屎腸球菌自溶的基因表達(dá)差異分析

聶俊輝， 郭 浩， 王 通， 郭建軍， 曾 靜， 袁 林*

（1.江西省科學(xué)院微生物研究所，江西南昌 330096；2.上饒市農(nóng)林水科學(xué)研究中心，江西上饒 334000；3.江西鑫維生物技術(shù)有限公司，江西南昌 330096）

屎腸球菌（Enterococcus faecium）為革蘭氏陽性菌，屬于腸球菌屬，是一種兼性厭氧菌，廣泛存在于傳統(tǒng)乳制品、發(fā)酵食品、人類和動(dòng)物的腸道當(dāng)中（景宇超等，2018；Kivan，c等，2016；王曉蕊等，2016；Hassanzadazar等，2014）。屎腸球菌能產(chǎn)生諸如細(xì)菌素、有機(jī)酸、消化酶等多種抗菌物質(zhì)，能夠抑制病原微生物繁殖，平衡腸道的微生態(tài)環(huán)境（羅強(qiáng)等，2021；歐秀玲等，2021；田豐松等，2016；王永等，2013）。由屎腸球菌制成的飼用微生態(tài)制劑能夠調(diào)節(jié)動(dòng)物的腸道菌群平衡，減少腹瀉等多種消化道系統(tǒng)疾病的發(fā)生率，提高動(dòng)物對(duì)飼料的利用率，對(duì)提高動(dòng)物的養(yǎng)殖性能有著良好的促進(jìn)作用（王衛(wèi)衛(wèi)等，2021；肖冉等，2020；夏玉等，2014）。

關(guān)于屎腸球菌活菌制劑的制備，影響其生產(chǎn)能力的因素有多種。改善外界的環(huán)境因素，如調(diào)節(jié)培養(yǎng)基配方、優(yōu)化發(fā)酵條件等，能夠有效提高屎腸球菌的生物量和存活率（陳志娜等，2021；劉斯斯等，2021）。同時(shí)，菌體自身的一些生理特點(diǎn)同樣能夠會(huì)對(duì)菌劑的制備造成影響（胡衛(wèi)國等，2016）。屎腸球菌發(fā)酵過程中易自溶的特點(diǎn)限制了其產(chǎn)能的提升，制約了其大規(guī)模的制備。因此，通過對(duì)屎腸球菌自溶這一生理現(xiàn)象的研究，能夠?yàn)榫甑母咝阅苌a(chǎn)提供理論依據(jù)和改進(jìn)方向。

RNA測(cè)序（RNA-Seq）也稱為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，該技術(shù)是轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的重要手段。通過對(duì)研究對(duì)象某一特定狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來的幾乎所有RNA進(jìn)行測(cè)序，獲得該狀態(tài)下研究對(duì)象的基因表達(dá)水平，能夠從基因的整體水平反映基因功能及生物學(xué)過程（宋尚橋等，2020；Stark等，2019）。目前在對(duì)細(xì)菌生理及功能的研究中也廣泛運(yùn)用了高通量測(cè)序技術(shù)。郭金鳳等（2020）使用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析了副干酪乳桿菌在乙醇脅迫下的基因表達(dá)情況，得到了6個(gè)可能與抵制乙醇對(duì)自身損害相關(guān)的基因，為闡明乳桿菌的耐乙醇機(jī)制提供了一定的理論依據(jù)。宋雪飛等（2017）使用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析了植物乳桿菌在鹽脅迫下的基因表達(dá)變化，為提高植物乳桿菌在工業(yè)中生產(chǎn)中的耐受性積累了科學(xué)依據(jù)。

