神經(jīng)內(nèi)分泌前列腺癌裸鼠模型腫瘤進展中相關(guān)成纖維細胞基因表達變化的測序分析

謝 弘，傅 強，胡曉勇，張 炯，宋魯杰，黃建文，楊 濤

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院泌尿外科，上海東方泌尿修復(fù)重建研究所，上海 200233)

前列腺癌為男性最常見的惡性腫瘤之一，目前雄激素剝奪治療被臨床廣泛應(yīng)用，為轉(zhuǎn)移性前列腺癌治療首選，但隨時間進展往往會發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer,CRPC)。其中一部分患者出現(xiàn)雄激素受體非依賴性增殖，并伴有神經(jīng)內(nèi)分泌標志物陽性表達，這一過程表明前列腺癌出現(xiàn)神經(jīng)內(nèi)分泌化、侵襲能力增強等特征，目前該發(fā)病機制仍不清楚,且臨床缺乏有效治療措施，為前列腺癌患者預(yù)后不良的主要原因之一[1-3]。腫瘤微環(huán)境，尤以腫瘤相關(guān)成纖維細胞為代表，被認為是參與前列腺腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素之一，在促進腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及參與腫瘤細胞免疫調(diào)節(jié)等方面扮演重要角色[4-6]。本研究建立神經(jīng)內(nèi)分泌前列腺癌(neuroendocrine prostate cancer，NEPC)移植裸鼠模型，通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RNA sequencing technology,RNA-seq)宏觀分析比較在腫瘤種植后不同時期中腫瘤相關(guān)成纖維細胞基因的表達變化情況，為發(fā)現(xiàn)NEPC的腫瘤進展?jié)撛跈C制作用靶標打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要動物模型及試劑實驗動物BABL/c雄性裸鼠10只，4周齡，體質(zhì)量約20～25 g，無特殊病原體(specific pathogen free，SPF)條件下飼養(yǎng)，由上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院實驗中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2008-0016，使用許可證號：SYXK(滬)2011-0128。動物實驗倫理通過上海市第六人民醫(yī)院動物福利倫理委員會審查并同意開展。

實驗主要試劑為DMEM 培養(yǎng)基(美國 Gibco公司)、胎牛血清(美國 Gibco公司)、Trizol試劑盒(上海普飛公司)、M-MLV試劑盒(美國promega公司)。

1.2 新鮮前列腺癌瘤塊種植方法NEPC裸鼠皮下移植瘤模型建立：方法同PRESNELL和GRAY等[7-8]的研究，留取NEPC新鮮手術(shù)病理組織，選擇1 cm3瘤灶組織從中留取1 mm×1 mm腫瘤組織，用生理鹽水清洗3次后備用。后用10 g/L的戊巴比妥鈉，質(zhì)量濃度為40 mg/kg腹腔注射麻醉裸鼠，在裸鼠背部皮下做一小切口，將瘤塊沿切口逐漸送入至距切口約1 cm處，每只裸鼠接種一個組織塊，接種完成后縫合切口，整個接種過程在30 min內(nèi)完成。

1.3 腫瘤相關(guān)成纖維細胞原代培養(yǎng)及傳代根據(jù)李義峰等[9]的方法，分別在移植瘤模型造模成功后2周(2周組)及4周(4周組)處死裸鼠動物，獲取前列腺癌獲取新鮮組織后，確認取材迅速置入無菌D-Hanks液中，反復(fù)漂洗，用眼科剪將組織塊剪成糊狀，胰酶消化20～30 min，倒置顯微鏡下見大量懸浮的單個細胞和細胞團，即加入含20%胎牛血清(fetal calf seram,FCS)的改良Eagle培養(yǎng)基(dulbecco’s midified eagle medium,DMEM)液終止消化。加入5 μg/mL胰島素+1 mg/mL FGF-2+5% FCS+DMEM液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，72 h后首次換液，每3～4 d更換培養(yǎng)液傳代一次。取第4～6代細胞用于后續(xù)實驗。

1.4 RNA 提取和測序最終符合實驗要求的小鼠且達到存活要求時間為2周組與4周組各2只，各分離成功腫瘤相關(guān)成纖維細胞株。腫瘤相關(guān)成纖維細胞接種分為兩組：2周組與4周組，每組2個復(fù)孔，6 h后收集細胞，Trizol法提取總 RNA，并進行質(zhì)量控制。按照美國 Illumina 生物技術(shù)公司RNA-seq樣本制備試劑盒說明構(gòu)建cDNA文庫。對照基因組信息和完整的轉(zhuǎn)錄組信息，將測序出的reads比對到參考基因組上，進而對基因或轉(zhuǎn)錄本進行注釋和定量。將 reads比對到基因組后，采用StringTie(2016)對表達進行注釋和定量。StringTie應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)流算法和可選的基因組denovo組裝，將復(fù)雜的數(shù)據(jù)集組裝成轉(zhuǎn)錄本。進一步計算基因和轉(zhuǎn)錄本的FPKM值(Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragment，即每百萬外顯子片段堿基映射獲得的基因表達)。

