基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)研究β-細(xì)辛醚治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的作用機(jī)制

黃冠又 侯小紅 張 欣 甘鴻川

(貴州醫(yī)科大學(xué) 附屬金陽醫(yī)院[貴陽市第二人民醫(yī)院] 神經(jīng)外科， 貴州 貴陽 550081)

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)是膠質(zhì)瘤最主要的病理類型，為Ⅳ級(jí)高級(jí)別膠質(zhì)瘤，約占48.6%[1]。目前GBM標(biāo)準(zhǔn)治療方案主要包括安全有效的最大范圍手術(shù)切除后同步放化療和替莫唑胺輔助化療[2]。由于腫瘤抗原異質(zhì)性，化療存在血腦屏障、耐藥性和放療抵抗等因素，GBM的治療仍面臨巨大挑戰(zhàn)[3]。因此，深入了解膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的特點(diǎn)和分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的分子標(biāo)記物，尋找安全、毒性小的治療藥物對(duì)于治療GBM具有重要意義。

中藥石菖蒲具有化濕開胃、開竅醒神功效，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有興奮、抑制雙重調(diào)節(jié)作用，具有抗腫瘤、增強(qiáng)記憶力、益智等多種顯著藥理作用[4]。β-細(xì)辛醚(β-asarone)是石菖蒲的主要有效成分，研究報(bào)道β-asarone在膠質(zhì)瘤[5]、肺癌[6]、胃癌[7]等惡性腫瘤中具有抑制細(xì)胞增殖的作用，并且對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病、抑郁癥、腦梗死、癲癇等都有一定的治療效果[4]。本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法預(yù)測(cè)β-asarone的作用靶點(diǎn)和機(jī)制，以期為β-asarone治療GBM提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物-疾病共同靶點(diǎn)篩選

在Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi. nlm.nih.gov/)檢索β-細(xì)辛醚(β-asarone)的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)，以Norm Fit>0進(jìn)行靶點(diǎn)篩選，將β-asarone結(jié)構(gòu)輸入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swisstargetprediction.ch/)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。在OMIM(https://omim.org/)、Disgenet(https://www.disgenet. org/)、Genecards(https://www.genecards.org/)等數(shù)據(jù)庫(kù)中，選擇物種為“Homo sapiens”，在數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入疾病名稱“glioblastoma”，查找并下載與GBM相關(guān)的基因和靶點(diǎn)。根據(jù)檢索到的相關(guān)藥物-疾病靶點(diǎn)使用Venny 2.1在線作圖工具篩選GBM潛在作用靶點(diǎn)。

1.2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)、成分-作用靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將β-asarone與GBM作用靶點(diǎn)輸入STRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction, PPI)分析，輸入Cytoscape 3.8.2軟件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，篩選自由度(degree)值較高(值越大表明其生物功能越多)的關(guān)鍵基因，以排名前20的基因作為β-asarone治療GBM的關(guān)鍵基因。

1.3 靶點(diǎn)功能通路富集分析

使用Bioconductor生物信息軟件包(http://www.bioconductor.org/)以P<0.05為條件進(jìn)行關(guān)鍵靶基因的基因本體生物過程富集[8]和(kyto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路功能富集分析[9]，得到β-asarone發(fā)揮抗腫瘤作用參與的GO功能和信號(hào)通路。

1.4 成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接

從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)下載核心靶點(diǎn)蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)，應(yīng)用Pymol 2.3.4軟件插件找到對(duì)接活性位點(diǎn)，去除水分子和原配體。在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)搜索β-asarone的3D結(jié)構(gòu)信息，然后導(dǎo)入PubChem最小能量化，利用OpenBabel 3.0軟件轉(zhuǎn)化為pdb格式。最后將得到的蛋白結(jié)構(gòu)(受體)及β-asarone結(jié)構(gòu)運(yùn)用Autodock 1.1.2軟件進(jìn)行分子對(duì)接，用Pymol 2.3.4軟件將對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 β-asarone作用靶點(diǎn)篩選結(jié)果

在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行β-asarone成分的作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)和篩選，共獲得294個(gè)靶點(diǎn)?；贠MIM、Disgenet、Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，共獲得疾病靶點(diǎn)759個(gè)。通過Venny 2.1在線軟件作圖工具繪制韋恩圖，篩選后獲得藥物-疾病共同靶點(diǎn)38個(gè)(見圖1)。

