蒙藥古日古木-13對CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的改善作用及其機制研究

道力格瑪，鄧烏力吉，薩礎(chǔ)拉，薩日呼，陳圓圓，寶特力格爾，包套格申

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010020)

肝纖維化 (Hepatic fibrosis，HF)是以細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)過度堆積和結(jié)蹄組織異常增生為主要特征的肝臟病理過程[1]，通常由慢性炎癥損傷愈合反應(yīng)引起。如果治療不及時，肝纖維化的持續(xù)發(fā)展將誘使肝硬化，最終導(dǎo)致肝功能衰竭甚至死亡，故應(yīng)注重抗肝纖維化的治療。研究發(fā)現(xiàn)肝纖維化過程具有可逆性，在早期階段進(jìn)行有效治療對防止肝病發(fā)展至關(guān)重要[2]。近年來很多學(xué)者致力于天然藥物抗肝纖維化的研究，發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥在肝纖維化的治療中具有多途徑、多靶向、多層次的治療優(yōu)勢[3]。

蒙藥古日古木-13始載于蒙醫(yī)《四部醫(yī)典》，是蒙醫(yī)臨床治療肝病的經(jīng)典藥方[4]，由紅花、麥冬、木香、丁香、蓮子、訶子、川楝子、梔子、紫檀香、麝香、人工牛黃、人工水牛角濃縮粉、銀朱等13味蒙藥組成。以紅花為主藥，具有清肝熱、解毒、殺黏作用，主治肝功衰退、腰腎損傷及眼病。郭躍東等[5]發(fā)現(xiàn)古日古木-13對酒精性肝損傷大鼠Bax蛋白的表達(dá)有抑制作用，而增強Bcl-2蛋白表達(dá)，可減少肝細(xì)胞凋亡，從而抑制酒精性肝損傷大鼠的肝纖維化。葉超凡等[6]發(fā)現(xiàn)古日古木-13能明顯減輕CCl4所致肝損傷小鼠的肝組織壞死浸潤灶、肝細(xì)胞變性、壞死及炎細(xì)胞浸潤等病變，促進(jìn)肝臟組織ALR蛋白表達(dá)，進(jìn)而維持肝細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。但現(xiàn)有文獻(xiàn)關(guān)于古日古木-13對肝纖維化的重要因子TGF-β1和α-SMA的作用機制的研究較少。本實驗擬復(fù)制CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型，通過觀察蒙藥古日古木-13對肝纖維化的改善作用，探究其潛在作用機制。

1 實驗動物及材料

1.1 實驗動物

SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量(180±20)g，購自北京海淀區(qū)興隆實驗動物養(yǎng)殖廠(合格證編號：SCXK(京)2019-00010)。實驗大鼠在溫度(20±2)℃、濕度(55±5)℃、12 h明暗循環(huán)環(huán)境的條件下，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 儀器

RM2235病理切片機(德國徠卡)；MULTISKAN MK3全自動多功能酶標(biāo)儀(塞默飛世爾科技公司)；AU480全自動生化儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)；JY300C電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)；StepOne Plus實時定量PCR儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

1.3 藥材與試劑

古日古木-13(批號：2005007)購自內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司，秋水仙堿(批號：CC30152550)購自武漢豐泰威遠(yuǎn)科技有限公司；四氯化碳(批號：20180218)天津永晟精細(xì)化工有限公司；ALT、AST試劑盒，英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司；HA試劑盒(批號：CGEKR91LVA)、LN試劑盒(批號：8C2MD5XJHJ)、PⅢNP試劑盒(批號：TKDCTVDZVV)，武漢華美生物工程有限公司；qPCR試劑盒(批號：KK4601)，默瑞(上海)生物科技有限公司；兔抗大鼠α-sma多克隆抗體(批號：bs-10196R)，北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 分組與造模

將60只雄性SD大鼠隨機分為空白對照組，模型對照組，陽性對照組和古日古木-13低、中、高劑量組，每組10只。除空白對照組給予生理鹽水外，其他各組腹腔注射60%CCl4橄欖油溶液，2 mL/kg，每周2次，共 7周。

2.2 給藥

自第4周起，在繼續(xù)造模的同時，古日古木-13低、中、高劑量組大鼠分別給予128 mg/kg、256 mg/kg和512 mg/kg劑量藥物灌胃，藥物濃度及等效劑量通過體表面積折算。陽性組大鼠以秋水仙堿0.2 mg/kg為劑量灌胃給藥[7]。空白組和模型組根據(jù)大鼠體質(zhì)量灌胃相同劑量的生理鹽水，各組大鼠灌胃量為10 mL/kg，1次/d，持續(xù)4 周。末次給藥后，禁食過夜，次日采血并收集肝臟組織。

