MAM在哺乳動物細(xì)胞中的研究進(jìn)展

徐 妲，馮 鑫，李亞秋，劉思彤，潘曉燕

（吉林醫(yī)藥學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)中心，吉林吉林 132013）

線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（MAM）具有獨(dú)特的生化特性，顯微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為與線粒體緊密相連的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）小管。MAM的功能范圍從脂質(zhì)代謝和鈣信號傳導(dǎo)到炎癥小體形成。與這些功能一致，MAM富含脂質(zhì)代謝酶和鈣處理蛋白（Dimmer等，2017）。在細(xì)胞應(yīng)激情況下，MAM會改變其調(diào)節(jié)蛋白組，如細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的改變，從而改變MAM的功能。在哺乳動物細(xì)胞中，MAM和線粒體之間接觸位點(diǎn)的形成是細(xì)胞存活所必需的，包括鈣從ER轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體、將磷脂酰絲氨酸從ER導(dǎo)入線粒體以脫羧為磷脂酰乙醇胺、形成自噬體，線粒體的形態(tài)、動力學(xué)功能以及細(xì)胞存活的調(diào)節(jié)。

1 MAM參與脂質(zhì)代謝

在哺乳動物中，大多數(shù)磷脂合成起源于ER，這些脂質(zhì)必須分布在整個(gè)細(xì)胞中才能組裝新的細(xì)胞器（Chauhan等，2016）。ER中合成的五種最突出的磷脂（按豐度降序排列）是磷脂酰膽（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰絲氨酸（PS）和磷脂酸。PS可以作為PE和PC的前體，它們是主要的細(xì)胞磷脂。磷脂必須被運(yùn)送到缺乏合成機(jī)制的膜上，以產(chǎn)生其完整脂質(zhì)庫。

PS在ER中由MAM酶PS合成酶1和PS合成酶2（PSS1和PSS2）合成。易位至線粒體后，PS被轉(zhuǎn)運(yùn)到哺乳動物細(xì)胞和酵母中的線粒體，并被磷脂酰絲氨酸脫羧酶（PSD）脫羧形成PE。最后，PE返回ER，磷脂酰乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶2（PEMT2）將其甲基化以合成PC。PSS1和PSS2這兩種酶都催化絲氨酸交換活性，而PSS1促進(jìn)膽堿交換（Fernandez等，2016）。PE生成中的限速步驟是將PS通過MAM轉(zhuǎn)移到線粒體中。此外，MAM含有膽固醇（CHOL）和神經(jīng)酰胺（CER）生物合成所必需的酶，可以促進(jìn)磷脂、CHOL和CER的運(yùn)輸（Issop等，2015）。在基礎(chǔ)或靜止?fàn)顟B(tài)下，位于MAM中的?；o酶A-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1（ACAT1）催化游離膽固醇形成膽固醇酯，從而控制膜結(jié)合和細(xì)胞質(zhì)脂滴儲存的膽固醇之間的平衡（Vance等，2014）。在應(yīng)激反應(yīng)下，膽固醇向線粒體的輸入是持續(xù)的，細(xì)胞色素P450隨后啟動類固醇的生成（Fujimoto等，2012）。在急性壓力或激素刺激下，MAM相關(guān)的類固醇生成急性調(diào)節(jié)蛋白（StAR）通過與VDAC2蛋白的相互作用促進(jìn)膽固醇進(jìn)入線粒體，從而啟動線粒體類固醇生成（Prasad等，2015）。此外，還有三磷酸腺苷酶家族蛋白3（ATAD3）在MA-10細(xì)胞的MAM中富集，其通過MAM來調(diào)節(jié)類固醇生成，從而在ER和線粒體之間引導(dǎo)膽固醇（Issop等，2015）。MAM脂筏微結(jié)構(gòu)域中的高濃度膽固醇可以為線粒體中的類固醇生成提供游離膽固醇 （Hayashi等，2010）。此外，降低MAM中的膽固醇可顯著促進(jìn)MAM和線粒體之間的關(guān)聯(lián)，并導(dǎo)致PS從頭合成的同時(shí)改善PE合成（Fujimoto等，2012）。MAM中似乎產(chǎn)生了一定的神經(jīng)酰胺庫，因?yàn)樗鼈冊诘鞍踪|(zhì)組中含有鞘磷脂磷酸二酯酶（SMASE）、神經(jīng)酰胺成酶（CerS）和二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶（DES）（Wu等，2010）。可見MAM的結(jié)構(gòu)與功能完整性的維護(hù)需要脂質(zhì)運(yùn)輸。

2 鈣信號穩(wěn)態(tài)

