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    食品組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于蜂膠成分鑒定

    2022-12-27 07:40:46張文文趙溪張旭光王凱李強(qiáng)強(qiáng)薛曉鋒吳黎明
    中國(guó)蜂業(yè) 2022年1期
    關(guān)鍵詞:蜂膠組學(xué)黃酮

    張文文 趙溪 張旭光,3,4 王凱 李強(qiáng)強(qiáng) 薛曉鋒 吳黎明

    (1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所,100093;2 湯臣倍健股份有限公司科技中心;3 中國(guó)科學(xué)院上海營(yíng)養(yǎng)與健康研究所,200000;4 深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院,518000)

    1 蜂膠概述

    蜂膠是蜜蜂采集外界多種樹(shù)木的嫩芽分泌物或樹(shù)木受傷部位分泌的樹(shù)脂、泥土砂礫、蜜蜂蜂蠟以及蜜蜂的腺體分泌物混合形成的。通常,蜂膠是由50%~60%的樹(shù)脂和香脂,30%~40%的蠟、5%~10%的精油、5%的花粉粒、微量元素和維生素組成[1]。在蜂巢中,被蜜蜂用來(lái)建造和修補(bǔ)巢穴、光滑巢壁、填補(bǔ)縫隙和抵御外界病原菌,防止微生物疾病的發(fā)生與傳播及蟲(chóng)鼠的入侵,同時(shí)蜂膠作為一種天然產(chǎn)品受到廣泛應(yīng)用和關(guān)注。

    1.1 蜂膠的化學(xué)成分

    蜂膠有著十分復(fù)雜的化學(xué)成分,由上百種化合物組成,大量研究表明,不同植物源、蜜蜂所在當(dāng)?shù)貧夂虻牟煌?、采膠的時(shí)間以及蜜蜂種類的不同都會(huì)導(dǎo)致蜂膠的成分組成差異,隨著現(xiàn)代分離、純化以及鑒定技術(shù)的發(fā)展,如核磁共振(NMR)、氣相色譜(GC)、薄層色譜、高效液相色譜(HPLC)、質(zhì)譜(MS)等,蜂膠中的化學(xué)成分被逐漸挖掘和發(fā)現(xiàn),蜂膠中的主要成分有黃酮、酚酸、萜類、芳香酸、醇類、脂肪酸、礦物質(zhì)、類固醇和糖等,其中酚酸和黃酮是蜂膠的主要活性組成成分,其含量的高低決定了蜂膠的質(zhì)量[2]。

    蜂膠中的黃酮化合物根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同又可以分成11 個(gè)亞類,即黃烷、異黃烷、黃烷酮、黃烷醇、黃酮、異黃酮、異二氫黃酮、黃酮醇、查耳酮、二氫查耳酮和新黃酮。萜類使蜂膠具有特殊的樹(shù)脂氣味,是蜂膠中的主要揮發(fā)性成分,也是蜂膠中有效活性成分,因此也可以以此來(lái)簡(jiǎn)單的區(qū)分優(yōu)質(zhì)和劣質(zhì)蜂膠以及假蜂膠,約占蜂膠總量的10%。蜂膠中分離出的萜類包括單萜、倍半萜、二萜和三萜類,其中單萜又分為無(wú)環(huán)、單環(huán)、二環(huán)單萜及其衍生物。倍半萜是蜂膠萜類中含量最豐富的,根據(jù)環(huán)的數(shù)量,倍半萜分為四類:無(wú)環(huán),單環(huán),雙環(huán)和三環(huán)[3]。脂肪酸是蜂膠中的非極性部分之一,以糖苷,游離脂肪酸,不同類型的酯或其他形式存在于蜂膠中[4]。蜂膠中還含有蔗糖、果糖、葡萄糖等糖類物質(zhì),蜂膠中糖類的來(lái)源問(wèn)題目前尚未得到徹底解決,有研究認(rèn)為,蜂膠中的蔗糖、果糖和葡萄糖可能來(lái)源于蜂蜜或者蜜蜂采集的花蜜,還有研究認(rèn)為,蜂膠中的糖可能是由蜂膠中的類黃酮糖苷分解產(chǎn)生的[5]。Cvek 等通過(guò)中子活化分析在不同的阿根廷蜂膠中鑒定出了Br、Co、Cr、Fe、Rb、Sb、Sm 和Zn[6]。

    1.2 蜂膠的生物活性

    據(jù)報(bào)道,蜂膠早在公元前300年就被世界許多地區(qū)的人們所發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于醫(yī)學(xué)中[7]。埃及人發(fā)現(xiàn)并利用了蜂膠的抗氧化和抑菌活性,用蜂膠來(lái)保存已故的尸體。到了中世紀(jì),阿拉伯人用蜂膠來(lái)抑制傷口感染和作為口腔消毒劑[8]。

