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    蒙藥檳榔十三味丸(高尤-13)止痛作用網(wǎng)絡藥理學機制研究

    2022-12-26 01:34:12徐秀娟劉蘇槿黃先菊張小敏崔競文佟海英
    亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥 2022年11期
    關鍵詞:外液味丸儲液

    徐秀娟,董 悅,劉蘇槿,黃先菊,楊 楨,張小敏,崔競文,佟海英*

    (1.包頭醫(yī)學院 藥學院,內(nèi)蒙古 包頭 014040;2.中南民族大學 藥學院,湖北 武漢 430074;3.北京中醫(yī)藥大學 中醫(yī)學院,北京 100029)

    檳榔十三味丸(又名:高尤-13)為治療命脈赫依病之首選方,由檳榔、肉豆蔻、廣棗、當歸、葶藶子、丁香、沉香、干姜、蓽茇、胡椒、草烏(制)、木香、紫硇砂等13味藥材組成,有調(diào)節(jié)赫依、安神止痛之效,用于心悸、失眠、精神失常、游走刺痛等癥[1]。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn),該方具有調(diào)節(jié)慢性應激抑郁模型大鼠行為學、單胺遞質、HPA軸及cAMP-PKA-BDNF-CREB信號通路的作用,部分闡釋了其調(diào)節(jié)赫依、安神的作用機制[2-5],但其發(fā)揮止痛作用的機制尚不明確。因此,本研究擬通過網(wǎng)絡藥理學方法對檳榔十三味丸的組成藥物進行分析,從系統(tǒng)、整體的角度將藥物與疾病相關聯(lián),預測其成分作用于此類疾病的成分靶點,進一步預測其潛在的止痛機制,并在細胞層面進行部分機制的驗證。

    1 方法

    1.1 檳榔十三味丸成分靶點收集

    通過中藥系統(tǒng)藥理學平臺(TCMSP,http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、Pubmed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/)、中藥綜合數(shù)據(jù)庫(TCMID,http://183.129.215.33/tcmid/)及相關文獻報道補充,整合收集檳榔十三味丸復方中各味藥材的化學成分。通過SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)及Uniprot(https://www.uniprot.org/)在線數(shù)據(jù)庫預測化學成分的作用靶點。

    1.2 檳榔十三味丸治療相關疼痛疾病靶點收集

    分別在OMIM(https://omim.org/)、GeneCards(https://www.genecards.org/)及PHARMGKB(https://www.pharmgkb.org/)疾病數(shù)據(jù)庫,以“Pain”“Depression pain”“Nerve pain”及“Inflammation pain”為關鍵詞,整合收集疼痛、炎癥疼痛、抑郁疼痛及神經(jīng)疼痛的相關靶點。使用Cytoscape 3.6.1軟件,分別對成分靶點與疾病靶點進行相交,得出其交集靶點,即復方治療相關疼痛的靶點。

    1.3 檳榔十三味丸止痛的蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡構建

    登錄STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/),輸入各交集靶點,設置物種為“人類”,選取最高等置信度(0.9,其余參數(shù)保持默認),獲取靶蛋白相互作用數(shù)據(jù),構建PPI網(wǎng)絡。

    1.4 GO功能富集與KEGG通路富集分析

    將所得成分與疾病共同的靶基因通過DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進行基因本體論(Gene ontology,GO)功能注釋與京都基因、基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析,通過GO富集提取靶標基因或蛋白質的分子功能(Molecular function,MF)、細胞組分(Cellular component,CC),及其所參與的生物過程(Biological process,BP),通過這三類功能,對一個基因的功能進行多方面的限定和描述。通過KEGG通路(Pathway)富集靶點所涉及的信號通路,以P<0.05為條件進行靶基因篩選,分析檳榔十三味丸發(fā)揮止痛作用的主要信號通路及生物過程。利用Omicshare Tools平臺,對GO富集與KEGG富集結果進行可視化。