鑒于屎腸球菌自溶機(jī)制在屎腸球菌制備中的重要性，本研究對(duì)自溶狀態(tài)下的屎腸球菌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)比正常狀態(tài)下的菌體，從基因表達(dá)層面探究屎腸球菌自溶狀態(tài)下基因表達(dá)的情況，分析屎腸球菌自溶的分子機(jī)制及在該過程中的關(guān)鍵通路，為屎腸球菌的培養(yǎng)優(yōu)化、基因工程改良等奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 屎腸球菌EXW275由江西省科學(xué)院微生物研究所分離保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基（郭建軍等，2019）：葡萄糖20.0 g、胰化蛋白胨10.0 g、酵母提取物4.0 g、牛肉膏8.0 g、檸檬酸銨2.0 g、七水磷酸氫二鉀2.0 g、三水醋酸鈉4 g、七水硫酸鎂0.6 g、一水硫酸錳0.25 g、Tween 80 1.0 mL，蒸餾水定容至1000 mL，調(diào)節(jié)pH至6.2，115℃滅菌20 min。需要時(shí)另加入15 g瓊脂制成固體培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌體培養(yǎng) 菌種活化及培養(yǎng)（郭建軍等，2019）：將保存的屎腸球菌菌種接種至MRS斜面培養(yǎng)基上活化，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，連續(xù)轉(zhuǎn)接活化兩次；再用接種環(huán)刮取兩環(huán)接種至液體MRS培養(yǎng)基中，37℃、120 r/min培養(yǎng)10 h作為種子菌液。在培養(yǎng)瓶中裝入發(fā)酵培養(yǎng)基后滅菌，無菌條件下向培養(yǎng)瓶內(nèi)接入種子菌液；初始發(fā)酵培養(yǎng)條件為：250 mL培養(yǎng)瓶裝100 mL培養(yǎng)基，接種量5%，初始pH 6.2，37℃，150 r/min，搖瓶培養(yǎng)20 h。取此時(shí)的菌體作為正常對(duì)照組。菌液繼續(xù)培養(yǎng)傳代至自溶發(fā)生，取此時(shí)菌體作為自溶組。

1.2.2 RNA提取 取菌液離心后去除上清液，保留菌體。使用TRIzol Reagent（Invitrogen）對(duì)菌體進(jìn)行裂解并提取總RNA，操作參照產(chǎn)品說明書。提取總RNA后加入適量DEPC水溶解，使用Nanodrop 2000檢測(cè)總RNA的濃度及純度。將合格的總RNA委托上海生工生物工程股份有限公司使用Illumina HiseqTM平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)處理及分析

1.2.3.1 數(shù)據(jù)評(píng)估及質(zhì)控 將測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識(shí)別（Base Calling）分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列。使用FastQC對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。使用Trimmomatic進(jìn)行質(zhì)量剪切，去掉含有帶接頭的、低質(zhì)量的序列，得到相對(duì)準(zhǔn)確的Clean數(shù)據(jù)。

1.2.3.2 RNAseq測(cè)序評(píng)估 使用Bowtie2將樣本有效數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組上，統(tǒng)計(jì)Mapping信息，并通過RSeQC根據(jù)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行冗余序列分析、插入片段分布等分析。采用Qualimap根據(jù)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行均一性分布檢查、基因組結(jié)構(gòu)分布等分析。使用BEDTools進(jìn)行基因覆蓋率統(tǒng)計(jì)分析和基因組上測(cè)序序列分布等分析。

1.2.3.3 表達(dá)水平分析 使用featureCounts和已知的基因模型評(píng)估基因的表達(dá)量；使用WGCNA進(jìn)行基因共表達(dá)分析；基于樣本的表達(dá)量矩陣進(jìn)行樣本比較分析等多方向的統(tǒng)計(jì)分析和探索。

1.2.3.4 表達(dá)差異分析 使用DESeq2進(jìn)行基因表達(dá)差異分析，對(duì)表達(dá)差異分析結(jié)果進(jìn)行可視化?；诓町惙治鼋Y(jié)果，進(jìn)行聚類分析；使用topGO進(jìn)行GO富集分析，并繪制顯著性GO有向無環(huán)圖；使用clusterProfiler進(jìn)行KEGG通路和COG分類富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制及序列比對(duì) 通過上海生工生物工程有限公司的測(cè)序平臺(tái)分別對(duì)屎腸球菌正常狀態(tài)和自溶狀態(tài)下的樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后，共獲得89266999個(gè)raw reads。經(jīng)過質(zhì)量剪切，去掉含有帶接頭的、低質(zhì)量的序列，得到相對(duì)準(zhǔn)確的clean reads?？偣搏@得正常狀態(tài)下44674190個(gè)clean reads，平均reads長度為138.3 bp，GC含量為42.51%，Q10、Q20、Q30 Bases Ratio分別為99.91%、98.33%、93.93%；自溶狀態(tài)下41888670個(gè)clean reads，平均reads長度為137.9 bp，GC含量為42.32%，Q10、Q20、Q30 Bases Ratio分別為99.90%、98.15%、93.30%（表1）。以上結(jié)果表明當(dāng)前兩組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)量較為豐富，質(zhì)量較高。

