大鼠耳蝸核團(tuán)向前庭終末器官的神經(jīng)投射研究

劉宏建 黃 瑋（通訊作者） 孫衛(wèi)國 王廣科 馬 崧 方志慧

1）河南省人民醫(yī)院耳鼻喉科 鄭州 450003 2）河南省醫(yī)學(xué)情報(bào)研究所 鄭州 450003 3）鄭州大學(xué)解剖學(xué)教研室 鄭州 450052

臨床發(fā)現(xiàn)，一些病人在前庭神經(jīng)切斷術(shù)后出現(xiàn)耳鳴性質(zhì)的改變，或耳蝸神經(jīng)切斷后出現(xiàn)眩暈或眼震，這些現(xiàn)象提示前庭神經(jīng)系統(tǒng)和耳蝸神經(jīng)系統(tǒng)可能存在著解剖上的連接［1-2］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在前庭上神經(jīng)束中有大量的纖維對純音刺激有靜息電位的改變［3］。上述臨床現(xiàn)象和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示耳蝸系統(tǒng)和前庭系統(tǒng)可能存在著相互的神經(jīng)纖維投射。本實(shí)驗(yàn)擬研究Wistar大鼠耳蝸核團(tuán)是否存在向前庭終末器官的傳出神經(jīng)投射。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康Wistar大鼠20只，雄性，體質(zhì)量（290±5）g。分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組10只。10只動(dòng)物在腦干耳蝸核團(tuán)注射綠色順行熒光示蹤劑PHA-L，10只動(dòng)物在腦干耳蝸核團(tuán)注射生理鹽水作為對照。5d后處死動(dòng)物，獲取耳蝸和前庭外周器官，EDTA 脫鈣后行迷路連續(xù)冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察熒光細(xì)胞在前庭外周器官的分布。順行熒光神經(jīng)示蹤劑Lectin PHA-L Conjugates（PHA-L，Invitrogen L-11270），1mg溶于1mL 無菌去離子水中，內(nèi)含Alexa Fluor 488，其吸收波長／發(fā)射波長為495nm／519nm，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器：小動(dòng)物腦立體定位儀：江灣一型，國產(chǎn)。熒光顯微鏡：Leica DMR，德國。激光共聚焦顯微鏡：Leica DMIRZ2，德國。

1.1.3 耳蝸核團(tuán)的定位方法：由于290克的成年Wistar大鼠腦已經(jīng)發(fā)育成熟，可在圖譜中直接讀出耳蝸核團(tuán)的坐標(biāo)范圍［3］。

1.2 耳蝸核團(tuán)示蹤劑PHA-L注射法 大鼠麻醉后，調(diào)節(jié)動(dòng)物腦立體定位儀將定位儀兩側(cè)的耳桿插入大鼠外耳道骨部并刺破鼓膜，保持大鼠顱頂處于水平面上，將大鼠頭部水平的固定于腦立體定位儀上。切開皮膚及皮下組織及顱頂骨膜后，充分止血并顯露前后囟，調(diào)整高度使前后囟處于同一水平上。以前囟為基準(zhǔn)點(diǎn)，確定各結(jié)構(gòu)在顱頂部的垂直投影點(diǎn)，并在相應(yīng)顱骨處鉆直徑約4mm 的孔，直至暴露硬腦膜。小心剪開并翻起硬腦膜，根據(jù)耳蝸核團(tuán)的坐標(biāo)，將一端連接0.5μL微量注射器內(nèi)充注射藥物的玻璃電極緩慢的插入耳蝸核團(tuán)內(nèi)。調(diào)整微泵注藥速度為0.01μL／m，將藥物導(dǎo)入大鼠耳蝸核團(tuán)中。在注射后將電極在原位留置5 min，拔除電極后，縫合創(chuàng)口，動(dòng)物置于原環(huán)境中飼養(yǎng)［4-5］。

1.2.1 迷路器官取材和脫鈣：5d后大鼠麻醉，獲取耳蝸和前庭迷路器官，生理鹽水沖洗后放入10%EDTA 液中脫鈣6～10d后連續(xù)冰凍切片。

1.2.2 組織切片的觀察：晾干的切片在常溫下中性樹脂封片，光鏡、熒光顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果

在Wistar大鼠腦干耳蝸核團(tuán)注射綠色順行熒光示蹤劑PHA-L后在注射同側(cè)聽神經(jīng)和前庭終末器官發(fā)現(xiàn)綠色示蹤劑（見圖1-3），提示在Wistar大鼠耳蝸核團(tuán)存在向前庭終末器官的神經(jīng)投射。

