空間代謝組學在經(jīng)脈臟腑相關(guān)研究中應(yīng)用思考

吳昊晟,蘇 航,朱 超，王文慧，崔 帥，王 堃，周美啟

(1.安徽中醫(yī)藥大學，安徽 合肥 230012；2.新安醫(yī)學教育部重點實驗室，安徽 合肥 230012；3.安徽省中醫(yī)藥科學院亳州中醫(yī)藥研究所，安徽 亳州 236800)

經(jīng)脈臟腑相關(guān)理論是中醫(yī)針灸理論體系的核心，而經(jīng)脈臟腑與神經(jīng)系統(tǒng)之間的聯(lián)系與研究可能是該理論研究的核心和重要突破口[1-2]。利用組學方法，發(fā)現(xiàn)研究過程中相關(guān)分子和路徑的改變，是研究生理和病理狀態(tài)下經(jīng)脈臟腑相關(guān)理論的重要切入點。

空間代謝組學是一種能直接從生物組織或器官中獲取代謝物分子的結(jié)構(gòu)、含量及其空間分布的信息，描繪代謝網(wǎng)絡(luò)圖的研究方法。該方法具有靈敏度高、分辨率高、覆蓋率高的特點，將成為生物醫(yī)學領(lǐng)域研究的有力工具。

從目前已有的研究看，空間代謝組學在疾病分子機制、生物標志物篩查以及中藥成分靶向性研究等方面已取得了一定的成果?，F(xiàn)對空間代謝組學的前沿技術(shù)及其在生物醫(yī)學領(lǐng)域研究中的應(yīng)用進行分析，以探討該方法運用于經(jīng)脈臟腑相關(guān)研究中的思路。

1 空間代謝組學及其優(yōu)勢

空間代謝組學是近年來興起的一種研究方法，由質(zhì)譜成像聯(lián)合代謝組學組成。該方法利用一種新型的分子影像技術(shù)——空氣動力輔助離子化解吸電噴霧電離質(zhì)譜成像技術(shù)(air flow-assisted desorption electrospray ionization-mass spectrometry imaging, AFAI-MSI)，彌補了傳統(tǒng)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)中組織空間分布信息丟失的局限性，充分解決了微區(qū)異質(zhì)性的問題。

以繪制大鼠腦內(nèi)的微區(qū)分布代謝網(wǎng)絡(luò)圖為例[3]。實驗研究步驟依次為：將完整腦組織取出，經(jīng)冰凍切片后，貼于正電荷載玻片上；利用AFAI-MSI技術(shù)將噴出的高速帶電液滴逐點轟擊待測切片，使代謝物進行解吸和電離，離子化的代謝物被吸入質(zhì)譜分析器進行檢測，固定在承載平面的切片連續(xù)移動，不斷進行二維掃描，記錄每個位置點上的質(zhì)譜信號強度，可以獲得樣本表面的分子及其含量，并通過軟件重構(gòu)，將質(zhì)譜峰的信號強度按位置進行關(guān)聯(lián)還原，最后對大腦中的復雜代謝網(wǎng)絡(luò)進行可視化處理。

傳統(tǒng)代謝組學由于技術(shù)方法等層面的原因，在經(jīng)脈臟腑與腦相關(guān)的研究中有著不同程度的局限性[4]，與傳統(tǒng)代謝組學相比較，空間代謝組學的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在3個方面。第一，空間代謝組學操作簡單。傳統(tǒng)代謝組學要進行組織勻漿、代謝物提取等預處理，以及固相微萃取、固相萃取等復雜的純化和富集操作[5]。預處理的差異可能會導致檢測結(jié)果不準確，而空間代謝組學在檢測前不需要對樣本進行特異性標記及復雜的預處理，取材后即包埋。第二，空間代謝組學適用廣泛。傳統(tǒng)代謝組學常運用的核磁共振技術(shù)檢測靈敏度較低，檢測動態(tài)范圍窄，很難同時檢測到生物系統(tǒng)中高通量差異較大的代謝產(chǎn)物。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)只適用于易揮發(fā)且穩(wěn)定性差的樣本[6]?？臻g代謝組學能及時發(fā)現(xiàn)某些代謝途徑中明顯變化的代謝物，檢測范圍廣泛，靈敏度高，能夠檢測出上千種代謝物。第三，空間代謝組學具有空間識別功能。傳統(tǒng)代謝組學常用的LC-MS僅能對代謝物進行質(zhì)和量的檢測，預處理過程容易導致代謝物在組織器官中的空間分布信息缺失，而這種空間信息對于針灸作用的整體效應(yīng)研究十分重要?？臻g代謝組學能夠描繪出與研究目標直接相關(guān)微區(qū)中發(fā)生變化的具體位置，將代謝組學信息從二維層面上升到三維層面，提供分子空間分布信息，為針灸研究提供了可視化的數(shù)據(jù)信息。

