雄激素受體相互作用因子在前列腺癌中的表達(dá)及其臨床意義

曾衛(wèi)湘，張 穎，張建文，鄧 瓊，梁 輝，張劍波，王 鑄

(1.河源長安醫(yī)院泌尿外科,廣東河源 517000； 2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳龍華醫(yī)院泌尿外科,廣東深圳 518109)

前列腺癌(prostate cancer, PCa)是最常見的男性惡性腫瘤之一[1]。雄激素剝奪治療(androgen deprivation therapy,ADT)可以有效減緩腫瘤進展、提高患者生活質(zhì)量，但是隨著病程進展，激素依賴型轉(zhuǎn)化為去勢抵抗前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)[2-3]。研究表明，多種細(xì)胞因子、激酶以及下游級聯(lián)信號因子通過雄激素受體(androgenreceptor,AR)相互作用或雄激素非依賴途徑促進腫瘤細(xì)胞生長[2]。在低水平激素環(huán)境下其他替代途徑，包括MAPK通路、Wnt/β-catenin以及c-Myc等信號在促進CRPC轉(zhuǎn)化過程中也發(fā)揮重要作用[2, 4]。目前針對AR介導(dǎo)的CRPC轉(zhuǎn)化，人們已開發(fā)了多個靶向藥物，如AR拮抗劑恩雜魯胺、雄激素合成關(guān)鍵酶CYPl7阻斷劑阿比特龍、PARP抑制劑等[5-6]；多靶點藥物如Cabozantinib封閉c-Met、VEGFR2、KIT等多個蛋白[7]；Galeterone同時阻斷AR及CYPl7A1活性[8]，但是針對AR相互作用因子的綜合性研究尚鮮見報道。本研究篩選了AR及其9個相互作用因子，系統(tǒng)分析了AR及其相互作用因子在PCa中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系，揭示了其相互作用及GO功能富集，為PCa進展機制研究及其預(yù)后評估提供了一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 STRING 分析STRING數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/)是一個旨在收集、評估和整合蛋白質(zhì)之間相互作用的網(wǎng)絡(luò)平臺。目前該數(shù)據(jù)庫存儲約14 094個物種的6 760萬個蛋白質(zhì)，有超過20億個蛋白相互作用信息。本研究通過STRING數(shù)據(jù)庫分析AR蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，其中不同顏色連線代表相互作用確定的不同依據(jù)，包括基于認(rèn)證過的數(shù)據(jù)庫、實驗驗證、基因鄰近、共表達(dá)、同源推測和文本挖掘等?；緟?shù)設(shè)置為Interaction score 大于0.4，物種設(shè)定為 Homo sapiens。

1.2 UALCAN 分析UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu)是一個用于分析癌癥組學(xué)數(shù)據(jù)的全面、交互式網(wǎng)絡(luò)平臺。UALCAN可訪問包括TCGA和CBTTC等數(shù)據(jù)庫，可提供諸如描述蛋白質(zhì)編碼、miRNA編碼和lincRNA編碼基因的表達(dá)譜和患者生存信息的圖表和繪圖等功能。本研究利用從癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)項目獲得的數(shù)據(jù)，輸入Prostatecancer，獲得正常對照組樣本52例，腫瘤樣本497例，分別比較分析了AR及其相互作用因子基因在對照組以及腫瘤組中的表達(dá)水平。

1.3 cBioPortal分析cBioPortal(https://www.cbioportal.org/)是基于TCGA數(shù)據(jù)庫，集數(shù)據(jù)挖掘、數(shù)據(jù)整合及可視化的綜合性開放平臺。整合了包括TCGA，GEO和ICGC等腫瘤研究項目。數(shù)據(jù)類型包括體細(xì)胞突變、DNA copy-number alterations(CNAs)、mRNA和microRNA(miRNA)表達(dá)、DNA甲基化、蛋白質(zhì)富集、磷酸化蛋白富集等。本研究以prostatecancer為關(guān)鍵詞提取了全部16個PCa相關(guān)研究的基因測序數(shù)據(jù)，總計5 937例患者的6 222個樣本。分析了AR及其相互作用因子在不同類型PCa樣本中的表達(dá)變異情況及其總生存率。