    1.5 膜片鉗實驗

    1.5.1 藥品與試劑 藥品檳榔十三味丸(內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司采購,國藥準字Z15020412)。HEK-293系細胞、辣椒素(Selleck,批號:S199002)、辣椒平(Selleck,批號:S813701)、肉桂醛(Solarbio,批號:924E021)、Ruthenium Red(Simga,批號:BCCB3092)、DMSO(Sigma-Aldrich,批號:BCCD7238)、EGTA(Sigma,批號:SLCB4238)、NaCl(Sigma,批號:SLCC5939)、KCl(Sigma,批號:SLBW2757)、EGTA(Sigma,批號:SLCB4238)、HEPES(Sigma,批號:A0720)、D-Glucose(Sigma,批號:SLBT7079)等。

    1.5.2 實驗儀器 研缽、超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司,型號KQ2200DE)、離心機(長沙易達儀器有限公司,型號TDZ5M)、膜片鉗放大器(HEKA Electronics,型號EPC10)、數(shù)據(jù)獲取和分析軟件(HEKA,型號PatchMaster & IGOR)、微電極拉制儀(Sutter Instruments,型號P97)等。

    1.5.3 化合物制備 取檳榔十三味丸,將水丸研成粉末,稱量出321.6 mg粉末加入50 mL細胞外液,震蕩溶解,40 ℃超聲后過濾,配制成10 mg/mL,目測待測樣品的溶解性,至檳榔十三味丸全部溶解沒有肉眼可見的沉淀。將50 mg辣椒素利用1 637.14 μL二甲基亞砜(DMSO)配制成100 mmol/L的儲液,后用DMSO將儲液稀釋成為10 mmol/L的稀釋液,最后用細胞外液將稀釋液配成10 μmol/L的液體。將10 mg辣椒平利用263.47 μL DMSO配制成100 mmol/L的儲液,后用DMSO將儲液稀釋成為10 mmol/L的稀釋液,最后用細胞外液將稀釋液配成10 μmol/L的液體。將20 mg肉桂醛用593.22 μL無水乙醇配制成250 mmol/L的儲液,后用10 mL的細胞外液將供試品儲液,配成250 μmol/L液體。將11.86 mg Ruthenium Red用502.74 μL超純水配制成30 mmol/L的儲液,用10 mL的細胞外液將供試品儲液,配成100 μmol/L液體,后用10 mL的細胞外液將供試品儲液,配成100 μmol/L液體。

    1.5.4 細胞培養(yǎng)和傳代 TRPV1、TRPA1穩(wěn)定表達的HEK-293細胞系在含有10%胎牛血清及100 μg/mL Zeocin、10 μg/mL Blastincidin的Dulbecco’s Modified Eagle’s medium(DMEM)培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為37 ℃,二氧化碳濃度為5%。傳代時,除去舊培養(yǎng)基并用PBS洗一次,然后加入1 mL 0.25%-Trypsin-EDTA溶液,37 ℃ 孵育0.5 min左右。當細胞從皿底脫離,加入約5 mL 37 ℃預熱的完全培養(yǎng)基。將細胞懸液用吸管輕輕吹打使聚集的細胞分離。將細胞懸液轉移至無菌的離心管中,1 000 pm離心5 min收集細胞。擴增或維持培養(yǎng),將細胞接種于6 cm細胞培養(yǎng)皿,每個細胞培養(yǎng)皿接種細胞量為2.5×105Cells(最終體積:5 mL)。細胞用0.25%-Trypsin-EDTA分離,將8×103或3×103細胞鋪到蓋玻片上,在24孔板中培養(yǎng)(最終體積:500 μL),并加入四環(huán)素誘導,18 h后,進行試驗檢測。

    1.5.5 全細胞膜片鉗實驗 電生理試驗在室溫下進行,全細胞膜片鉗記錄全細胞TRPV1電流的電壓刺激方案如下:當形成全細胞封接后細胞膜電壓鉗制于0 mV。記錄電壓由0 mV階躍至-100 mV維持1 ms,然后給予300 ms Ramp刺激至100 mV。全細胞TRPA1電流的電壓刺激方案如下:當形成全細胞封接后細胞膜電壓鉗制于-80 mV。記錄電壓由0 mV階躍至-100 mV維持1 ms,然后給予300 ms Ramp刺激至100 mV。兩種方案均每隔5 s重復采集數(shù)據(jù),觀察藥物對TRPV1/TRPV1電流的作用。試驗數(shù)據(jù)由EPC-10放大器(HEKA Electronics)進行采集并儲存于PatchMaster(HEKA Electronics)軟件中。