2 空間代謝組學在生物醫(yī)學研究中的運用

空間代謝組學在生物醫(yī)學領(lǐng)域能夠有效解決空間分布差異或結(jié)構(gòu)差異相關(guān)的問題，在腫瘤代謝的生物標志物篩查、構(gòu)建代謝過程分布網(wǎng)絡(luò)圖、闡明藥物作用機制等方面已有不少成果。

空間代謝組學在研究中可以直接定位極性代謝物，并構(gòu)建可視化腦內(nèi)特定區(qū)域代謝改變過程。Pang等[7]利用空間代謝組學分析的空間分辨信息，發(fā)現(xiàn)了大腦微區(qū)代謝環(huán)境及其變化過程，并繪制出腦內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)圖，簡便地顯示了極性代謝物的分布信息和大鼠腦切片的圖像，發(fā)現(xiàn)了乙酰膽堿、γ-氨基丁酸等代謝物的含量變化及空間定位，以及谷氨酸代謝、嘌呤代謝等多個代謝物的代謝途徑，并對東莨菪堿治療組大鼠的腦矢狀面切片進行分析，發(fā)現(xiàn)東莨菪堿治療阿爾茨海默病模型中涉及的代謝紊亂的大腦微區(qū)。另外， Huo等[8]運用空間代謝組學對糖尿病腦病大鼠大腦中的區(qū)域特異性代謝紊亂進行研究，篩選出19種與糖酵解和磷酸戊糖途徑有關(guān)的代謝差異物，首次在糖尿病腦病大鼠腦中同時鑒定和定位膽堿代謝過程，并發(fā)現(xiàn)了該病理過程中存在線粒體代謝功能障礙，腺苷能、谷氨酸能、多巴胺能、膽堿能和組胺系統(tǒng)功能失調(diào)，抗氧化系統(tǒng)以及脂質(zhì)代謝紊亂。這些都從一定層面上證明了空間代謝組學在中樞神經(jīng)系統(tǒng)研究中的應(yīng)用前景，為其在經(jīng)脈臟腑相關(guān)與腦的研究中提供了技術(shù)層面的可行性。

代謝過程是空間代謝組學研究的重要內(nèi)容。代謝是生物體內(nèi)進行物質(zhì)、能量交換以維持生長、發(fā)育、繁殖和適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境的一種基本過程。Sun等[9]使用空間代謝組學的方法發(fā)現(xiàn)了大量腫瘤相關(guān)的候選代謝物和代謝酶在分子水平上的變化情況，特別是對含量較小的功能性代謝酶也能夠進行有效監(jiān)測，最終發(fā)現(xiàn)吡咯烷-5羧酸還原酶2和尿苷磷酸化酶1在食管癌中發(fā)生了改變，有助于發(fā)現(xiàn)食管癌治療的潛在代謝靶點。Guo等[10]運用空間代謝組學研究了原癌基因MYC促進腫瘤發(fā)生的機制，發(fā)現(xiàn)MYC可以與膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1協(xié)同調(diào)節(jié)脂質(zhì)生成。

空間代謝組學在藥物作用機制或毒理作用、腫瘤病理機制及診斷分子基礎(chǔ)、神經(jīng)系統(tǒng)組織微區(qū)代謝物的時空分布特征等研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，充分說明了其使用的優(yōu)勢和應(yīng)用前景。

3 經(jīng)脈臟腑相關(guān)的研究現(xiàn)狀

經(jīng)脈臟腑相關(guān)理論，是研究經(jīng)脈腧穴與臟腑之間的雙向聯(lián)系的理論。該理論發(fā)展經(jīng)歷了3個階段[11]，不斷更新的理論觀點使經(jīng)脈臟腑相關(guān)研究方向更加清晰。直至今日，經(jīng)脈臟腑相關(guān)研究普遍被認為是基于神經(jīng)系統(tǒng)作用而展開的，包括軀體神經(jīng)系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)等方面，特別是從腦神經(jīng)科學入手研究針刺經(jīng)脈腧穴的作用機制是目前的主要方向[12]。

