• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    柔嫩艾美耳球蟲微線4N端蛋白序列分析與真核表達(dá)

    2021-09-18 07:24:52王黎霞張建軍
    關(guān)鍵詞:畢赤艾美耳球蟲

    王黎霞,張 鵬,張建軍,安 健*

    (1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院牧醫(yī)系,北京 102442;2.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 102206)

    球蟲病是艾美耳屬球蟲感染所引起的原蟲病[1]。疫苗是雞球蟲病主要的防控手段。其中,基因工程疫苗以獨(dú)特的優(yōu)勢具有廣闊的應(yīng)用前景[2],保護(hù)性抗原在球蟲病重組疫苗的研制中起著十分重要的作用,尋找合適的抗原是未來球蟲免疫的重要選擇[3]。柔嫩艾美耳球蟲微線蛋白4(Eimeriatenellamicroneme protein 4,EtMIC4)是一種新發(fā)現(xiàn)的艾美耳球蟲蛋白,分子量240 kD,具有重復(fù)的TSP-1和EGF結(jié)構(gòu)域,在球蟲入侵宿主細(xì)胞的過程中起到重要的作用。JAVIER等[4]用5’RACE的方法首次克隆到EtMIC4基因的全長序列。黃欣梅等[5]和DU等[6]利用大腸桿菌表達(dá)EtMIC4蛋白的C端,此重組蛋白免疫試驗(yàn)雞,能夠部分抵抗柔嫩艾美耳球蟲的攻蟲的致病性,然而真核表達(dá)的蛋白在表達(dá)后修飾方面優(yōu)于原核表達(dá)產(chǎn)物,更接近原來蛋白的結(jié)構(gòu)。本研究是為了獲得重組柔嫩艾美耳球蟲微線N端蛋白(RecombinantEimeriatenellamicroneme protein 4 N,rEtMIC4N),所以克隆EtMIC4N基因,與已發(fā)表的基因序列比較,構(gòu)建真核表達(dá)載體pPICZαA/EtMIC4N,利用畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)rEtMIC4N,為后續(xù)其免疫原性研究打基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 材 料

    柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊,北京農(nóng)學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室保存。

    pGEM-T克隆載體、表達(dá)載體pPICZαA、大腸桿菌JM109、畢赤酵母GS115、Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品,M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs、Oligo(dT)15、Rnasin、DNA膠回收試劑盒為TaKaRa產(chǎn)品。

    1.2 方 法

    1.2.1 EtMIC4N特異性片段的克隆和序列分析 Trizol一步法從柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊分離總RNA,根據(jù)Genebank設(shè)計柔嫩艾美耳球蟲微線蛋白4基因N端(EtMIC4N)引物[7],進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增、克隆、測序和序列分析。

    1.2.2 重組表達(dá)載體pPICZαA/EtMIC4N構(gòu)建 EtMIC4N片段與pPICZαA連接,構(gòu)建重組表達(dá)載體pPICZαA/EtMIC4N,轉(zhuǎn)入大腸桿菌,生長菌落即為疑似陽性菌落,提取質(zhì)粒,PCR鑒定,驗(yàn)證pPICZαA/EtMIC4N構(gòu)建成功與否。

    1.2.3 畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化及陽性菌株的篩選 將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體、空表達(dá)載體電轉(zhuǎn)入感受態(tài)畢赤酵母,在100 μg/mL含Zeocin的YPD固體培養(yǎng)基培養(yǎng),凡生長菌落即是疑似菌落,用AOX通用引物進(jìn)行PCR鑒定。

    1.2.4 rEtMIC4N的小規(guī)模表達(dá)篩選及鑒定 試驗(yàn)分為3組:空載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)對照組、重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母未用甲醇誘導(dǎo)對照組和重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)表達(dá)組,對這3組進(jìn)行rEtMIC4N的小規(guī)模表達(dá)。

    收集空載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)對照組第2天的上清和重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母未用甲醇誘導(dǎo)對照組第36小時的上清各1 mL為對照;分別收集重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)表達(dá)組第1天、第2天、第3天、第4天、第5天和第6天的上清各1 mL進(jìn)行SDS-PAGE電泳、硝酸銀染色鑒定。收集重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)表達(dá)組第3天的上清1 mL,進(jìn)行Western blot鑒定。