1.5 差異轉(zhuǎn)錄本分析利用Ballgown對兩個不同處理組進行比較，得到P值、Q值和轉(zhuǎn)錄本間的差異倍數(shù)(fold-change)；本研究中將兩組進行比較，進行差異基因篩選，篩選條件為P<0.05和Fold change>1.5倍及<0.66667倍。

1.6 GO 功能類別及KEGG通路富集分析GO 數(shù)據(jù)庫(gene ontology)用樹狀分層的方式對基因及蛋白功能進行詳細描述，闡明了基因功能之間的層次關(guān)系。并將基因功能分為分子功能(MF；molecular function)、生物學(xué)過程(BP；biological pathway)和細胞成分(CC；cellular component)3個類別。GO富集分析是基于GO數(shù)據(jù)庫，對差異基因利用Fisher精確檢驗，將目標功能基因進行統(tǒng)計學(xué)分析，按照P<0.05進行篩選，篩選出顯著性差異的功能基因。

KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是系統(tǒng)分析基因及其編碼產(chǎn)物間關(guān)系、基因功能、基因組信息的數(shù)據(jù)庫，信號通路分析(Pathway分析)是基于KEGG數(shù)據(jù)庫，對差異基因利用Fisher精確檢驗，將目標基因參與的通路進行統(tǒng)計學(xué)分析，按照P<0.05進行篩選，篩選出顯著性差異的信號通路。

2 結(jié) 果

2.1 RNA-seq 聚類分析結(jié)果由差異表達基因聚類熱圖(圖1)可見，2周組與4周組兩者對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組存在表達差異，其中紅色代表差異轉(zhuǎn)錄本在分組樣本中表達值高，藍色代表差異轉(zhuǎn)錄本在分組樣本中表達值低。根據(jù)熱圖中可見似由差異基因表達火山圖(圖2)得到在兩組對比中31 175個基因無差異化表達，24個差異表達基因，其中上調(diào)表達基因11個、下調(diào)表達基因13個。圖2中橫坐標表示基因在處理和對照兩組中的表達倍數(shù)變化(log2FoldChange)，縱坐標表示基因在處理和對照兩組中表達差異的顯著性水平(-log10padj或-log10pvalue)，數(shù)值越大差異性越明顯。

圖中橫坐標為組別,第二行中的1、2分別代表裸鼠序號；縱坐標為差異基因FPKM歸一化后的數(shù)值，顏色越紅，表達量越高；顏色越藍，表達量越低。圖1 差異表達基因聚類熱圖

圖中藍色的虛線表示差異基因篩選標準的閾值線：上調(diào)基因用紅色點表示，下調(diào)基因用綠色點表示。圖2 基因火山圖

2.2 差異基因顯著富集的GO分析結(jié)果根據(jù)差異基因的構(gòu)建分布表(表1)，圖中可見在分子功能(BP)、生物學(xué)過程(CC)和細胞成分(MF)3個類別基因中，改變功能基因主要富集于：SMAD蛋白磷酸化調(diào)控，血管新生抑制，脂蛋白代謝，細胞連接功能，多細胞功能穩(wěn)態(tài)，前列腺上皮轉(zhuǎn)化調(diào)控，BMP信號調(diào)控，間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化調(diào)控，生長因子活性，半胱氨酸型內(nèi)肽酶激活劑活性參與的凋亡過程，細胞因子結(jié)合等功能調(diào)控。

表1 GO富集分析表

續(xù)表1

2.3 差異表達基因的通路顯著性富集分析結(jié)果由表2可見，通過 KEGG 數(shù)據(jù)庫分析，表達變化基因明顯富集于細胞外環(huán)境、腫瘤信號通路：細胞粘合通路、細胞外連接通路、TGF-beta信號通路、cAMP信號通路、鈣通道通路、細胞因子及受體通路等，此外還與腫瘤轉(zhuǎn)錄失調(diào)通路、前列腺癌通路有關(guān)，說明腫瘤相關(guān)成纖維細胞在腫瘤不同進展時期內(nèi)可表現(xiàn)出細胞外基質(zhì)信號及腫瘤相關(guān)信號通路的表達改變。

表2 KEGG富集分析表

2.4 定量 PCR 驗證結(jié)果見圖3。

圖中橫坐標為基因類別，縱坐標為2-ΔΔCt反映各樣品相對正常組樣品目的基因的相對表達水平，數(shù)值越高表達水平越高，各組基因表達組間t檢驗*P<0.01。圖3 兩組各基因qPCR驗證箱圖

由圖3可見，通過對測序結(jié)果中腫瘤相關(guān)的差異表達基因 NKX3-1、ISM1、GREM1進行定量 PCR 驗證，本次驗證發(fā)現(xiàn)3個基因的表達趨勢與測序結(jié)果完全一致，4周組較2周組在 NKX3-1、ISM1上的表達，均有顯著的下降，GREM1表達有明顯上升，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