    用微電極拉制儀將毛細玻璃管拉制成記錄電極。在倒置顯微鏡下操縱微電極操縱儀將記錄電極接觸到細胞上,給予負壓抽吸,形成GΩ封接。形成GΩ封接后進行快速電容補償,然后繼續(xù)給予負壓,吸破細胞膜,形成全細胞記錄模式。然后進行慢速電容的補償并記錄膜電容及串聯(lián)電阻,不給予漏電補償。

    TRPV1所用的細胞外液為140 mmol/L NaCl,5 mmol/L KCl,2 mmol/L MgCl2·6H2O,2 mmol/L CaCl2·2H2O,5 mmol/L D-Glucose,10 mmol/L HEPES,NaOH調(diào)節(jié)pH=7.4。細胞內(nèi)液為140 mmol/L CsCl,2 mmol/L MgCl2·6H2O,5 mmol/L CaCl2·2H2O,10 mmol/L EGTA,10 mmol/L HEPES,1 mmol/L Mg-ATP,CsOH調(diào)節(jié)pH=7.2。TRPA1所用的細胞外液為140 mmol/L CsCl,2 mmol/L MgCl2·6H2O,5 mmol/L CaCl2·2H2O,10 mmol/L EGTA,1 mmol/L Mg-ATP,10 mmol/L HEPES,CsOH調(diào)節(jié)pH=7.4。細胞內(nèi)液為120 mmol/L CsCl,10 mmol/L EGTA,1 mmol/L MgCl2·6H2O, 10 mmol/L HEPES,0.3 mmol/L Na2-GTP,4 mmol/L Mg-ATP,CsOH調(diào)節(jié)pH=7.2。以上所有細胞外液保存時間為2周,細胞內(nèi)液配好后分裝為每管1 mL,凍存于-20 ℃冰箱。

    2 結果

    2.1 復方成分靶點收集

    以口服生物利用度(Oral bioavailability,OB)>30%及藥物相似度(Drug likeness,DL)>0.18為篩選條件,收集成分。整合所有成分預測靶點,刪除重復成分及靶點,共得86個成分及920個靶點,其中,紫硇砂藥材涉及的成分多為礦物質,各數(shù)據(jù)庫尚未收錄相關靶點,相關成分信息見表1。

    表1 復方成分信息

    續(xù)表1

    2.2 復方治療相關疼痛疾病靶點

    整合3個疾病數(shù)據(jù)庫,刪除重復靶點,共得疼痛靶點12 171個、炎癥疼痛靶點7 497個、抑郁疼痛疾病靶點7 508個及神經(jīng)疼痛靶點9 840個。將920個成分靶點與疾病靶點分別進行相交,得出805個復方治療疼痛靶點、732個治療炎癥疼痛靶點、713個治療抑郁疼痛靶點及793個治療神經(jīng)疼痛靶點。通過整理對比數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),治療炎癥/抑郁/神經(jīng)疼痛的靶點均包含在復方治療疼痛靶點中,相關信息如圖1所示。同時,在治療疾病的靶點中,發(fā)現(xiàn)多個與熱敏通路相關的靶點:TRPA1、TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPM8[6]。對于這幾種熱敏通路靶點,通過整理得出了靶點主要分布的化學成分,并通過Cytoscape 3.6.1 軟件構建“藥材-成分-熱敏”靶點,如圖2。

    圖1 疾病靶點相關性

    圖2 “藥材-成分-熱敏”靶點

    2.3 PPI網(wǎng)絡構建

    將交集靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫,分別得出本方治療疼痛靶點的相互作用網(wǎng)絡,如圖3。

    圖3 復方止痛的PPI網(wǎng)絡

    2.4 富集分析

    對“2.2”中的疼痛交集靶點分別進行GO富集與KEGG富集分析,其富集基本信息見表2。根據(jù)所含靶點量排序,選取排名前20個條目進行可視化,發(fā)現(xiàn)所占條目一致。故選取一種結果進行顯示,結果如圖4、圖5。