    1.2.5 rEtMIC4N的大規(guī)模表達(dá)及純化 以搖瓶的方式對重組載體轉(zhuǎn)化的畢赤酵母甲醇誘導(dǎo),進(jìn)行大規(guī)模表達(dá),離心收集第3天的150 mL的培養(yǎng)上清,超濾除鹽后濃縮為5 mL,先流經(jīng)Ni-NTA柱,再通過250 mmol/L的咪唑洗脫液洗脫,以柱容積為單位分別收集洗脫液,利用分光光度計在OD280對重組蛋白進(jìn)行測定,然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳、硝酸銀染色和Western blot鑒定。

    2 結(jié) 果

    2.1 EtMIC4N特異性片段的克隆和序列分析

    EtMIC4N特異性片段的克隆后得到773 bp的EtMIC4N特異性片段(圖1)。EtMIC4N基因序列經(jīng)Blast分析顯示,克隆序列與Genebank中EtMIC4N的1 004~1 766 bp序列基本吻合,與開放閱讀框保持一致,其中4個堿基發(fā)生突變和1個Gap,基因相似度99.5%。在蛋白水平上,與Genebank的EtMIC4N蛋白比較,有4個氨基酸發(fā)生突變,相似度為98%。

    2.2 重組表達(dá)載體pPICZαA/EtMIC4N構(gòu)建與鑒定

    經(jīng)連接成功的重組表達(dá)載體pPICZαA/EtMIC4N轉(zhuǎn)染大腸桿菌JM109,挑取白色單菌落LLB/Zeocin液體培養(yǎng),提取質(zhì)粒、PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的目的條帶,說明重組表達(dá)載體pPICZαA/EtMIC4N構(gòu)建成功,見圖2。

    2.3 畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化及陽性菌株的篩選

    提取JM109感受態(tài)細(xì)胞中PICZαA/EtMIC4N重組質(zhì)粒,電轉(zhuǎn)畢赤酵母,涂布于含Zeocin的YPD平板,對菌落進(jìn)行PCR鑒定,電泳結(jié)果顯示預(yù)期的目的條帶(圖3),證明轉(zhuǎn)化成功,且為陽性重組畢赤酵母。

    2.4 rEtMIC4N的小規(guī)模表達(dá)篩選及鑒定

    SDS-PAGE顯示,重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)表達(dá)組第1天、第2天、第3天、第4天、第5天和第6天的上清中約45 kD的位置出現(xiàn)彌散狀的條帶,而空載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)對照組和重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母未用甲醇誘導(dǎo)對照組的上清中均沒有此條帶(圖4),Western Blot分析顯示,表達(dá)的蛋白大小為45 kD(圖5),說明rEtMIC4N是由甲醇誘導(dǎo)重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的畢赤酵母產(chǎn)生的。SDS-PAGE和Western Blot的結(jié)果一致,說明45 kD的條帶為分泌表達(dá)的rEtMIC4N。

    2.5 rEtMIC4N的大規(guī)模表達(dá)及純化

    大規(guī)模表達(dá)濃縮液經(jīng)Ni-NTA柱洗脫,收集的洗脫液經(jīng)SDS-PAGE,在45 kD處出現(xiàn)單一條帶,且主要是被第2個柱容積的洗脫液洗脫下來(圖6)。純化后的蛋白經(jīng)Western Blot鑒定,條帶同SDS-PAGE結(jié)果一致,但在80 kD的位置還出現(xiàn)一個條帶(圖7)。通過OD280對蛋白進(jìn)行測定,每升的酵母發(fā)酵液3 d能夠表達(dá)大約為10 mg的rEtMIC4N。

    3 討 論

    目前的抗原篩選研究與自然條件下球蟲感染雞的免疫途徑并不相同,在自然條件下,艾美耳球蟲主要引起的是細(xì)胞免疫應(yīng)答,如果能建立一種雞腸道細(xì)胞模型,用細(xì)胞免疫的水平來篩選有效的抗原,再用細(xì)胞免疫的途徑對雞進(jìn)行免疫來預(yù)防艾美耳球蟲病,此研究思路可望在艾美耳球蟲病的預(yù)防方面獲得突破性的進(jìn)展[7]。而真核表達(dá)的抗原更為接近天然結(jié)構(gòu),這對抗原的有效篩選有著重要的意義。