    蜂膠復(fù)雜的化學(xué)成分組成與蜂膠的多種生物活性息息相關(guān)。蜂膠中肉桂酸和香豆素的存在產(chǎn)生殺菌作用,由于類黃酮和芳香酸衍生物的作用,蜂膠具有體外抗病毒活性(單純皰疹,流感)、抗?jié)儯◣椭希?、免疫刺激、降壓和抑制?xì)胞等作用[9]。蜂膠中所含有的阿替匹林C、綠原酸、咖啡酸、咖啡酸苯乙酯(CAPE)、高良姜素、槲皮素以及黃酮等化合物都是具有強(qiáng)大的治療潛能[10]。許多科學(xué)研究也報(bào)道了蜂膠的生物活性,有抗炎癥[11]、抗腫瘤[12]、抗癌癥[13]、抗真菌[14]、清除自由基[15]、免疫刺激等。蜂膠在生活中的多個(gè)行業(yè)領(lǐng)域都有應(yīng)用,包括醫(yī)學(xué)、保健品、化妝品等。

    2 食品組學(xué)概述

    近年來(lái),食品組學(xué)研究取得了飛速的發(fā)展,這主要體現(xiàn)在先進(jìn)的研究技術(shù)中,使食品組學(xué)的方法學(xué)研究在多個(gè)領(lǐng)域更加通用。食品組學(xué)研究可以用來(lái)分析食品的生物活性和食品中的活性成分、提供相關(guān)分子機(jī)制的新見(jiàn)解、探索和發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)記[16]。

    2.1 基因組學(xué)

    基因組學(xué)在食品組學(xué)技術(shù)中應(yīng)用較早,涉及生物體內(nèi)基因組基因的結(jié)構(gòu)和功能基因的測(cè)序、組裝和分析?;蚪M學(xué)的主要目的是為了了解生物學(xué)的組成部分,并通過(guò)實(shí)驗(yàn)和分析獲得盡可能多的與生物學(xué)組成相關(guān)的遺傳序列信息?;蚪M學(xué)研究所使用的技術(shù)中,用途最廣泛的是高密度寡核苷酸或互補(bǔ)DNA 陣列技術(shù)。與DNA陣列技術(shù)相比,下一代DNA測(cè)序技術(shù)(NGS)可以同時(shí)(通常也叫做盡可能平行)處理數(shù)百萬(wàn)個(gè)測(cè)序反應(yīng),且無(wú)需序列庫(kù)[17],大大提高了DNA 序列信息獲取的速度,并降低了測(cè)序成本?;蚪M學(xué)技術(shù)還包括單分子測(cè)序(也稱為第三代測(cè)序系統(tǒng)),單分子測(cè)序技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于允許高密度單分子異步擴(kuò)展,因此在化學(xué)動(dòng)力學(xué)方面具有高度的靈活性[18]。

    2.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)

    轉(zhuǎn)錄組學(xué)是對(duì)一個(gè)細(xì)胞或者一組細(xì)胞的所有RNA 信息進(jìn)行的研究,是了解基因組功能元件并揭示細(xì)胞分子組成的重要工具[19]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的兩個(gè)主要工具分別是基因表達(dá)微陣列和RNA 大規(guī)模測(cè)序(RNA-Seq)?;虮磉_(dá)微陣列根據(jù)其設(shè)計(jì)可分為在固體平板基質(zhì)(或微芯片)上的微陣列和在球形基質(zhì)(或顆粒微陣列)上的微陣列[20]。RNA-seq 技術(shù)是基于新一代測(cè)序技術(shù),并且有大量的測(cè)序平臺(tái),其目的是對(duì)整個(gè)轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行測(cè)序[21],因此RNA-seq 技術(shù)可以應(yīng)用于全基因組高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)。

    2.3 蛋白質(zhì)組學(xué)