圖1 大鼠腦干耳蝸核團(tuán)注射綠色熒光示蹤劑 （熒光顯微鏡100×）

圖2 大鼠前庭神經(jīng)和終末器官發(fā)現(xiàn)綠色示蹤劑 （熒光顯微鏡40×）

圖3 大鼠前庭神經(jīng)和終末器官發(fā)現(xiàn)綠色示蹤劑 （熒光顯微鏡40×）

3 討論

幾個(gè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)球囊存在向耳蝸核團(tuán)的神經(jīng)纖維投射。有實(shí)驗(yàn)利用辣根過氧化物酶在外周前庭注射后，發(fā)現(xiàn)同側(cè)耳蝸核團(tuán)內(nèi)有明顯的標(biāo)記細(xì)胞，這些神經(jīng)元和神經(jīng)纖維可能是前庭和耳蝸聯(lián)系的形態(tài)基礎(chǔ)［6］。有研究證實(shí)在豚鼠球囊的前后兩部分分別注射辣根過氧化物酶后，發(fā)現(xiàn)球囊的后部分存在向耳蝸核團(tuán)的神經(jīng)投射，而前部分則沒有，這更加精確說明了球囊可能參與了聲音的感知過程［7］。有作者在豚鼠前庭上神經(jīng)和球囊注射辣根過氧化物酶和麥芽凝集素標(biāo)記的辣根過氧化物酶后發(fā)現(xiàn)一個(gè)顯著的神經(jīng)纖維走行如耳蝸的背側(cè)和后腹側(cè)核團(tuán)［8］

本實(shí)驗(yàn)利用順行熒光示蹤劑研究大鼠耳蝸核團(tuán)向前庭終末器官的神經(jīng)投射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在腦干耳蝸核團(tuán)注射綠色順行熒光示蹤劑PHA-L后在聽神經(jīng)和迷路的前庭部分發(fā)現(xiàn)綠色示蹤劑。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)Wistar大鼠耳蝸核團(tuán)和前庭終末器官存在相互的神經(jīng)聯(lián)系。

有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，耳蝸同樣也存在向前庭內(nèi)側(cè)核團(tuán)的相互神經(jīng)投射［9］，將辣根過氧化物酶注射到螺旋神經(jīng)節(jié)后發(fā)現(xiàn)除了耳蝸核團(tuán)有示蹤劑外，在同側(cè)的前庭內(nèi)側(cè)核團(tuán)也發(fā)現(xiàn)了示蹤劑，證實(shí)前庭核團(tuán)存在向耳蝸的纖維投射；同時(shí)將辣根過氧化物酶注射到前庭內(nèi)側(cè)核團(tuán)后發(fā)現(xiàn)在螺旋神經(jīng)節(jié)存在示蹤劑，證實(shí)在螺旋神經(jīng)節(jié)處存在向前庭核團(tuán)的纖維投射。在兔子的前庭核團(tuán)的上側(cè)和內(nèi)側(cè)核團(tuán)注射麥芽凝集素標(biāo)記的辣根過氧化物酶逆行示蹤劑后，在雙側(cè)耳蝸核團(tuán)的背側(cè)核團(tuán)發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的神經(jīng)元，說明耳蝸核團(tuán)存在向前庭核團(tuán)的神經(jīng)投射，這種神經(jīng)聯(lián)系可能有利于聽覺和平衡感覺的相互作

用［10-12］。

［1］Pulec JL.Cochlear nerve section for intractable tinnitus［J］.Ear Nose Throat J，1995，74：468-476.

［2］McCue MP，Guinan JJ Jr.Acoustically responsive fibers in the vestibular nerve of the cat［J］.J Neurosci，1994 ，14（10）：6 058-6 070.

［3］Labrousse M，Leveque M，Ouedraogo T，et al.An anatomical study of the vestibulocochlear anastomosis （anastomosis of Oort）in humans：preliminary results［J］.Surg Radiol Anat，2005，27（3）：238-242.

［4］焦宇，遲放魯.大鼠傳出前庭神經(jīng)元與傳入前庭神經(jīng)核的神經(jīng)聯(lián)系［J］.中華耳鼻咽喉科雜志，2004，39（8）：469-471.

［5］遲放魯，王正敏，吳利雯 .膽堿能傳出性前庭神經(jīng)元的分布［J］.臨床耳鼻咽喉科雜志，2000，14（5）：220-222.

［6］Maison SF，Liberman MC.Predicting vulnerability to acoustic injury with a noninvasive assay of olivocochlear reflex strength［J］.J Neurosci，2000，20：4 701-4 707.

［7］Maison S，Micheyl C，Collet L.Influence of focused auditory attention on cochlear activity in humans［J］.Psychophysiology，2001，38：35-40.

［8］Baguley D.M.，Axon，P.Winter I.M etal.The effect of vestibular nerve section upon tinnitus［J］.Clin Otolaryngol，2002，27：219-226.

［9］Bukowska D.Morphological evidence for secondary vestibular afferent connections to the dorsal cochlear nucleus in the rabbit［J］.Cells Tissues Organs，2002，170（1）：61-68.

［10］Scharf B，Magnan J，Chays A.On the role of the olivocochlear bundle in hearing：16case studies［J］.Hear Res，1997，103：101-122.

［11］Wliams E.A.，Brookes G.B.Prasher D.K Effects of olivocochlear bundle section on otoacoustic emissions in humans：efferent effects in comparison with control subjects［J］.Acta Otolaryngologica（Stockh），1994，114：121-129.

［12］Giraud A.L.，Collet L.，Chery-Crozes，et al.Evidence of a medial olivocochlear involvement in contralateral suppression of otoacoustic emissions in humans［J］.Brain Res，1995，705（1-2）：15-23.