    JAVIER等[4]用5’RACE的方法首次克隆到EtMIC4的全序列,發(fā)現(xiàn)EtMIC4與巨型艾美耳球蟲TFP250蛋白有較高的同源性,而與剛地弓形蟲翻譯起始位點(diǎn)的一致,說明EtMIC4的起始密碼子同樣在Kozol序列中[8]。對EtMIC4的內(nèi)含子和外顯子分析,發(fā)現(xiàn)其內(nèi)含子還有剪接的保守序列[9-10]。經(jīng)過系統(tǒng)發(fā)生樹的分析,EtMIC4和TF250的TSP-1結(jié)構(gòu)域與TgMIC12的遺傳距離較遠(yuǎn)[11]。EtMIC4基因的進(jìn)化祖先可能含有連續(xù)的TSP-1外顯子區(qū)域,通過內(nèi)含子的重組和進(jìn)化,最后形成艾美耳屬的MIC4。EGF樣結(jié)構(gòu)域之間含有大量的內(nèi)含子,說明EGF的多拷貝進(jìn)化要早于TSP-1。這與缺少內(nèi)含子的EGF樣結(jié)構(gòu)域的層黏蛋白在進(jìn)化上的結(jié)果一致[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)rEtMIC4時,蛋白條帶銀染的結(jié)果灰度分析顯示第1天到第2天未發(fā)現(xiàn)可見條帶,說明前2 d表達(dá)量較少,3~6 d差異不大,所以在大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)時,選擇在第3天回收上清。

    CHEN等[14]表達(dá)乳鐵蛋白相關(guān)抗菌多肽時,發(fā)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物比預(yù)期的分子量大。王鑫等[15]表達(dá)豬β-防御素也出現(xiàn)相似現(xiàn)象。本試驗(yàn)中rEtMIC4N的基因序列和表達(dá)載體的標(biāo)簽序列組成的重組蛋白分子量大小為29 kD,畢赤酵母分泌表達(dá)的蛋白約為45 kD,比預(yù)測的分子量要大。其原因可能是由于rEtMIC4是一個重復(fù)結(jié)構(gòu)域的蛋白,導(dǎo)致其蛋白的折疊等高級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,也可能是由于rEtMIC4N的糖基化作用,使分子量增大,但其具體原因尚待進(jìn)一步研究。

    SDS-PAGE的考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果顯示在62 kD到83 kD之間未出現(xiàn)條帶,但經(jīng)Western Blot檢測,在這個位置有輕微的條帶,說明重組蛋白有微量的出現(xiàn),這可能是表達(dá)的rEtMIC4N形成少量二聚體,被靈敏度較高的Western Blot檢測出。

    EtMIC4蛋白分子量較大,較難整體重組表達(dá),需分段進(jìn)行。rEtMIC4C是C端重組蛋白,rEtMIC4N是N端蛋白。DANFORTH等[16]對rEtMIC4C的免疫原性進(jìn)行研究,證明rEtMIC4C對雞預(yù)防球蟲同源感染有一定效果。DU等[6]研究發(fā)現(xiàn),人參皂苷與原核表達(dá)的rEtMIC4C聯(lián)合免疫雞,能夠部分抵抗柔嫩艾美耳球蟲的攻擊,且發(fā)現(xiàn)rEtMIC4C沙門氏菌載體疫苗對雞同源艾美耳球蟲攻擊的保護(hù)作用[17]。JAVIER等[4]獲得EtMIC4的全長序列后,還未見對其新發(fā)現(xiàn)的N端序列進(jìn)行表達(dá)和免疫原性的研究。本試驗(yàn)成功對rEtMIC4N進(jìn)行畢赤酵母表達(dá)及鑒定,并獲得一定量純度較高的蛋白,搖瓶發(fā)酵的表達(dá)量可達(dá)到10 mg/L,至于其免疫原性及臨床應(yīng)用前景值得進(jìn)一步探索。