圖1 β-細(xì)辛醚與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤共同靶點(diǎn)韋恩圖

2.2 疾病-靶點(diǎn)-成分網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在Cytoscape 3.8.2軟件中，繪制出“疾病-靶點(diǎn)-成分”相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2A)。圖中紫色代表β-asarone，藍(lán)色代表38個(gè)共同靶點(diǎn)，紅色代表疾病(膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

將上述38個(gè)靶點(diǎn)輸入到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，將靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2B)。其中節(jié)點(diǎn)表示蛋白，degree表示連接到節(jié)點(diǎn)的線條數(shù)，線條越多表示蛋白與蛋白間的關(guān)聯(lián)度越大，紅色節(jié)點(diǎn)degree表示其關(guān)聯(lián)度較大(生物功能較多)。由圖可示，HRAS、CASP3、AKT1、SRC、CCND1、HSP90AA1、EGFR、MAP2K1、CDK2、CDK4、STAT1等靶點(diǎn)的degree值較高，在PPI網(wǎng)絡(luò)中起著重要的聯(lián)系作用。

2.4 核心靶點(diǎn)篩選

將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2中，對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯骄鵧egree值為18，以degree>18為條件篩選核心靶點(diǎn)，靶點(diǎn)degree值較高，表明其可能在β-asarone治療GBM中發(fā)揮重要作用。degree值排名最高的前幾位靶點(diǎn)有AKT1、CASP3、HRAS、SRC等(見圖2C)。

注： A：疾病-靶點(diǎn)-成分相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖； B：蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖； C：基于PPI拓?fù)浞治龅暮诵陌悬c(diǎn)排序圖2 β-細(xì)辛醚治療GBM的潛在靶點(diǎn)

2.5 富集分析

對(duì)38個(gè)共有靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能及KEGG通路富集分析。以P<0.05篩選GO生物過程的前20條通路進(jìn)行展示，如圖3所示。結(jié)果顯示，發(fā)現(xiàn)共有靶點(diǎn)可能調(diào)控了蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的正性調(diào)節(jié)、肽基絲氨酸修飾、細(xì)胞對(duì)化學(xué)壓力的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、上皮細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)等生物過程。KEGG信號(hào)通路分析中，選取P值較小的前20條通路(見圖4)，主要涉及PI3K/Akt、癌癥中的蛋白聚糖、Rap1、FoxO等信號(hào)通路。

圖3 β-細(xì)辛醚治療GBM共有靶點(diǎn)GO生物過程分析

圖4 β-細(xì)辛醚治療GBM共有靶點(diǎn)KEGG通路分析

2.6 分子對(duì)接

對(duì)篩選出的核心靶點(diǎn)和基因(CDK2、MAP2K1、AKT1、CASP3、HRAS)進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)果顯示β-asarone與PPI五個(gè)核心靶蛋白結(jié)合能絕對(duì)值均大于4.25 kcal/mol，表示β-asarone和核心蛋白形成的構(gòu)象能量低，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，結(jié)合活性較高。其分子對(duì)接模式見圖5。

注：A：CDK2； B：MAP2K1； C：AKT1； D：CASP3； E：HRAS； HIS-295：組氨酸-295； LYS-97：賴氨酸-97； VAL-211：纈氨酸-211； LEU-347：亮氨酸-347； MET-39：蛋氨酸-39； ARG-68：精氨酸-68； GLN-99：谷氨酰胺-99圖5 β-細(xì)辛醚與核心蛋白分子對(duì)接模式

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，β-asarone能促進(jìn)替莫唑胺(temozolomide，TMZ)進(jìn)入細(xì)胞膜，抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，間接促進(jìn)TMZ對(duì)膠質(zhì)瘤的作用效力，但β-asarone對(duì)GBM的作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對(duì)接技術(shù)分析了β-asarone治療GBM的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)AKT1、CASP3、HRAS、CDK2、MAP2K1等靶點(diǎn)在治療GBM中可能起重要作用。

AKT1的degree值在所有靶點(diǎn)中最高，是絲/蘇氨酸蛋白激酶，能調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的調(diào)控起重要作用[10]。AKT抑制劑可拮抗GBM干細(xì)胞樣細(xì)胞的生長(zhǎng)[11]。特異性靶向抑制AKT1結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)治療方案可能是提高GBM患者生存率的治療策略。