    食品蛋白質(zhì)組學(xué)是指以應(yīng)用食品蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)特定生物食品系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模分析,除了研究蛋白質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能外,蛋白質(zhì)組學(xué)還研究蛋白質(zhì)的修飾作用,蛋白質(zhì)豐度的定量分析以及研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用[22]。蛋白質(zhì)組學(xué)還致力于在特定時(shí)間和條件下,對(duì)生物系統(tǒng)中表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。蛋白質(zhì)組學(xué)的分析過(guò)程包括蛋白質(zhì)的提取和分離,蛋白質(zhì)消化成肽,質(zhì)譜分析,蛋白質(zhì)的定性和定量分析[23]。蛋白質(zhì)組學(xué)分析中有兩種蛋白質(zhì)提取和分離技術(shù),一種是二維電泳(2-DE)法,另一種是多維液相色譜法。2-DE 方法中蛋白質(zhì)的提取和分離是基于等電點(diǎn)(pI)和在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量分離,然后進(jìn)行圖像分析以對(duì)圖像中所有可辨別的斑點(diǎn)進(jìn)行分類,以為后續(xù)研究提供參考[24]。多維液相色譜技術(shù)可以通過(guò)與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的LC(LC-MS/MS)進(jìn)行蛋白質(zhì)的有效提取和分離。用來(lái)表征和分析蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的工具主要是質(zhì)譜分析,包括基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)和電離子阱質(zhì)譜(ESI-IT),這兩種技術(shù)都是先將蛋白質(zhì)電離,然后再通過(guò)MS 分析[25]。

    2.4 代謝組學(xué)

    代謝組學(xué)技術(shù)專注于小分子代謝物(<1000-1500Da)的定性和定量研究,以比較樣品之間的差異[26]。代謝組學(xué)分析的內(nèi)容包括根據(jù)研究目的提取目標(biāo)代謝物,選擇分析儀器和準(zhǔn)備樣品,進(jìn)行樣品上機(jī)檢測(cè),獲取相應(yīng)的數(shù)據(jù)結(jié)果以及通過(guò)分析軟件進(jìn)行分析和鑒定,生物信息學(xué)和化學(xué)計(jì)量學(xué)是兩種主要用于代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析的工具[27]。代謝組學(xué)的研究有靶向和非靶向兩種方法,其中非靶向代謝組學(xué)又包括代謝譜和代謝指紋圖譜。代謝組學(xué)技術(shù)中最常用的數(shù)據(jù)采集平臺(tái)有核磁共振(NMR),氣相色譜-質(zhì)譜(GCMS),液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS) 和毛細(xì)管電泳質(zhì)譜法(CE-MS)[28]。不同的組學(xué)技術(shù)分析各有其優(yōu)勢(shì),各種代謝組學(xué)技術(shù)的組合應(yīng)用可以獲得互補(bǔ)的分析信息結(jié)果,從而使代謝組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用范圍更廣。

    2.5 其他

    食品組學(xué)還包括化學(xué)計(jì)量學(xué),表觀基因組學(xué),生物信息學(xué)和MicroRNA(miRNA)等?;瘜W(xué)計(jì)量學(xué)技術(shù)是代謝組學(xué)技術(shù)的一個(gè)分支,通過(guò)構(gòu)建模型來(lái)識(shí)別和驗(yàn)證目標(biāo)樣品,識(shí)別和分類的方法主要包括非監(jiān)督主成分分析(PCA),監(jiān)督判別分析(DA),層次聚類分析(HCA)和類模擬的軟獨(dú)立建模(SIMCA)[29]。表觀遺傳學(xué)技術(shù)是指在表觀遺傳學(xué)水平上對(duì)基因狀態(tài)變化進(jìn)行全基因組分析[30]。全基因組分析主要是分析染色體的染色體結(jié)構(gòu)變化,該染色體結(jié)構(gòu)會(huì)影響相應(yīng)基因的表達(dá),從而影響相應(yīng)位置的表觀遺傳狀態(tài)[31]。生物信息學(xué)技術(shù)是對(duì)從各種組學(xué)技術(shù)中獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行深入探索,并通過(guò)功能注釋,遺傳和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析,最后闡述其生物學(xué)意義[32]。miRNA 是非編碼RNA 的亞型,可通過(guò)mRNA 降解,mRNA 翻譯和基因轉(zhuǎn)錄水平來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[33]。