鈣離子 （Ca2+）是一種多功能的細(xì)胞內(nèi)信號分子，可調(diào)節(jié)哺乳動物的細(xì)胞和生理功能（Rodriguez等，2022）。在MAM中發(fā)現(xiàn)了多種形式的Ca2+通道和調(diào)節(jié)劑之間的相互作用，其調(diào)節(jié)Ca2+依賴的細(xì)胞功能以及維持Ca2+穩(wěn)態(tài)。Ca2+通道的功能是通過從細(xì)胞外空間流入的Ca2+或從細(xì)胞內(nèi)Ca2+儲存中釋放Ca2+來提高細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度。Ca2+通過與含有Ca2+結(jié)合域的蛋白質(zhì)結(jié)合來傳遞信息，并通過Ca2+傳感器蛋白（如鈣調(diào)蛋白）直接或間接調(diào)節(jié)其構(gòu)象和活性。細(xì)胞器間通信通常采用Ca2+信號的形式，這些Ca2+信號源自ER，其能調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞過程，如代謝、受精、遷移和細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)等（Carafol等，2016）。Ca2+信號的主要目標(biāo)是線粒體，ER到線粒體Ca2+轉(zhuǎn)移通過線粒體相關(guān)的MAM，即位于線粒體附近的ER結(jié)構(gòu)。MAM中Ca2+的濃度比細(xì)胞溶膠中的高多倍，從而能使線粒體快速攝取Ca2+。ER到線粒體界面的不同蛋白質(zhì)維持兩個(gè)細(xì)胞器之間的Ca2+轉(zhuǎn)移。肌醇三磷酸（IP3R）是位于ER膜上的依賴性鈣通道，其能控制Ca2+從ER到胞質(zhì)溶膠的流出，IP3R在細(xì)胞分化、存活和凋亡中發(fā)揮作用。當(dāng)ER和線粒體被特定的錨定蛋白束縛時(shí)，ER膜上的IP3R可以在OMM處與VDAC1組裝，這要?dú)w功于Grp75、TOM70和MCU蛋白質(zhì)。這種復(fù)合物有利于ER通過IP3Rs釋放的Ca2+直接隧穿到線粒體，從而刺激線粒體代謝。由于能量產(chǎn)生和細(xì)胞死亡可以由不同水平的Ca2+觸發(fā)，因此MAM在線粒體中Ca2+水平的精細(xì)化中起著關(guān)鍵作用。生理?xiàng)l件下線粒體Ca2+的上調(diào)會激活線粒體酶，從而促進(jìn)TCA循環(huán)和氧化磷酸化。可見ER到線粒體功能性的缺陷降低了線粒體Ca2+攝取的效率，從而抑制了線粒體代謝。

在線粒體中，Ca2+信號取決于其功能特性。雖然Ca2+振蕩刺激新陳代謝并構(gòu)成促生存信號，但線粒體Ca2+超載導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。許多化療藥物依賴于有效的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)線粒體Ca2+信號來發(fā)揮其功能。 Ca2+信號的特異性是通過控制Ca2+增加的幅度和時(shí)空特性來實(shí)現(xiàn)的。因此在空間上，Ca2+增加可能發(fā)生在Ca2+通道附近的受限微區(qū)或整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中，蛋白激酶磷酸酶和轉(zhuǎn)錄因子的Ca2+瞬變可以以不同頻率重復(fù)并由下游效應(yīng)分子來解碼。這種復(fù)雜Ca2+信號模式的機(jī)制，其包括Ca2+結(jié)合蛋白限制游離Ca2+的擴(kuò)散以及Ca2+本身和Ca2+傳感器對Ca2+運(yùn)輸系統(tǒng)的正負(fù)反饋調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)（Islam等，2020）。此外Ca2+對調(diào)節(jié)癌癥的增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成、線粒體能量產(chǎn)生和對細(xì)胞死亡的敏感性起著一定的作用。因此MAM可以調(diào)動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣信號的傳導(dǎo)來調(diào)節(jié)線粒體的活性。