以針刺心經(jīng)治療急性心肌缺血的機制研究為例，目前常用的方法有3個方面。①從神經(jīng)化學角度，多種化學物質(zhì)將針刺信息轉(zhuǎn)化為神經(jīng)沖動，并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)進行傳遞。通過檢測針刺前后中樞特定核團中神經(jīng)遞質(zhì)的含量變化，以揭示針刺通過神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮調(diào)控的實質(zhì)。急性心肌缺血可引起海馬激活，海馬CA1區(qū)和齒狀回(dentate gyrus,DG)釋放大量去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)引起交感神經(jīng)過度興奮，DG區(qū)抑制多巴胺(dopamine,DA)和5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)的分泌，造成心功能紊亂，而通過針刺可以降低海馬中NE含量，升高DA和5-HT含量來拮抗交感神經(jīng)過度興奮，從而保護心肌組織[13]。②從神經(jīng)生理角度，針刺可以激活中樞神經(jīng)傳導整合針刺信號以發(fā)揮不同層面的調(diào)控作用。研究者通過電生理和病毒示蹤的方法證實了以海馬為中心的“海馬-室旁核-交感神經(jīng)”“海馬-孤束核-迷走神經(jīng)”上行通路[14-15]以及“藍斑核-海馬” “內(nèi)側(cè)隔核-海馬”的下行神經(jīng)通路[15]，從結(jié)構(gòu)和功能上證實了這些通路在心肌缺血的經(jīng)脈臟腑相關(guān)研究中具有不可或缺的作用。③從分子生物學角度，針刺可減少病變區(qū)域炎性病變和細胞凋亡。心肌缺血常伴有海馬區(qū)炎癥反應(yīng)和神經(jīng)細胞凋亡，進而導致交感神經(jīng)興奮性增強，加重心肌損害，針刺能夠有效降低CA1區(qū)白細胞介素(interleukin，IL)-6、IL-1β和腫瘤壞死因子等炎癥因子水平，發(fā)揮改善心肌缺血作用[17]。

4 空間代謝組學在經(jīng)脈臟腑相關(guān)研究中應(yīng)用的思路探討

經(jīng)脈臟腑與腦相關(guān)是經(jīng)絡(luò)理論和針灸基礎(chǔ)研究的重要方向之一，運用先進的科學技術(shù)是進行經(jīng)脈臟腑與腦相關(guān)研究的重要手段[18-19]。空間代謝組學在針灸研究方面有著巨大優(yōu)勢，能夠從代謝功能、立體結(jié)構(gòu)兩個層面為經(jīng)脈臟腑相關(guān)研究提供新思路，很有可能像免疫熒光染色、透射電子顯微鏡或者激光共聚焦成像等技術(shù)一樣運用于經(jīng)脈臟腑相關(guān)研究，極大地豐富經(jīng)脈臟腑相關(guān)研究的方法和手段，使經(jīng)脈臟腑與腦相關(guān)的研究更全面、更直觀、更立體。

4.1 通過篩選目標核團構(gòu)建腦區(qū)圖譜 在以往經(jīng)脈臟腑相關(guān)的研究過程中，篩選目標核團的第一種思路是針對與疾病或其病理機制相關(guān)的核團進行篩選，通過觀察模型組與針刺組的相關(guān)核團c-fos表達情況，并調(diào)控該核團以驗證其是否參與針刺過程。第二種思路是以已研究核團為中心，通過病毒示蹤技術(shù)發(fā)散性構(gòu)建一個相互投射、連接的中樞神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。第三種思路是利用功能磁共振成像篩選目標核團[20-21]，采集針刺治療的任務(wù)態(tài)與靜息態(tài)的信息，進行對比分析，找到針刺有效調(diào)節(jié)腦功能活動的位置。

在神經(jīng)細胞信號傳遞的過程中，不僅有神經(jīng)細胞自身的電信號發(fā)揮作用，還需要依靠神經(jīng)細胞間的化學信號，當一個神經(jīng)細胞受到信號刺激時，產(chǎn)生動作電位向突觸傳遞，儲存在突觸前囊泡中的神經(jīng)遞質(zhì)釋放到突觸間隙，作用于下一神經(jīng)細胞突觸后膜相應(yīng)的受體，將信號傳遞下去?？梢姡窠?jīng)遞質(zhì)的釋放在信息傳遞過程中有著不可或缺的作用。將空間代謝組學的方法運用于經(jīng)脈臟腑相關(guān)的研究中，通過比較模型組與治療組動物腦組織的代謝變化，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)遞質(zhì)顯著改變之處，結(jié)合腦切片c-fos表達情況加以驗證，確定針刺刺激以后明顯激活的腦區(qū)位置，最終從結(jié)構(gòu)和功能兩個層面說明針刺激活的核團及神經(jīng)通路，以揭示針刺介導的中樞調(diào)控實質(zhì)及神經(jīng)遞質(zhì)的代謝過程。這種方法能夠全面篩選目標核團，構(gòu)建腦微區(qū)圖譜，尤其是能夠準確判斷極小的核團不同亞功能分區(qū)中的微量變化，有利于精準定位，篩選目標核團的通道路徑，進而探討相關(guān)經(jīng)脈穴位的中樞作用機制與特異性，為進一步研究提供理論依據(jù)。