    表2 疾病富集信息

    圖4 GO功能富集分析

    圖5 KEGG通路富集分析

    結果顯示,在生物過程中生物調(diào)節(jié)與代謝過程相關性較高,主要涉及藥物反應、RNA聚合酶II啟動子轉錄的負調(diào)控、ERK1和ERK2級聯(lián)陽性調(diào)節(jié)、基因表達的正調(diào)控、胞質鈣離子濃度的正調(diào)控;在細胞組成中等離子體膜、細胞質、膜的積分分量、質膜、細胞表面、細胞內(nèi)空間、內(nèi)質網(wǎng)膜、黏著斑和樹突所占比例較大;在分子功能中蛋白結合、ATP結合、金屬離子結合、蛋白質同源二聚化、相同蛋白質結合和蛋白質激酶結合所占比例較大。而KEGG所富集的調(diào)控因子中涉及到對熱敏通路的多環(huán)節(jié)影響,主要包括神經(jīng)組織受體的刺激、炎癥介質調(diào)控以及通路信號的調(diào)節(jié)等方面。

    3 檳榔十三味丸水提物對熱敏通道TRPV1/TRPVA1的影響

    在膜片鉗上測試檳榔十三味丸水提取物(10 mg/mL)對穩(wěn)定表達TRPV1的HEK293細胞跨膜電流的影響,細胞外液為陰性對照,10 μmol/L辣椒素作為陽性對照。實驗時先加細胞外液,觀察電流的基線水平,穩(wěn)定后滴加檳榔十三味丸水提物觀察電流變化,最后滴加10 μmol/L辣椒素對比其誘導的跨膜電流,見圖6。實驗結果顯示,與細胞外液相比,檳榔十三味丸水提取物能夠誘導轉染TRPV1的HEK293細胞產(chǎn)生明顯的跨膜電流,而TRPV1的競爭性拮抗劑辣椒平(10 mmol/L)可完全抑制該電流。

    在膜片鉗上測試檳榔十三味丸水提取物(10 mg/mL)對穩(wěn)定表達TRPA1的HEK293細胞跨膜電流的影響,細胞外液為陰性對照,250 μmol/L肉桂醛為陽性對照。實驗時先加細胞外液,觀察電流的基線水平,穩(wěn)定后滴加檳榔十三味丸水提物觀察電流變化,最后滴加肉桂醛見圖7。實驗結果顯示,與細胞外液相比,檳榔十三味丸水提取物能夠誘導轉染了TRPA1的HEK293細胞產(chǎn)生明顯的跨膜電流,而TRPA1的競爭性拮抗劑Ruthenium Red可完全抑制該電流。

    注:A:細胞外液,B:檳榔十三味丸水提取物10 mg/mL,C:辣椒素10 μmol/L,D:辣椒平10 μmol/L。

    注:A:細胞外液,B:檳榔十三味丸水提取物10 mg/mL,E:肉桂醛250 μmol/L,F(xiàn):Ruthenium Red 100 μmol/L。

    對檳榔十三味丸進行的全細胞膜片鉗實驗顯示,其水提取物在體外細胞模型上可以激活TRPA1/TRPV1。

    4 討論

    本研究應用網(wǎng)絡藥理學的技術與方法,探究檳榔十三味丸發(fā)揮止痛作用的化學成分、活性靶點以及作用通路。研究共從檳榔十三味丸的13味藥材中篩選出86個化學成分及920個靶點,復方治療疼痛靶點805個,包含732個治療炎癥疼痛靶點、713個治療抑郁疼痛靶點及793個治療神經(jīng)疼痛靶點。同時發(fā)現(xiàn)篩選出的86個化學成分中與熱敏通道(TRPA1、TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPM8)相關的化合物共21個。其中二十碳五烯酸(EPA)、酞酸雙(2-乙基己基)酯能夠同時作用于TRPA1、TRPV1、TRPV4通道。蓽茇寧(Piperlonguminine)和N-異丁基十八碳-2,4,8-三烯酰胺(N-isobutyleicosa-2(E),4(E),8(Z)-trienamide)能同時激活TRPV1、TRPV2及TRPV4通道。11,14-二十碳二烯酸(11,14-eicosadienoic acid)、11,14,17-二十碳三烯酸(11,14,17-Eicosatrienoic acid)能夠激活TRPV1、TRPM8通道。