    猜你喜歡
    畢赤艾美耳球蟲
    肉雞球蟲疾病藥物防治效果的分析
    球蟲感染雞群有哪三種表現(xiàn)
    非甲醇誘導(dǎo)重組畢赤酵母表達(dá)木聚糖酶的條件優(yōu)化
    菌絲霉素NZ2114畢赤酵母工程菌高效發(fā)酵工藝的研究
    廣東飼料(2016年1期)2016-12-01 03:43:01
    離心法分離畢赤酵母活細(xì)胞和死細(xì)胞
    TTC比色法篩選高存活率的畢赤酵母突變株
    雞和緩艾美耳球蟲早熟蟲株選育及其生物學(xué)特性研究
    3種消毒藥對豬球蟲的體外抑殺效果觀察
    毒害與巨型及毒害與柔嫩艾美耳球蟲間在免疫方面的相互影響
    治療肉雞球蟲的常見藥物及有效投藥方法
    久久精品国产亚洲av涩爱| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产在线免费精品| 久久精品国产a三级三级三级| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 欧美精品亚洲一区二区| 精品久久蜜臀av无| 日本vs欧美在线观看视频| 黄色片一级片一级黄色片| 午夜老司机福利片| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产97色在线日韩免费| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产精品.久久久| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 成人亚洲欧美一区二区av| 男女免费视频国产| 麻豆国产av国片精品| 精品久久蜜臀av无| 日日夜夜操网爽| 老司机深夜福利视频在线观看 | 久久精品成人免费网站| 久久狼人影院| 亚洲精品在线美女| 黄频高清免费视频| 成年av动漫网址| 亚洲一区中文字幕在线| 香蕉国产在线看| 日本黄色日本黄色录像| 日本91视频免费播放| 亚洲av片天天在线观看| 精品久久久精品久久久| 我的亚洲天堂| 啦啦啦在线免费观看视频4| www.精华液| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产男女内射视频| 男女边摸边吃奶| 国产有黄有色有爽视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲欧洲日产国产| 国产男女内射视频| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 91精品三级在线观看| 免费看不卡的av| 91成人精品电影| 午夜福利视频在线观看免费| 韩国精品一区二区三区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 少妇 在线观看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 好男人视频免费观看在线| 精品国产国语对白av| 黄色毛片三级朝国网站| 飞空精品影院首页| 涩涩av久久男人的天堂| 成人亚洲欧美一区二区av| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 色94色欧美一区二区| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲成人手机| 国产野战对白在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲少妇的诱惑av| 国产又色又爽无遮挡免| 久久精品成人免费网站| 日韩av免费高清视频| 国产精品熟女久久久久浪| 韩国高清视频一区二区三区| 熟女av电影| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 在线av久久热| 下体分泌物呈黄色| 久久亚洲国产成人精品v| 人体艺术视频欧美日本| 国产精品人妻久久久影院| 91老司机精品| 好男人视频免费观看在线| 少妇 在线观看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 九草在线视频观看| 极品人妻少妇av视频| 操美女的视频在线观看| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲精品国产av成人精品| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 免费人妻精品一区二区三区视频| 波野结衣二区三区在线| 免费不卡黄色视频| 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲,一卡二卡三卡| 97精品久久久久久久久久精品| 国产精品久久久av美女十八| 51午夜福利影视在线观看| 99香蕉大伊视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 手机成人av网站| 国产精品免费视频内射| 久久亚洲精品不卡| 青春草视频在线免费观看| 精品免费久久久久久久清纯 | 亚洲av日韩精品久久久久久密 | av一本久久久久| 亚洲成人手机| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| avwww免费| 国产高清不卡午夜福利| 欧美日韩视频精品一区| www.