CASP3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。在腫瘤細(xì)胞中，β-asarone可促進(jìn)CASP3的激活。如Wu等[12]研究發(fā)現(xiàn)β-asarone可以通過激活CASP3、CASP8、CASP9等抑制胃癌細(xì)胞的增殖。Li等[5]研究發(fā)現(xiàn)β-asarone通過調(diào)控hnRNP A2/B1相關(guān)信號(hào)通路，增強(qiáng)CASP3的表達(dá)，從而誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，最終阻斷膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的遷移和侵襲。

HRAS基因是與人類腫瘤相關(guān)的RAS基因家族，定位于11號(hào)染色體，RAS基因在膠質(zhì)瘤中可表現(xiàn)為突變和高表達(dá)，其中HRAS的高表達(dá)與膠質(zhì)瘤發(fā)生密切相關(guān)，并與膠質(zhì)瘤惡性程度呈正相關(guān)[13]。

CDK2為絲氨酸/蘇氨酸激酶，屬于CDKs家族。CDK2能促進(jìn)膠質(zhì)瘤侵襲和化療抵抗，上調(diào)的CDK2能維持膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放療抵抗；相比低級(jí)別膠質(zhì)瘤，CDK2在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中表達(dá)水平顯著增高，并且較高的CDK2表達(dá)水平和預(yù)后不良相關(guān)[14]。體外實(shí)驗(yàn)表明，CDK2抑制劑可以降低化療藥替莫唑胺耐藥性，并誘導(dǎo)GBM細(xì)胞凋亡，提示CDK2抑制劑聯(lián)合化療藥物對(duì)GBM的治療具有重要意義[15]。

MAP2K1(又稱MEK1)是一種雙特異性蛋白激酶，能磷酸化ERK中的蘇氨酸和酪氨酸殘基。一項(xiàng)關(guān)于MAP2K1的泛癌研究表明，與正常組織相比，MAP2K1在多種癌癥中過度表達(dá)，生存分析顯示其高表達(dá)患者生存期較低表達(dá)顯著降低[16]。研究表明，MEK抑制劑通過抑制MAPK/ERK通路降低GBM原代細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，動(dòng)物模型中可抑制GBM腫瘤生長(zhǎng)，并能延緩GBM復(fù)發(fā)[17]。

進(jìn)一步對(duì)β-asarone和GBM共同靶點(diǎn)進(jìn)行信號(hào)通路富集分析，發(fā)現(xiàn)共同靶點(diǎn)可能與調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和增殖有關(guān)，包括蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的正性調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、上皮細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶復(fù)合物、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合等。信號(hào)通路上，主要與PI3K/Akt信號(hào)通路、癌癥中的蛋白聚糖、Rap1信號(hào)通路、miRNAs等相關(guān)。

PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期活動(dòng)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)與進(jìn)展，與GBM細(xì)胞增殖、分化、發(fā)展和血管生成密切相關(guān)，IDH野生型GBM在該通路中可見突變[18]。研究表明，部分miRNAs表達(dá)可調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤中PI3K/Akt通路，如miR-579、miR-548和miR-4698通過影響這一途徑抑制GBM的增殖和侵襲，該通路可能成為改善GBM患者生存預(yù)后的一個(gè)有前景的靶點(diǎn)[19]。研究發(fā)現(xiàn)，β-asarone可通過上調(diào)PI3K/Akt磷酸化水平促進(jìn)NRF2和HO-1表達(dá)，并通過該通路抑制氧化應(yīng)激[20]。還有研究表明，β-asarone對(duì)胃癌細(xì)胞裸鼠移植瘤有一定增殖抑制作用，可能與β-asarone通過抑制PI3K/Akt通路抑制胃癌EMT有關(guān)[21]。上述研究表明β-asarone可靶向調(diào)控PI3K/Akt通路，抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)AKT1、CASP3、HRAS、CDK2和MAP2K1等可能是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的核心治療靶點(diǎn)，PI3K/Akt、Rap1、miRNAs等可能是其主要作用通路。本研究存在一定局限性，只對(duì)石菖蒲的主要成分β-asarone進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘分析。今后為更好地應(yīng)用中草藥治療GBM，需要進(jìn)一步深入研究石菖蒲更多有效成分，對(duì)藥物作用靶點(diǎn)以及藥物通過哪條信號(hào)通路發(fā)揮藥效進(jìn)行更深入研究，同時(shí)需要后期基礎(chǔ)和臨床研究進(jìn)一步證實(shí)。