    現(xiàn)代藥理研究表明,檳榔十三味丸的多種化學成分具有抗炎、止痛的藥理活性。二十碳五烯酸具有抗炎[7]、抗氧化、調(diào)解血脂[8]、保護心血管[9]的作用,在慢性疼痛與抑郁共病的小鼠模型中,能顯著增加抗炎細胞因子表達,調(diào)節(jié)小鼠內(nèi)側前額葉皮層、海馬、中腦導水管周圍灰質、杏仁核中的TRPV1、pERK和pNKκB等免疫反應信號活性,發(fā)揮治療痛覺過敏和抑郁行為的作用[10]。蓽茇寧和N-異丁基十八碳-2,4,8-三烯酰胺是蓽茇酰胺類化合物,蓽茇寧具有保護心臟缺血性損傷、保護神經(jīng)[11-12]、抗炎[13]、抗腫瘤[14]、調(diào)節(jié)血脂、鎮(zhèn)痛[15]等藥理作用,可抑制脂多糖誘導腫瘤壞死因子-α(TNF-α)或白細胞介素-6(IL-6)的產(chǎn)生,抑制核因子-jB(NF-jB)或細胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK) 1/2的激活[16]。11,14-二十碳二烯酸是omega-6多不飽和脂肪酸類化合物,與PKC-ε的活化相關,能夠下調(diào)iNOS的表達,顯著降低脂多糖誘導的NO水平,發(fā)揮抗炎作用[17]。11,14,17-順-二十碳三烯酸甲酯,研究表明可以抑制人星形細胞瘤D384勻漿中SNP刺激鳥苷酸環(huán)化酶,阻礙cGMP形成[18]。

    對交集靶點PPI網(wǎng)絡進行網(wǎng)絡拓樸學分析,顯示從檳榔十三味丸的13味藥材中篩選出的多個炎癥疼痛、抑郁疼痛及神經(jīng)疼痛的靶點,與熱敏通道(TRPA1、TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPM8)有關。因此,為進一步探究檳榔十三味丸對熱敏通道作用,本課題組在HEK29細胞[19]上,運用全細胞膜片鉗技術探究檳榔十三味丸水提物對轉染TRPV1/TRPA1的影響。結果發(fā)現(xiàn)檳榔十三味丸水提取物能夠激活TRPA1和TRPV1通道。提示檳榔十三味丸發(fā)揮止痛、抗炎作用的分子機制可能與活化熱敏通道TRPV1/TRPA1有關。

    近年來熱敏通路屬于瞬時受體電位(TRPs)[20]得到重視,被認為是下一代鎮(zhèn)痛藥的潛在靶點。既能感受特定的溫度刺激,又是傷害性感受器,還是機械刺激和滲透壓感受器,外周感覺神經(jīng)的多重信號在此匯聚,是調(diào)控外周神經(jīng)疼痛的關鍵[21-22]。TRPV1、TRPA1作為細胞傳感器,兩者在背根神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元中共同表達,在傳遞有害刺激以及神經(jīng)源性炎癥和痛覺過敏的產(chǎn)生中發(fā)揮關鍵作用[23]。以TRPV1為例,酸(pH<5.0)、辣椒素、溫度>43 ℃等均能夠激活,產(chǎn)生酸、熱、灼、痛的混合感覺[24-26]。當TRPV1、TRPA1通道被激活,細胞中游離的鈣離子濃度增高[27],誘導痛覺過敏中樞敏化過程中起關鍵作用的細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)快速磷酸化進而活化[28-29]。同時,Ca2+內(nèi)流導致神經(jīng)肽和炎性介質的釋放及表達,如SP、CGRP、ATP等,他們可誘導或增強外周炎性反應及免疫反應,進而產(chǎn)生超敏和痛覺過敏等臨床癥狀,而對TRPV1、TRPA1持續(xù)活化之后的脫敏發(fā)揮了止痛效果[30-32]。

    綜上所述,本研究基于網(wǎng)絡藥理學分析法[33]與體外驗證得出,激活TRPs通路是蒙藥檳榔十三味丸抗炎止痛的關鍵。這為蒙醫(yī)臨床治療赫依類相關疾病提供了現(xiàn)代用藥依據(jù),亦為蒙藥單味藥藥效及經(jīng)典制劑(如安神補心六味丸治療冠心病機制)的研究提供研究思路,但檳榔十三味丸調(diào)節(jié)TRPs熱敏通路的細節(jié)尚待闡明。

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