精华液| 99久久综合免费| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 91精品三级在线观看| 电影成人av| 色综合欧美亚洲国产小说| 在线观看免费高清a一片| 一级黄片播放器| 丁香六月天网| 久久女婷五月综合色啪小说| 久久久久国产一级毛片高清牌| 美女福利国产在线| 在线观看www视频免费| 国产真人三级小视频在线观看| 大话2 男鬼变身卡| 中文字幕色久视频| 伦理电影免费视频| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲国产精品国产精品| 欧美97在线视频| 18禁国产床啪视频网站| 99热国产这里只有精品6| 亚洲精品国产色婷婷电影| 99国产精品99久久久久| 亚洲欧美色中文字幕在线| 岛国毛片在线播放| 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 不卡av一区二区三区| 成年av动漫网址| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 视频区图区小说| 我的亚洲天堂| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲男人天堂网一区| 免费高清在线观看日韩| 2018国产大陆天天弄谢| 好男人视频免费观看在线| 美女午夜性视频免费| 亚洲成色77777| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 精品亚洲乱码少妇综合久久| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产精品一国产av| www.熟女人妻精品国产| 欧美日韩亚洲高清精品| 久久鲁丝午夜福利片| 精品免费久久久久久久清纯 | 国产精品熟女久久久久浪| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产福利在线免费观看视频| 亚洲av成人精品一二三区| 搡老乐熟女国产| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 在线观看人妻少妇| 国产精品偷伦视频观看了| 久久久国产一区二区| 99久久99久久久精品蜜桃| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 99国产精品一区二区三区| 午夜福利乱码中文字幕| 日韩av在线免费看完整版不卡| 99热国产这里只有精品6| 我的亚洲天堂| 三上悠亚av全集在线观看| 男女之事视频高清在线观看 | 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 在线观看人妻少妇| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产高清videossex| 各种免费的搞黄视频| 成年人午夜在线观看视频| 美女中出高潮动态图| 久久精品成人免费网站| 亚洲情色 制服丝袜| 999久久久国产精品视频| 十八禁网站网址无遮挡| 一级片免费观看大全| 一级片'在线观看视频| 一区二区三区乱码不卡18| 久热这里只有精品99| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲熟女精品中文字幕| 丁香六月欧美| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产激情久久老熟女| 亚洲国产精品成人久久小说| videosex国产| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 永久免费av网站大全| 亚洲欧美一区二区三区黑人| av网站在线播放免费| 亚洲欧美激情在线| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 这个男人来自地球电影免费观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲精品美女久久av网站| 久久久久国产一级毛片高清牌| 高清欧美精品videossex| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产成人精品无人区| 一边亲一边摸免费视频| 国产视频一区二区在线看| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | svipshipincom国产片| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲第一青青草原| 成人国语在线视频| 不卡av一区二区三区| 乱人伦中国视频| 国产免费福利视频在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久 | 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 午夜福利乱码中文字幕| 视频区图区小说| 色播在线永久视频| 丁香六月天网| 久久女婷五月综合色啪小说| 亚洲精品国产一区二区精华液| 99九九在线精品视频| 免费在线观看完整版高清| 欧美日韩成人在线一区二区| 高清欧美精品videossex| 亚洲欧美色中文字幕在线| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 日本91视频免费播放| 香蕉丝袜av| 欧美久久黑人一区二区| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产成人影院久久av| 成人影院久久| 免费少妇av软件| av网站免费在线观看视频| 中文字幕av电影在线播放| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产又色又爽无遮挡免| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 大码成人一级视频| 韩国精品一区二区三区| 满18在线观看网站| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 韩国精品一区二区三区| 岛国毛片在线播放| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 在线 av 中文字幕| 99精国产麻豆久久婷婷| 首页视频小说图片口味搜索 | 国产精品一国产av| 亚洲成人手机| 国产一区二区激情短视频 | 国产高清videossex| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲国产日韩一区二区| 成人国语在线视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 99国产精品一区二区蜜桃av | 欧美亚洲日本最大视频资源| 满18在线观看网站| 男女国产视频网站| 久热这里只有精品99| 日韩一本色道免费dvd| 一本大道久久a久久精品| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲人成电影观看| 免费在线观看日本一区| 亚洲,欧美精品.