表1 樣本測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制及序列比對(duì)結(jié)果

將測(cè)序序列進(jìn)行基因組定位后分析，并通過RSeQC統(tǒng)計(jì)比對(duì)結(jié)果。結(jié)果顯示屎腸球菌正常狀態(tài)下序列能定位到基因組上的占比總計(jì)（Total mapped）為96.17%，在參考序列上有多個(gè)比對(duì)位置的測(cè)序序列的數(shù)量統(tǒng)計(jì)（Multiple mapped）為21.45%，在參考序列上有唯一比對(duì)位置的測(cè)序序列的數(shù)量統(tǒng)計(jì)（Unique mapped）為74.72%，整段比對(duì)到外顯子的測(cè)序序列（Non-splice reads）統(tǒng)計(jì)為74.72%；屎腸球菌自溶狀態(tài)下序列能定位到基因組上的占比總計(jì)為64.42%，在參考序列上有多個(gè)比對(duì)位置的測(cè)序序列的數(shù)量統(tǒng)計(jì)為21.30%，在參考序列上有唯一比對(duì)位置的測(cè)序序列的數(shù)量統(tǒng)計(jì)為43.11%，整段比對(duì)到外顯子的測(cè)序序列統(tǒng)計(jì)為43.11%（表2）。

表2 參考序列比對(duì)結(jié)果

2.2 基因表達(dá)量分析及差異基因篩選 基因表達(dá)水平的直接體現(xiàn)就是其轉(zhuǎn)錄本的豐度情況，豐度越高，則基因表達(dá)水平越高。通過定位到基因組外顯子區(qū)的測(cè)序序列計(jì)數(shù)來評(píng)估基因的表達(dá)水平，使用TPM（Transcripts per million）來計(jì)量在RNA池中的轉(zhuǎn)錄比例。通過對(duì)基因表達(dá)量密度分析發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌正常和自溶狀態(tài)下基因表達(dá)的密度出現(xiàn)明顯區(qū)隔，自溶狀態(tài)下的基因表達(dá)出現(xiàn)了改變（圖1）。

圖1 基因表達(dá)量密度曲線圖

通過對(duì)兩組樣本進(jìn)行主成分分析（PCA）和主坐標(biāo)分析（PCoA）發(fā)現(xiàn)，PC1、PC2、PC3分別為72.53%、10.79%、8.43%，PCo1、PCo2、PCo3分別為99.47%、0.35%、0.12%（圖2）。以上結(jié)果說明兩組樣本間組內(nèi)重復(fù)性良好，組間差異明顯，組間差異顯著大于組內(nèi)樣本間差異，屎腸球菌自溶狀態(tài)下基因表達(dá)出現(xiàn)明顯改變。

圖2 PCA分析與PCoA分析

經(jīng)過對(duì)兩組樣本差異分析后，共篩選出差異表達(dá)基因783個(gè)，以屎腸球菌正常狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄基因作為對(duì)照組，自溶狀態(tài)下的屎腸球菌基因表達(dá)上調(diào)個(gè)數(shù)為689，下調(diào)個(gè)數(shù)為94，上調(diào)基因數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于下調(diào)基因數(shù)（圖3）。