2.3 檢測指標(biāo)與方法

2.3.1 檢測肝功能及纖維化指標(biāo) 末次給藥后禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛予以麻醉，腹主動脈取血，血液以3 000 r·min-1、15 min離心，分離血清，置于-80 ℃冰箱保存以備檢測；依照試劑盒說明書的操作方法，采用生化檢測法測定血清 ALT和AST水平，ELISA法檢測血清HA、LN和PⅢNP表達(dá)。

2.3.2 組織病理學(xué)檢查 采用10%中性福爾馬林固定肝臟組織，經(jīng)乙醇脫水及石蠟包埋等步驟后，采用常規(guī)方法進(jìn)行HE染色，封片，生物顯微鏡下觀察肝組織病理變化。

2.3.3 實時熒光定量PCR檢測 切取大鼠同一部位肝組織，置于冷凝管迅速放入液氮速凍，待充分冷凍后儲存于-80 ℃冰箱。PCR反應(yīng)采用2×SYBR Master Mix Universal 10 μL反應(yīng)體系，總體積：20 μL，F(xiàn)orward Primer 1.5 μL(10 μm)，Reverse Primer 1.5 μL(10 μm)，template 3 μL，ROX校正染料0.5 μL，H2O 補齊至20 μL，用 SYBR PCR Mixture進(jìn)行擴增，95 ℃ 10 min、95 ℃ 10 s、59 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s、72 ℃ 15 s、95 ℃ 15 s。引物序列，見表1。

表1 PCR引物序列

2.3.4 免疫組化檢測 大鼠肝組織常規(guī)包埋切片，置于 EDTA8.0修復(fù)液中，微波爐內(nèi)修復(fù)，沖洗后室溫下放入3%雙氧水孵育30 min，PBS沖洗3次，滴加牛血清白蛋白V工作液孵育30 min，滴加一抗(α-SMA 1∶500)4 ℃孵育過夜，PBS沖洗3次，滴加相應(yīng)二抗，PBS沖洗3次，DAB染色，蒸餾水充分沖洗后，蘇木素復(fù)染，用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，采用中性樹膠封片。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，分析每個組織片上α-SMA平均光密度值，并在200倍下拍照觀察，再進(jìn)行定性分析。

2.4 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果與分析

3.1 大鼠行為學(xué)特征及組織變化

實驗期間，空白組大鼠情況良好，各造模組自造模第2周起出現(xiàn)毛色發(fā)黃、失光澤，精神狀態(tài)差，甚至出現(xiàn)腹水等變化。給藥期間陽性組，古日古木-13各劑量組大鼠毛色、活躍度等情況有所改善。采集肝臟組織樣本時觀察到空白組大鼠肝臟組織與其他各組有明顯區(qū)別，主要體現(xiàn)在顏色鮮紅、表面光滑細(xì)膩、無結(jié)節(jié)、質(zhì)嫩、邊緣銳利。模型組大鼠肝臟顏色呈褐色，表層粗糙欠光滑，質(zhì)硬，肝臟邊緣鈍厚，部分肝臟有花斑樣改變，肝葉體積增大，個別大鼠肝臟顆粒樣變化嚴(yán)重，甚至肝臟分葉不明顯；給藥組肝組織與模型組相比，變化不大。

3.2 對肝功能指標(biāo)的影響

與空白組比較，模型組血清ALT、AST水平顯著提高(P<0.05)。與模型組比較，陽性組相較古日古木-13各劑量組，ALT、AST水平有降低趨勢，但不明顯。見圖1。

注：與空白組比較，#P<0.05。

3.3 對肝纖維化指標(biāo)的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清HA、LN、PⅢNP水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性組較古日古木-13低、高劑量組，血清HA含量顯著降低(P<0.01)；陽性組較古日古木-13低、中劑量組，大鼠血清LN含量顯著降低(P<0.05)；陽性組、古日古木-13各劑量組大鼠血清中PⅢNP含量顯著降低(P<0.05)。見圖2。

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.4 對大鼠肝臟組織形態(tài)的影響

HE染色鏡下觀察，空白組肝組織具有完整的肝小葉結(jié)構(gòu)，中央靜脈清晰，肝索呈放射狀，中央靜脈周圍未見壞死、炎癥或纖維化跡象。模型組大鼠肝組織嚴(yán)重?fù)p傷，肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，有明顯的脂肪變性，肝臟有膠原纖維沉積。與模型組相比，陽性組和古日古木-13各劑量組部分區(qū)域膠原沉積明顯改善，肝細(xì)胞脂肪變性減少，匯管區(qū)內(nèi)仍可見炎細(xì)胞浸潤，細(xì)胞炎癥明顯減輕，肝細(xì)胞壞死顯著減少，見圖3。