| 国产精品偷伦视频观看了| 国产精品久久久久久精品电影小说| av欧美777| 精品国产一区二区久久| 国产精品99久久99久久久不卡| 午夜福利在线免费观看网站| 国产精品免费大片| 一本久久精品| 亚洲九九香蕉| 美女扒开内裤让男人捅视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 精品国产乱码久久久久久男人| 日日摸夜夜添夜夜爱| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 97人妻天天添夜夜摸| 夫妻性生交免费视频一级片| 欧美中文综合在线视频| 日本91视频免费播放| 日韩一本色道免费dvd| 免费日韩欧美在线观看| 精品少妇黑人巨大在线播放| bbb黄色大片| 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲伊人色综图| 午夜av观看不卡| 精品少妇内射三级| 国产精品二区激情视频| 精品久久蜜臀av无| tube8黄色片| 宅男免费午夜| 大香蕉久久成人网| 搡老乐熟女国产| 国产主播在线观看一区二区 | 亚洲熟女毛片儿| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 中文字幕亚洲精品专区| 成年人黄色毛片网站| 亚洲中文日韩欧美视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产亚洲欧美精品永久| 搡老岳熟女国产| 这个男人来自地球电影免费观看| 少妇 在线观看| 国产三级黄色录像| xxxhd国产人妻xxx| 国产精品久久久av美女十八| 成年女人毛片免费观看观看9 | 亚洲精品国产区一区二| 成人亚洲欧美一区二区av| 久久国产亚洲av麻豆专区| 一个人免费看片子| 后天国语完整版免费观看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 捣出白浆h1v1| 看免费av毛片| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 美女视频免费永久观看网站| 叶爱在线成人免费视频播放| 99九九在线精品视频| 久久久欧美国产精品| √禁漫天堂资源中文www| 搡老岳熟女国产| 一区在线观看完整版| 一区二区三区激情视频| 国产极品粉嫩免费观看在线| 免费在线观看影片大全网站 | 一级毛片我不卡| 五月开心婷婷网| 高清av免费在线| 亚洲欧美色中文字幕在线| 亚洲av欧美aⅴ国产| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 亚洲av日韩在线播放| 精品第一国产精品| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产成人免费观看mmmm| videos熟女内射| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 婷婷色综合www| 国产av一区二区精品久久| 夫妻午夜视频| 亚洲国产精品国产精品| 性少妇av在线| 一本大道久久a久久精品| 欧美激情高清一区二区三区| 国产在视频线精品| 欧美日本中文国产一区发布| 日日夜夜操网爽| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产精品亚洲av一区麻豆| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲国产精品一区二区三区在线| www日本在线高清视频| 亚洲精品美女久久av网站| 一区二区三区四区激情视频| 久久毛片免费看一区二区三区| 伦理电影免费视频| 丁香六月天网| 日韩中文字幕视频在线看片| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 美女国产高潮福利片在线看| 国产福利在线免费观看视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 大香蕉久久网| 亚洲综合色网址| 亚洲精品国产av蜜桃| 操出白浆在线播放| 妹子高潮喷水视频| 视频区图区小说| 一级黄片播放器| 大香蕉久久成人网| 亚洲av片天天在线观看| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲伊人久久精品综合| 日本91视频免费播放| 一级片免费观看大全| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲精品中文字幕在线视频| 欧美在线一区亚洲| 亚洲成人手机| 久久天堂一区二区三区四区| 777米奇影视久久| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲免费av在线视频| 大片免费播放器 马上看| 叶爱在线成人免费视频播放| 国精品久久久久久国模美| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 黄色毛片三级朝国网站| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 丰满迷人的少妇在线观看| 一个人免费看片子| 国产精品 欧美亚洲| 午夜精品国产一区二区电影| 成人国产av品久久久| 精品一品国产午夜福利视频| 欧美国产精品一级二级三级| 97精品久久久久久久久久精品| 久久精品亚洲av国产电影网| 亚洲国产精品一区三区| 国产在线免费精品| 亚洲国产最新在线播放| 久久精品人人爽人人爽视色| 日本欧美国产在线视频| 久久国产精品大桥未久av| 日本欧美国产在线视频| 成在线人永久免费视频| 在现免费观看毛片| 99精国产麻豆久久婷婷| 成年人午夜在线观看视频| 免费高清在线观看日韩| 在现免费观看毛片| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 久久综合国产亚洲精品| 女性生殖器流出的白浆| 成人影院久久| 性高湖久久久久久久久免费观看| 国产激情久久老熟女| 黄片小视频在线播放| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产91精品成人一区二区三区 | 又紧又爽又黄一区二区| 一级,二级,三级黄色视频| 1024视频免费在线观看| 久久 成人 亚洲| 亚洲片人在线观看| 欧美久久黑人一区二区| 啦啦啦免费观看视频1| 精品久久久久久久久久久久久 | 欧美黄色片欧美黄色片| aaaaa片日本免费| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲人成电影免费在线| 波多野结衣高清无吗| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲免费av在线视频| 日韩免费av在线播放| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲电影在线观看av| av福利片在线| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产日本99.