1.4 GO富集分析GO Term分為3大類，每一類從不同的層面解釋基因的生物學(xué)功能，分別包括生物途徑(biology process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、細(xì)胞組分(cellular component，CC)3部分。橫坐標(biāo)富集指數(shù)為Log10(observed/expected)，表示該GO term的富集強度。使用Benjamini-Hochberg程序?qū)γ總€類別內(nèi)的多次試驗進行校正，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AR及其相互作用因子的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)STRING分析顯示，AR與NCOR1、NCOR2、NCOA2、NRIP1、RAN、EP300、SOX9、PXN以及TNK2的相互作用均經(jīng)過實驗驗證并有相關(guān)文獻(xiàn)驗證(圖1)。其相互作用網(wǎng)絡(luò)節(jié)點為10，邊數(shù)21，平均節(jié)點度4.2，平均局部聚類系數(shù)0.89，預(yù)期邊數(shù)4，PPI富集(P<0.000 1)。

圖1 AR及其相互作用因子的STRING蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.2 AR及其相互作用因子在PCa中的表達(dá)水平UALCAN分析顯示RAN、TNK2、PXN以及NRIP1在前列腺癌組織中顯著上調(diào)表達(dá)(P<0.05)；相反NCOR1在前列腺癌組織中顯著下調(diào)(P<0.05)。NCOR2、NCOA2、EP300、SOX9、RAN表達(dá)水平改變不顯著(圖2)。

A：SOX9；B：RAN；C：TNK2；D：EP300；E：PXN；F：NRIP1; G：NCOR2；H：NCOR1；I：NCOA2；J：AR。圖2 AR及其相互作用因子在PCa中的表達(dá)

2.3 AR及相互作用因子在不同PCa類型中的變異結(jié)果表明，在近30%的各類PCa樣本中存在AR及其相互作用因子的表達(dá)變異，主要包括基因擴增、基因突變、深度缺失以及多重變異4個類型。其中AR的變異率為18%，主要包括基因擴增和突變。NCOA2的變異率為9%，主要變異類型為基因擴增。在神經(jīng)內(nèi)分泌前列腺癌中的變異類型主要表現(xiàn)為基因擴增(8.7%)，而在CRPC中則主要表現(xiàn)為基因突變(11.43%，圖3)。

圖3 AR及其相互作用因子在PCa中的表達(dá)變異分析

2.4 AR及其相互作用因子在不同PCa類型中的表達(dá)變異及對預(yù)后的影響cBioPortal結(jié)果表明，AR的主要變異類型是基因擴增和突變。其中突變主要發(fā)生在CRPC：NCOR1突變主要存在于NEPC，而PXN主要存在于CRPC；NCOA2的主要變異類型為基因擴增，主要發(fā)生于PCa。其中AR、TNK2、NCOR1、PXN、NCOA2表達(dá)異常對患者總生存率均存在顯著影響(圖4)。

2.5 AR及其相互作用因子變異組對PCa預(yù)后的影響結(jié)果顯示AR及其相互作用因子變異的PCa總生存率顯著下降，變異組(n=95)的中位生存期為70個月(95%CI，60～105個月)，而未變異組(n=45)的中位生存期為141個月(95%CI，115.13～NA個月)(P<0.001)(圖5A)；變異組(n=22)無病生存期110.16個月[95%CI，64.66個月未觀察到(not available, NA)]，未變異組(n=93)無病生存期NA，P=0.010 2(圖5B)。

A：AR；B：TNK2；C：NCOR1；D：NCOA2；E：PXN圖4 AR及其相互作用因子在不同前列腺癌類型中的變異情況及其對總生存期的影響

A：總生存期分析；B：無病生存期分析圖5 綜合分析AR及其相互作用因子變異與前列腺癌預(yù)后關(guān)系

2.6 AR及其相互作用因子的GO富集見圖6。

圖6 AR及其相互作用因子GO富集分析

GO富集分析顯示前列腺生長時pre-mRNA內(nèi)含子結(jié)合以及組蛋白脫乙酰酶復(fù)合物具有最高的富集指數(shù)。其中，AR和SOX9與前列腺生長有關(guān)，SOX9和EP300與pre-mRNA內(nèi)含子結(jié)合有關(guān)，而NCOR1、NRIP1以及NCOR2與組蛋白脫乙酰酶復(fù)合物相關(guān)(圖6)。