圖3 屎腸球菌自溶狀態(tài)下差異表達(dá)基因展示圖

2.3 差異基因的功能注釋 GO（Gene Ontology）是一個(gè)國際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類體系，提供了一套動(dòng)態(tài)更新的標(biāo)準(zhǔn)詞匯表來全面描述生物體中基因和基因產(chǎn)物的屬性（Carbon等，2019）。GO總共有三個(gè)ontology，分別描述基因的分子功能（MF）、細(xì)胞組分（CC）、參與的生物過程（BP）（Blake等，2015）。將差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO功能統(tǒng)計(jì)分析，在三大功能分類中，分別包含了22（BP）、17（CC）、12（MF）個(gè)功能分類（圖4）。在生物過程中，差異基因分類在代謝過程、細(xì)胞過程、定位、生物調(diào)節(jié)的數(shù)量最多，分別為403、400、93、93個(gè)，分別占分類注釋基因的34.8%、35.75%、26.65%、37.80%；在細(xì)胞組成中，差異基因分類在細(xì)胞、細(xì)胞部分、胞膜、胞膜部分的數(shù)量最多，分別為434、431、213、187個(gè)，分別占分類注釋基因的39.10%、39.18%、26.89%、25.69%；在分子功能中，差異基因分類在催化活性、結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)活性、結(jié)構(gòu)分子活性的數(shù)量最多，分別為424、401、76、56個(gè)，分別占分類注釋基因的32.07%、35.02%、28.57%、96.43%（圖4）。

圖4 差異基因功能注釋

對(duì)屎腸球菌自溶下的差異表達(dá)基因進(jìn)行顯著性分析，富集程度最高的30個(gè)GO分類如圖5所示，富集程度最高的幾個(gè)分類為細(xì)胞、細(xì)胞部分、生物合成、有機(jī)物質(zhì)生物合成幾個(gè)方面。這說明屎腸球菌自溶狀態(tài)下的胞內(nèi)生物合成途徑出現(xiàn)顯著改變，與自溶的發(fā)生具有相關(guān)性。

圖5 差異基因功能富集分析

2.4 差異基因的KEGG分析 京都基因與基因組百科全書（KEGG）是基因組破譯方面的數(shù)據(jù)庫，在給出染色體中一套完整基因的情況下，其可以對(duì)蛋白質(zhì)交互（互動(dòng)）網(wǎng)絡(luò)在各種細(xì)胞活動(dòng)起的作用作出預(yù)測(cè)（Kanehisa等，2016；Kanehisa等，2000）。通過對(duì)屎腸球菌自溶下的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌自溶狀態(tài)下在核糖體、氨基酰基-tRNA生物合成、嘌呤代謝、肽聚糖生物合成、嘧啶代謝、同源重組、氨基酸合成等7個(gè)途徑具有顯著性（P<0.05）（表3）。在對(duì)自溶下表達(dá)下調(diào)的基因進(jìn)行聚類后則發(fā)現(xiàn)，下調(diào)的基因主要富集在碳代謝、糖酵解/糖異生、丙酮酸代謝等能量代謝相關(guān)通路（圖6）。

表3 差異表達(dá)基因KEGG顯著性富集分析

圖6 下調(diào)差異表達(dá)基因KEGG顯著性富集分析

3 討論

自溶是指在一定條件下菌體自身釋放被稱為自溶素（Autolysin）的肽聚糖水解酶（PGHs），水解細(xì)胞壁肽聚糖的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其裂解并向周圍環(huán)境釋放胞內(nèi)物質(zhì)的過程，是細(xì)菌程序性死亡的一種常見方式（Lewis 等，2000；Shockman 等 ，1996；Hltje等，1995）。影響細(xì)菌自溶的因素復(fù)雜多樣，培養(yǎng)基的成分、溫度、補(bǔ)料速率、接種量等均可能對(duì)自溶的發(fā)生產(chǎn)生影響（Vegarud等，1983），如培養(yǎng)基中碳源耗盡時(shí)會(huì)導(dǎo)致S.thermophilus和L.lactis的自溶，環(huán)境中NaCl濃度、乙醇含量或熱休克等可以導(dǎo)致S.thermophilus的自溶（Husson-Kao等，1999；Riefe等，1997），過高的補(bǔ)料速率和接種量導(dǎo)致大腸桿菌自溶的發(fā)生（饒犇等，2020）。盡管過去對(duì)細(xì)菌自溶的研究有很多，但是關(guān)于屎腸球菌自溶的原因及基因表達(dá)規(guī)律尚不明確。深入了解屎腸球菌自溶下基因的表達(dá)情況，對(duì)于挖掘探索自溶有關(guān)基因，分析導(dǎo)致屎腸球菌自溶的環(huán)境因素具有重要的意義。