免费观看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 久久久国产成人免费| 男女午夜视频在线观看| 国产av一区在线观看免费| АⅤ资源中文在线天堂| 欧美乱色亚洲激情| 午夜福利在线观看吧| 成人av一区二区三区在线看| 国产亚洲欧美98| 草草在线视频免费看| 免费在线观看日本一区| 黄色视频,在线免费观看| 人人妻人人看人人澡| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 久久青草综合色| 日韩欧美免费精品| 国产激情欧美一区二区| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 在线观看舔阴道视频| 嫩草影院精品99| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 精品久久久久久久末码| 久久久久久九九精品二区国产 | 久久久久久大精品| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产精品久久久av美女十八| 免费在线观看亚洲国产| 国产精品久久久人人做人人爽| 在线看三级毛片| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 日韩大码丰满熟妇| 精品人妻1区二区| 午夜久久久在线观看| www日本黄色视频网| 中文在线观看免费www的网站 | 黄色 视频免费看| 热99re8久久精品国产| avwww免费| 精品国内亚洲2022精品成人| 91av网站免费观看| 日本成人三级电影网站| av超薄肉色丝袜交足视频| 老司机靠b影院| 青草久久国产| 男女午夜视频在线观看| 在线观看免费午夜福利视频| 美女免费视频网站| 最近最新免费中文字幕在线| 久久精品人妻少妇| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 性色av乱码一区二区三区2| 久久精品国产综合久久久| 精品免费久久久久久久清纯| av免费在线观看网站| 黄色片一级片一级黄色片| 好男人电影高清在线观看| 老司机福利观看| 最好的美女福利视频网| 最近最新中文字幕大全电影3 | 免费在线观看亚洲国产| 日本黄色视频三级网站网址| 性欧美人与动物交配| 成人国产一区最新在线观看| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲第一av免费看| 黄色a级毛片大全视频| 午夜a级毛片| 国产激情偷乱视频一区二区| cao死你这个sao货| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 后天国语完整版免费观看| 中文在线观看免费www的网站 | 国产av一区二区精品久久| 亚洲精品国产一区二区精华液| 波多野结衣高清无吗| 黄色丝袜av网址大全| 日韩欧美一区视频在线观看| 中文字幕av电影在线播放| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 搡老妇女老女人老熟妇| 999久久久精品免费观看国产| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 在线观看午夜福利视频| 国产精品影院久久| 99在线视频只有这里精品首页| 99re在线观看精品视频| 欧美成人免费av一区二区三区| 日韩三级视频一区二区三区| 人人澡人人妻人| av视频在线观看入口| 日本熟妇午夜| 精品熟女少妇八av免费久了| 一区二区三区高清视频在线| 国产久久久一区二区三区| 午夜福利欧美成人| 成人欧美大片| av有码第一页| 女同久久另类99精品国产91| 一夜夜www| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 一本久久中文字幕| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲精品粉嫩美女一区| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 日本一区二区免费在线视频| 欧美日韩黄片免| 国产麻豆成人av免费视频| 成人国产一区最新在线观看| 最新美女视频免费是黄的| 国产91精品成人一区二区三区| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 一区二区三区精品91| 亚洲专区中文字幕在线| 欧美大码av| 99在线人妻在线中文字幕| 少妇熟女aⅴ在线视频| bbb黄色大片| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产成人av激情在线播放| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产精品乱码一区二三区的特点| 在线观看日韩欧美| 男人舔奶头视频| 人人澡人人妻人| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 欧美成人午夜精品| 国产av又大| 少妇被粗大的猛进出69影院| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 午夜亚洲福利在线播放| 大型黄色视频在线免费观看| 日韩欧美国产在线观看|