻熟女乱码| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲 国产 在线| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲精品国产av蜜桃| 久久99精品国语久久久| 亚洲欧美激情在线| 大陆偷拍与自拍| 精品久久久精品久久久| 成在线人永久免费视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 久久久国产精品麻豆| 热re99久久国产66热| 久久国产精品大桥未久av| 亚洲欧美一区二区三区久久| 亚洲人成77777在线视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲九九香蕉| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 欧美成狂野欧美在线观看| 在线观看www视频免费| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲成人免费电影在线观看 | 午夜91福利影院| 久久久久精品人妻al黑| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 少妇精品久久久久久久| 久久九九热精品免费| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产精品一区二区精品视频观看| 久久免费观看电影| 亚洲成人免费电影在线观看 | 午夜两性在线视频| 日本色播在线视频| 午夜激情av网站| 超色免费av| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 男女边摸边吃奶| 午夜视频精品福利| 免费观看a级毛片全部| 婷婷成人精品国产| 麻豆国产av国片精品| 欧美亚洲日本最大视频资源| 黄色片一级片一级黄色片| 999精品在线视频| 69精品国产乱码久久久| 亚洲国产精品国产精品| 一级毛片 在线播放| 国产在线观看jvid| 免费av中文字幕在线| 亚洲精品美女久久av网站| 精品少妇内射三级| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲中文av在线| 2021少妇久久久久久久久久久| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 91麻豆av在线| h视频一区二区三区| 脱女人内裤的视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产成人免费无遮挡视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 91精品国产国语对白视频| 大型av网站在线播放| 亚洲国产精品一区三区| 国产在线视频一区二区| 精品国产国语对白av| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 国产精品九九99| 国产免费视频播放在线视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 18在线观看网站| 午夜视频精品福利| 国产97色在线日韩免费| h视频一区二区三区| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 久久久国产精品麻豆| 国产精品久久久久成人av| 一级,二级,三级黄色视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 黄色片一级片一级黄色片| 国产成人系列免费观看| 国产片内射在线| 看十八女毛片水多多多| 国产成人精品无人区| 久久久久国产精品人妻一区二区| 欧美日韩视频精品一区| 午夜老司机福利片| 国产爽快片一区二区三区| 国产国语露脸激情在线看| www.自偷自拍.com|