4.2 從分子層面驗證分析代謝過程 經(jīng)脈臟腑相關(guān)理論認為，針刺通過調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的內(nèi)源性小分子代謝物發(fā)揮影響，而這些小分子代謝物則是疾病發(fā)生發(fā)展過程中必不可少的靶點或標志物。在此過程中，針刺能夠調(diào)節(jié)相關(guān)核團中神經(jīng)遞質(zhì)和生物活性物質(zhì)，使能量和神經(jīng)細胞活性恢復正常。目前，常使用酶聯(lián)免疫法[22-23]測定待測核團內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)，該方法操作簡單，但需要精準定位目標核團，將待測核團分離出來，對操作者的要求較高。另一種是運用微透析[24-26]方法進行測定，通過在目標核團埋置探針套管，灌流人工腦脊液，采集透析液來檢測分析神經(jīng)遞質(zhì)的含量，但同一只動物檢測位點有限，不能同時大范圍檢測。此外，微透析樣品是小分子的親水性代謝物，標志物是相對較大分子或相對疏水性物質(zhì)時，在采樣過程中可能被排除。空間代謝組學法操作更簡單，不需要復雜的埋管、灌流采集等程序，檢測范圍也更寬闊，不僅可以非靶向性地檢測代謝紊亂過程，還能夠明確顯示具體神經(jīng)遞質(zhì)和生物活性物質(zhì)定性和定量的變化過程以及空間定位信息，并能利用京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫對代謝通路進行富集分析，顯示差異代謝通路，有助于從分子層面全面分析腦區(qū)代謝過程，從結(jié)構(gòu)到功能進行深入研究。

4.3 為針灸量效關(guān)系提供客觀依據(jù) 針灸量效關(guān)系是針灸的本質(zhì)特征，是針灸療效的關(guān)鍵因素[27]。代謝是生物體必不可少的過程，在針灸過程中其代謝物的變化是代謝過程的體現(xiàn)，針灸通過“神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)”對機體生理病理過程進行調(diào)節(jié)，必然伴隨著內(nèi)源性代謝物或生物標志物的變化，通過代謝物變化可以量化評價針灸調(diào)節(jié)臟腑的療效。通過對比分析是否使用針灸，或不同針灸穴位，或不同針灸劑量的相應(yīng)內(nèi)源性代謝物的時效變化過程，進而確定腧穴、刺激量、療效三者之間的關(guān)系?？臻g代謝組學通過揭示不同穴位和針灸劑量與神經(jīng)系統(tǒng)中相應(yīng)代謝過程和代謝物變化之間的作用，篩選出針灸調(diào)節(jié)的代謝通路和潛在生物標記物，從分子生物學角度闡釋針灸的作用機制，為針灸的標準化提供客觀依據(jù)。

運用空間代謝組學研究經(jīng)脈臟腑相關(guān)過程中神經(jīng)系統(tǒng)代謝變化，能夠有效研究經(jīng)脈臟腑與中樞調(diào)控機制之間的關(guān)聯(lián)，并能為經(jīng)脈的特異性治療作用提供循證依據(jù)。

5 結(jié)語

盡管空間代謝組學在經(jīng)脈臟腑相關(guān)研究中有較大的優(yōu)勢，但仍面臨著許多亟待解決的問題。第一，空間代謝組學技術(shù)在國內(nèi)尚未完全普及，該技術(shù)需要耗費一定的時間和資金，若不能嚴格把控檢測質(zhì)量，將會浪費大量科研資源。第二，雖然空間代謝組學檢測范圍涉及1 500多種小分子代謝物，但不能識別標準代謝物以外的新代謝物和檢測大分子蛋白，如該方法難以檢測經(jīng)脈臟腑相關(guān)實驗中的常用指標c-fos蛋白，使得篩選核團時需結(jié)合腦切片c-fos表達情況。第三，樣本的個體差異、復制模型的差異以及針灸劑量的差異會引起代謝物定量的失準，故建立完善的模型復制和治療標準極為重要。第四，取材時代謝過程停止，空間代謝組學只檢查該時刻樣本代謝物的定位和含量水平，因此，把控兩組之間的取材時間非常重要，取材時間不同會導致結(jié)果的差異。另外，這一特點也決定了研究者不能夠?qū)崟r動態(tài)地監(jiān)測代謝物變化過程。

目前，空間代謝組學在經(jīng)脈臟腑相關(guān)的研究中應(yīng)用還較少，隨著該技術(shù)方法的逐漸成熟，利用空間代謝組學從分子生物學、神經(jīng)生物學等多角度，腧穴、刺激量、療效等多層面，建立系統(tǒng)的經(jīng)脈臟腑相關(guān)研究方法，為針灸標準化提供依據(jù)?？臻g代謝組學具有空間定位的特點，可以促進分子生物學和神經(jīng)生物學之間的立體交叉研究，使二者相互融合印證，從“結(jié)構(gòu)-功能”角度幫助研究核團的電活動及神經(jīng)遞質(zhì)的變化過程，更深層次地進行經(jīng)脈臟腑相關(guān)研究。