    3 食品組學(xué)技術(shù)在蜂膠成分研究中的應(yīng)用

    食品組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于蜂膠研究可以快速精確地對(duì)蜂膠的生物學(xué)來(lái)源、產(chǎn)地、類別以及蜂膠的化學(xué)成分、蜂膠的質(zhì)量控制等進(jìn)行有效的分析。Wang 等應(yīng)用了一種可靠的基于1 H NMR 的代謝組學(xué)方法深入了解中國(guó)溫帶蜂膠(CWTP)和中國(guó)中溫蜂膠(CMTP)的成分差異,共收集了63 個(gè)來(lái)自不同地區(qū)的相同植物源的中國(guó)蜂膠乙醇提取物進(jìn)行分析,鑒定出21 種化合物,包括10 種類黃酮,9 種酚酸及其酯以及其他化合物,且研究發(fā)現(xiàn),由于蜜蜂對(duì)相同植物來(lái)源所在不同氣候地區(qū)的長(zhǎng)期適應(yīng),造成了蜂膠的成分差異,并造成了蜂膠生物活性的差異[34]。Mouse 等通過(guò)HPLC/ESI-MS 研究了摩洛哥蜂膠提取物的化學(xué)成分,以及它們?cè)隗w內(nèi)和體外的抗癌潛力,結(jié)果表明,摩洛哥蜂膠提取物中含有幾種黃酮類化合物,包括鼠李素,木犀草素和三氫西甲氧黃酮,一些類黃酮苷,如漢黃芩苷,槲皮素阿拉伯糖苷和山奈酚-O-葡萄糖苷,其抗癌活性不僅取決于蜂膠提取物所含有的化學(xué)成分,還取決于靶向的腫瘤細(xì)胞[21]。使用基于GC-MS 方法,Duran 等人研究?jī)煞N土耳其蜂膠提取物的化學(xué)成分與抗利什曼蟲(chóng)藥活性之間的關(guān)系,研究確定了提取物中的化合物,包括一些脂肪酸酯(油酸乙酯),肉桂酸酯(肉桂酸肉桂酸酯),碳?xì)浠衔铮ㄊ咛枷?-十七碳烯和1-十八碳烯)和倍半萜烯(δ-cadinene),這些化合物有助于土耳其蜂膠提取物具有對(duì)抗利什曼原蟲(chóng)的功效[22]。Barbaric 等通過(guò)RP-HPLC 鑒定并定量了20種乙醇提取的蜂膠樣品中的酚酸和類黃酮,分別是阿魏酸、對(duì)香豆酸和柯因、高良姜素、芹菜素、松屬素-7-甲醚、松屬素、山奈酚[9]。Soltani 等應(yīng)用GC-MS 檢測(cè)技術(shù)基于峰面積和保留時(shí)間(RT)檢測(cè)了四種來(lái)自阿爾及利亞塞提夫地區(qū)的蜂膠的化學(xué)成分,結(jié)果在水提取物和乙醇提取物中分別鑒定出20 多種化合物和30 至35 種化合物[11]。Okinczyc 等研究尼泊爾地區(qū)源于Apis mellifera L.和Trigona sp的兩個(gè)蜜蜂屬的蜂膠,通過(guò)HPLC-DAD-MS/MS 技術(shù)鑒定70%乙醇提取后提取物的化學(xué)成分,共檢測(cè)出23 種化學(xué)成分,兩種蜂膠提取物的成分幾乎相同,主要成分為黃酮(主要是新類黃酮,異類黃酮)和紫檀素[12]。Ristivojevi? 等利用UHPLC-LTQ/Orbitrap/MS/MS 技術(shù)研究土耳其蜂膠中的化學(xué)成分,結(jié)果共定性定量了15 種化合物,包括2 種苯甲酸衍生物、5 種酚酸和3 種黃烷醇,3 種黃酮,1 種黃烷酮和1 種糖苷[13]。蜂膠中的酚酸和黃酮成分是其主要的生物活性成分,但是蜂膠中的酚酸黃酮的種類和含量受到當(dāng)?shù)貧夂蚝椭参镌吹挠绊懘嬖谳^大差異,Safti? 等建立了與三重四極桿結(jié)合的目標(biāo)液相色譜法(LC-QQQ),與四極桿飛行時(shí)間結(jié)合的非靶向液相色譜法(LC-QTOF)和直接進(jìn)樣QTOF 法,分析了來(lái)自克羅地亞不同地理區(qū)域的56種蜂膠樣品。分析結(jié)果表明,克羅地亞境內(nèi)不只一種蜂膠類型,主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)表明,蜂膠樣品中的多酚含量在地中海的影響下發(fā)生了顯著變化,因此,在克羅地亞海岸,“歐洲”蜂膠類型與地中海型蜂膠混合,尤其是在島嶼上。對(duì)于蜂膠類型的快速篩查,直接進(jìn)樣QTOF 分析被證明是一種快速可靠的方法,但是對(duì)于酚類化合物的明確鑒定,色譜分離是必不可少的[35]。

    4 總結(jié)

    食品組學(xué)技術(shù)中應(yīng)用于蜂膠研究,多是體現(xiàn)在對(duì)蜂膠成分、蜂膠的類別、蜂膠的起源地的鑒定,對(duì)于蜂膠的活性及機(jī)制研究的應(yīng)用還比較少。因此,食品組學(xué)技術(shù)可以繼續(xù)應(yīng)用于蜂膠的活性研究,并從基因、蛋白、代謝通路等多個(gè)方面探究其主要活性成分和作用機(jī)制。

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