注：A 空白組；B 模型組；C 陽性組；D古日古木-13低劑量組；E古日古木-13中劑量組；F古日古木-13高劑量組。

3.5 對大鼠肝組織TGF-β1的影響

與空白組比較，模型組大鼠肝組織TGF-β1表達(dá)顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，古日古木-13高劑量組大鼠肝組織TGF-β1表達(dá)量明顯下降，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.6 對CCL4誘導(dǎo)大鼠HSCs活化的抑制作用

與空白組比較，模型組大鼠肝組織α-SMA表達(dá)顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，陽性組、古日古木-13各劑量組大鼠肝組織α-SMA表達(dá)均顯著下降(P<0.05)；抗原陽性表達(dá)為棕黃色，細(xì)胞核為藍(lán)色。見圖5、圖6。

注：A 空白組；B 模型組；C 陽性組；D古日古木-13低劑量組；E古日古木-13中劑量組；F古日古木-13高劑量組

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 結(jié)語

肝纖維化在人群中較為多發(fā)，也是肝細(xì)胞癌(HCC) 衍變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是不可輕視的健康問題?，F(xiàn)階段暫無肝纖維化的特異性檢測方法，血清學(xué)指標(biāo)仍是臨床上運用較廣泛的無創(chuàng)性診斷手段。HA是ECM的重要組成部分，當(dāng)肝纖維化時HA合成增加，同時，肝細(xì)胞攝取和分解HA的能力也因肝功能受損降低，從而顯著增加血清HA水平[9]。LN是一種非膠原性糖蛋白，是基底膜的主要成分，在肝纖維化時聚集沉積，血清值升高反映基底膜更新率的增加[10]。血清PⅢNP是完整的Ⅲ型前膠原分子，直接反映了Ⅲ型膠原的合成情況[11]。CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠血清HA、LN及PⅢNP水平顯著升高，提示肝纖維化模型建立成功。本研究中，經(jīng)過蒙藥古日古木-13的干預(yù)，肝纖維化大鼠血清中HA、LN和PⅢNP表達(dá)顯著降低。通過組織病理學(xué)和血液生化檢測發(fā)現(xiàn)肝纖維化大鼠肝臟組織形態(tài)變化明顯，同時肝纖維化大鼠血清中AST、ALT水平有下降趨勢。這些均表明蒙藥古日古木-13對CCl4誘導(dǎo)的實驗性肝纖維化具有積極改善作用，提示顯著降低膠原纖維的合成與沉積是改善肝纖維化的可能機制之一。本實驗采用60%CCl4橄欖油溶液進(jìn)行造模，結(jié)果顯示實驗后期大鼠有精神不振、腹部脹氣，甚至腹水等癥狀，這可能與四氯化碳濃度較高有關(guān)。

活化的肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cell，HSC)將分化為成纖維母細(xì)胞，產(chǎn)生大量的ECM，是肝纖維化過程中負(fù)責(zé)膠原蛋白合成的主要細(xì)胞類型。在HSC增生和激活過程中諸多細(xì)胞因子起調(diào)控作用。越來越多的證據(jù)表明，TGF-β1在肝纖維化中扮演著重要角色[12-13]。TGF-β1經(jīng)庫普弗細(xì)胞分泌產(chǎn)生，它能激活HSC，同時促使HSC自分泌TGF-β1[14]。蒙藥古日古木-13高劑量能顯著降低肝組織中TGF-β1的表達(dá)，表明蒙藥古日古木-13抑制肝纖維化的機制可能與TGF-β1細(xì)胞因子有關(guān)。然而，由于本實驗給藥周期較短，蒙藥古日古木-13低、中劑量和陽性組與模型組相比無明顯差異，但均對肝纖維化大鼠TGF-β1水平有下調(diào)作用。α-SMA的異常表達(dá)已被認(rèn)為是肝星狀細(xì)胞活化的可靠標(biāo)志物[15]，蒙藥古日古木-13可顯著降低大鼠肝纖維化肝組織α-SMA的表達(dá)，提示蒙藥古日古木-13可能通過抑制肝星狀細(xì)胞的活化，進(jìn)而降低ECM的合成。

綜上所述，本研究認(rèn)為蒙藥古日古木-13改善肝纖維化的主要作用機理可能是阻止星狀細(xì)胞活化，抑制星狀細(xì)胞自分泌的TGF-β1肝纖維化促進(jìn)因子，進(jìn)而減少ECM的過度增生、沉積，從而發(fā)揮了改善肝纖維化的作用。