3 討 論

NEPC是CRPC中侵襲性較強、惡性程度較高的一種亞型[10]，其發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移發(fā)生率約為4%～25%，遠高于與其他類型的前列腺癌。NEPC提示預(yù)后不良，中位生存期約為7～10個月，5年存活率僅1%左右[11-13]。目前對NEPC發(fā)生發(fā)展的分子機制缺乏深入研究，相關(guān)患者的治療仍基于鉑類的化療手段，因此我們有必要在NEPC的機制研究中下功夫，為該疾病的治療提供有效可選擇靶標。腫瘤微環(huán)境是研究腫瘤中不可或缺的一部分，其主要由腫瘤基質(zhì)中各種細胞、結(jié)構(gòu)分子及細胞因子的整體構(gòu)成。在前列腺癌相關(guān)的研究中，主要以腫瘤相關(guān)的成纖維細胞以及細胞外基質(zhì)的研究多見[4-5]。在腫瘤發(fā)展進程中，相關(guān)成纖維細胞可能通過不同的基因表達及錯綜復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)，表現(xiàn)出對腫瘤促進和抑制的雙重作用，以動態(tài)平衡的方式激活自身及產(chǎn)生腫瘤所需環(huán)境等方式參與其中。但這往往在模擬實驗中難以準確監(jiān)測，此時探尋環(huán)境中不同狀態(tài)下的分子機制更為困難。綜合上述，課題組初步采用建立NEPC移植裸鼠模型，通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RNA-seq)宏觀分析比較在腫瘤種植后初探不同時期中腫瘤相關(guān)成纖維細胞基因的表達變化情況，并通過qPCR技術(shù)驗證相關(guān)差異基因表達來嘗試性研究腫瘤相關(guān)成纖維細胞在NEPC進展中所扮演的角色。

本研究通過RNA二代測序技術(shù)檢測了裸鼠模型2周及4周時腫瘤相關(guān)成纖維細胞基因表達變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著時間的推移，相關(guān)細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)、成分及其分泌的因子相關(guān)基因表達改變：血管新生抑制、脂蛋白代謝、細胞連接功能、多細胞功能穩(wěn)態(tài)、前列腺上皮轉(zhuǎn)化調(diào)控、BMP信號調(diào)控、間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化調(diào)控、生長因子活性、細胞因子結(jié)合等功能調(diào)控基因發(fā)生變化。這也與腫瘤相關(guān)成纖維細胞被認為可以通過直接接觸的方式、通過旁分泌的方式分泌多種細胞因子與腫瘤細胞相互作用的說法相吻合。前列腺癌微環(huán)境基質(zhì)細胞對腫瘤細胞生長的促進作用是隨著年齡增長而發(fā)生變化，老化的前列腺成纖維細胞能夠通過旁分泌途徑促進癌前及癌性上皮細胞的生長[14-15]。在腫瘤相關(guān)成纖維細胞老化與活化關(guān)聯(lián)的進一步研究中發(fā)現(xiàn)，隨著時間推移，成纖維細胞老化的刺激參與誘導(dǎo)成肌纖維細胞的分化，這在腫瘤進展中有促進作用[14-16]。也有研究從人體前列腺癌組織中分離出的表現(xiàn)為老化特點的腫瘤相關(guān)成纖維細胞似乎仍處于較為活化的狀態(tài)[17]。本研究認為，在不同時間維度上NEPC腫瘤相關(guān)成纖維細胞基因表達存在差異，我們從24個差異性表達基因中選擇被文獻報道與腫瘤相關(guān)的3個基因來做PCR驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以NKX3-1、ISM1基因為代表的相關(guān)通路基因在本研究中證實在4周組顯著低于2周組，這可能是腫瘤病理進展中對前列腺癌抑制減弱、對腫瘤血管新生抑制減弱，導(dǎo)致前列腺癌生長加快，可能說明隨著腫瘤進展的微環(huán)境中相關(guān)成纖維細胞保護因素被打亂[18-19]。在本研究中亦發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤進展GREM1基因的表達顯著增加，推測其可能通過潛在通路誘導(dǎo)上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)發(fā)生，并促進腫瘤轉(zhuǎn)移和生長[20]。

本研究探討了NEPC相關(guān)成纖維細胞在不同時間維度上基因表達的作用機制，為后續(xù)深一步研究癌相關(guān)成纖維細胞基因在促進NEPC進展方面提供了系統(tǒng)性的實驗基礎(chǔ)，可能為相關(guān)機制研究及作用靶點提供一定的理論依據(jù)。本研究存在諸多不足之處，研究仍處于較為表淺的領(lǐng)域，僅為初步的探索式研究，樣本量較少，在后續(xù)的研究過程設(shè)計中，我們將進一步擴大動物樣本量規(guī)模，研究各個腫瘤進展時間節(jié)點的腫瘤微環(huán)境與腫瘤發(fā)展的相互參與、各個相關(guān)基因通路的相關(guān)性及相互作用，為進一步明確該類特殊類型腫瘤發(fā)生發(fā)展機制及其后期的診治工作新思路、新策略打下基礎(chǔ)。