細(xì)菌的自溶受到多種因素的影響，不同的菌種對(duì)環(huán)境變化的敏感性不同，涉及的機(jī)制復(fù)雜而多變。屎腸球菌自溶的分子機(jī)制尚不完全清楚，遺傳基礎(chǔ)了解相對(duì)較少。不同于過往從自溶酶等直接因素入手進(jìn)行乳酸菌自溶的研究，本研究選用屎腸球菌正常狀態(tài)下的菌體以及自溶發(fā)生時(shí)的菌體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過基因表達(dá)水平及聚類分析比較，從基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的角度探索自溶發(fā)生的機(jī)制?；赗NA-Seq的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析為全面了解屎腸球菌自溶發(fā)生的基因表達(dá)改變提供了技術(shù)支撐，為屎腸球菌自溶的分子機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)。

本研究將所有的差異基因進(jìn)行GO功能聚類分析，探索自溶下屎腸球菌的功能及代謝改變。差異基因富集程度最高的幾個(gè)分類為細(xì)胞、細(xì)胞組分、生物合成、有機(jī)物質(zhì)生物合成，揭示了屎腸球菌自溶狀態(tài)下菌體的細(xì)胞狀態(tài)改變以及菌體自身合成代謝的改變。KEGG通路分析則發(fā)現(xiàn)，大量差異基因富集在核糖體、氨基?；?tRNA生物合成、嘌呤代謝、肽聚糖生物合成、嘧啶代謝、同源重組等途徑當(dāng)中，說明自溶發(fā)生時(shí)菌體內(nèi)的生物合成途徑發(fā)生顯著改變。氨基?；?tRNA主要功能是通過將氨基酸與含有相應(yīng)反密碼子的tRNA精確匹配，把氨基酸傳遞到核糖體當(dāng)中進(jìn)行肽鏈的合成（Gomez等，2020；Ibba等，2000）。差異基因富集在核糖體、氨基?；?tRNA生物合成途徑，說明自溶狀態(tài)下菌體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成發(fā)生了變化；而差異基因同時(shí)富集在嘌呤代謝、嘧啶代謝以及同源重組途徑則說明了菌體內(nèi)核酸代謝途徑同樣發(fā)生了改變。蛋白質(zhì)與核酸合成的改變可能是屎腸球菌自溶發(fā)生的原因，也可能是自溶發(fā)生導(dǎo)致的結(jié)果，關(guān)于這一點(diǎn)，還需后續(xù)更加深入的研究來加以判斷。

肽聚糖是革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁的重要組成，革蘭氏陽性菌的自溶酶多是一些肽聚糖水解酶類（Chapot-Chartier等，2014；Vollmer等，2008）。大量差異基因富集在肽聚糖生物合成途徑中也證明了肽聚糖合成與自溶發(fā)生的強(qiáng)相關(guān)性。此外，將差異基因中下調(diào)的基因進(jìn)行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，下調(diào)的差異基因主要富集在碳代謝、糖酵解/糖異生、丙酮酸代謝等能量代謝相關(guān)通路中，說明屎腸球菌的自溶與對(duì)碳源的利用能力、能量的利用能力相關(guān)。以往有研究顯示碳源的不足會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌自溶的發(fā)生，如培養(yǎng)基中碳源耗盡時(shí)會(huì)導(dǎo)致S.thermophilus和L.lactis的自溶 （Kawasaki等，1998；Douglas等，1974）。結(jié)合屎腸球菌下調(diào)差異基因的分析結(jié)果，推測(cè)有可能是長期培養(yǎng)下屎腸球菌對(duì)碳源利用能力的下降導(dǎo)致能量供應(yīng)不足進(jìn)而促進(jìn)了菌體自溶的發(fā)生。

4 結(jié)論

本研究采用正常狀態(tài)下和自溶狀態(tài)下的屎腸球菌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，初步明確了自溶狀態(tài)下屎腸球菌差異基因表達(dá)情況、GO功能分類及KEGG富集通路，分析發(fā)現(xiàn)自溶狀態(tài)下屎腸球菌代謝發(fā)生了改變，能量利用出現(xiàn)下降。研究結(jié)果為進(jìn)一步分析屎腸球菌自溶相關(guān)機(jī)制，改善屎腸球菌自溶發(fā)生情況提供了理論研究基礎(chǔ)。