3 討 論

AR信號通路的異?；罨徽J(rèn)為是PCa進展及復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素[9]。研究認(rèn)為CRPC進展機制可概括為AR依賴型和AR非依賴型兩種[10]。AR蛋白作為網(wǎng)絡(luò)的一個節(jié)點，在接受抗AR藥物阻斷后，網(wǎng)絡(luò)中其他蛋白的信號仍然能夠通過其他節(jié)點和途徑進行傳導(dǎo)[4]。除了經(jīng)典的AR信號通路外，AR旁路以及替代途徑是目前研究的難點和熱點。目前的研究以及藥物開發(fā)靶點多集中在阻斷AR信號或者雄激素合成途徑，但是針對AR相互作用因子的檢測或者治療靶點研究較少，尤其是AR相互作用因子的綜合性研究尚鮮見報道。

本研究系統(tǒng)地分析了AR及其9個相互作用蛋白分子在PCa中的表達(dá)、相互作用及其對PCa預(yù)后的影響。研究發(fā)現(xiàn)NRIP1、TNK2、PXN、RAN 4個蛋白在PCa組織中顯著上調(diào)表達(dá)，NCOR1顯著下調(diào)表達(dá)；TNK2、PXN以及NCOR1的表達(dá)改變均顯著降低總生存率。TNK2作為非受體酪氨酸蛋白和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過磷酸化AR的pTyr(267)位點，促進腫瘤細(xì)胞擴散和遷移、細(xì)胞存活、細(xì)胞生長和增殖[11]。有研究認(rèn)為通過TNK2抑制劑阻斷TNK2，使恩扎魯胺的PCa細(xì)胞致敏，并降低AR和AR-V7水平，可以有效減緩CRPC腫瘤的生長[12]；TNK2阻斷有望成為靶向PCa干細(xì)胞(prostate cancer stem cell, PCSC)的一種新的治療方法[13]；PXN作為核外MAPK信號與雄激素以及生長因子調(diào)控的核轉(zhuǎn)錄事件之間的關(guān)鍵蛋白，是影響PCa去勢敏感和去勢抵抗的關(guān)鍵因子[14-15]；NCOR1參與PCa細(xì)胞線粒體膜電位的維持，NCOR1的低表達(dá)有助于PCa的進展[16-17]。因此，靶向TNK2、PXN以及NCOR1在內(nèi)的AR相互作用因子有望作為ADT治療的有益補充，進一步減緩CRPC進展。

本研究將AR及其9個相互作用因子的表達(dá)及變異進行了綜合分析，發(fā)現(xiàn)其在PCa中的變異類型主要為基因擴增和基因突變，而且顯著降低總生存率以及無病生存期。因此，AR及其相互作用因子的表達(dá)及變異有可能作為一個有效指標(biāo)用來評估PCa的進展及其預(yù)后。另外，將AR及其相互作用因子綜合分析其GO功能富集，發(fā)現(xiàn)富集指數(shù)最高的是與前列腺生長相關(guān)的pre-mRNA內(nèi)含子結(jié)合以及組蛋白脫乙酰酶復(fù)合物等功能。其中，AR和SOX9參與前列腺細(xì)胞生長調(diào)控，SOX9和EP300與pre-mRNA內(nèi)含子結(jié)合有關(guān)；而NCOR1、NRIP1以及NCOR2與組蛋白脫乙酰酶復(fù)合物相關(guān)。有研究表明組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HATs)和組蛋白脫乙?；?HDACs)催化的蛋白質(zhì)乙酰化是基因轉(zhuǎn)錄的主要表觀遺傳調(diào)控機制[18]，因此NCOR1、NCOR2以及NRIP1可能參與了CRPC表觀遺傳調(diào)控過程。

綜上所述，AR相互作用因子有望作為AR之外的候選靶點，通過小分子抑制劑阻斷AR相互作用因子可作為ADT治療手段的有益補充；AR及其相互作用因子的綜合分析也為揭示CRPC進展的分子機制提供了一定的依據(jù)。但是本研究也存在一定的局限性，分析的樣本數(shù)據(jù)來源多個項目研究或者多個數(shù)據(jù)庫，不同研究在數(shù)據(jù)采集和處理方面可能存在一定的差異；研究結(jié)論有待實驗研究和大規(guī)模臨床數(shù)據(jù)進一步的驗證。