3 線粒體形態(tài)功能調(diào)控

線粒體是動態(tài)的細(xì)胞器，不斷地進(jìn)行融合和裂變并沿細(xì)胞骨架移動。根據(jù)細(xì)胞類型和對細(xì)胞生理學(xué)的反應(yīng)，線粒體表現(xiàn)出多種結(jié)構(gòu)，從分布在整個(gè)細(xì)胞中的高度連接的管狀結(jié)構(gòu)到聚集在某些細(xì)胞中的碎片、聚集結(jié)構(gòu)。線粒體形態(tài)通過連續(xù)動態(tài)變化裂變和融合形成相互連接的線粒體網(wǎng)絡(luò)，這種動態(tài)形態(tài)對于正常的線粒體和細(xì)胞功能至關(guān)重要（Benard等，2009），它們與細(xì)胞凋亡也有著密切聯(lián)系。細(xì)胞凋亡刺激引發(fā)的線粒體裂變，伴隨著嵴解體、線粒體外膜的透化和細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白的釋放（Labbe等，2014），高分子質(zhì)量的GTP酶是這些形態(tài)動力學(xué)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。線粒體的兩個(gè)膜，即外膜和內(nèi)膜，有兩種不同的動力蛋白相關(guān)GTP酶介導(dǎo)膜融合。大量的調(diào)節(jié)蛋白存在于線粒體相關(guān)的MAM上，以保持細(xì)胞器之間的最佳距離并協(xié)調(diào)ER和線粒體的功能。哺乳動物外膜的融合由絲裂融合蛋白（Mfn1和Mfn2）和內(nèi)膜蛋白Opa1和Mgm1介導(dǎo)，它們對于線粒體融合至關(guān)重要（Tilokani等，2018）。哺乳動物線粒體分裂是由發(fā)動蛋白相關(guān)GTP酶Drp1介導(dǎo)的，而酵母中線粒體分裂是由Dnm1蛋白介導(dǎo)（Lee等，2016）。在哺乳動物中，Mfn2和Opa1分別是神經(jīng)退行性疾病Charcot-Marie牙齒病和常染色體顯性遺傳性視神經(jīng)萎縮疾病的致病基因產(chǎn)物 （Pipis等，2020）。

ER與線粒體接觸并在Drp1和Mff蛋白募集之前介導(dǎo)線粒體收縮，這表明ER在線粒體分裂中也有著重要的作用。之后發(fā)現(xiàn)ER結(jié)合肌動蛋白聚合蛋白INF2進(jìn)行肌動蛋白絲聚合，導(dǎo)致線粒體收縮（Sheffer等，2016）。肌動蛋白與Drp1融合會刺激Drp1蛋白GTP酶的活性，導(dǎo)致線粒體裂變（Ji等，2015）。除了INF2外，在線粒體上的肌動蛋白的組裝和分解都是瞬時(shí)發(fā)生的，這些過程是由肌動蛋白成核、結(jié)合蛋白和解聚蛋白介導(dǎo)（Moore等，2016）。除了驅(qū)動收縮外，肌動蛋白絲可以調(diào)節(jié)線粒體裂變所需的寡聚化蛋白Drp1（Hatch等，2016）。除了肌動蛋白之外，Syntaxin 17也是可以調(diào)節(jié)Drp1活性的蛋白質(zhì)（Arasaki等，2015）。Syntaxin 17是一種最初與ER到高爾基體細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸有關(guān)的SNARE（SNAP受體）蛋白，它定位于MAM和線粒體，與Drp1在MAM的定位和活性中起到作用?？梢?，為了維持線粒體裂變和融合之間的平衡，需要ER、MAM和線粒體之間的緊密結(jié)合。

4 MAM相關(guān)蛋白的調(diào)控功能

MAM許多生理作用歸因于ER和線粒體元素之間的接觸位點(diǎn)的形成，因此，識別在MAM和線粒體之間起作用的蛋白質(zhì)已成為一個(gè)活躍的研究領(lǐng)域。這些接觸部位的ER和線粒體之間的距離為10～30 nm（Csordas等，2006），因此連接ER、MAM和線粒體的蛋白質(zhì)橋可以容納在這個(gè)空間內(nèi)。研究表明，鈣連接蛋白和氧化還原酶TMX的棕櫚?；筂AM中起作用的蛋白質(zhì)富集。此外，棕櫚?；稽c(diǎn)的突變阻止了這些蛋白質(zhì)在MAM中的積累，這表明蛋白質(zhì)棕櫚?；赡芴峁┮环N將某些蛋白質(zhì)靶向MAM的機(jī)制（Lynes等，2012）。從哺乳動物細(xì)胞和組織（Poston等，2013）以及酵母中分離出來的MAM中的蛋白質(zhì)，進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)篩選鑒定出的大多數(shù)蛋白質(zhì)，它們不太可能直接參與將MAM束縛到線粒體。大多數(shù)富含MAM的脂質(zhì)生物合成酶，它們不直接連接相鄰的膜，例如肌醇-1，4，5-三磷酸受體、σ因子-1、動力蛋白樣蛋白DRP1、氧化還原酶Ero1和MAM中參與鈣信號調(diào)節(jié)與轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)VDAC。而Akt介導(dǎo)的多功能磷酸弗林蛋白酶酸性氨基酸簇分選蛋白PACS2，是用于穩(wěn)定MAM結(jié)構(gòu)與功能的蛋白（Betz等，2013）。

大鼠肝線粒體的輕度蛋白水解表明，線粒體外膜含有PS輸入線粒體所需的蛋白質(zhì)。這表明線粒體蛋白質(zhì)參與了MAM和線粒體之間的關(guān)聯(lián)（Vance等，2015），PS進(jìn)入線粒體脫羧成PE不需要可溶性胞質(zhì)蛋白。然而，在牛腦中一種細(xì)胞溶質(zhì)的鈣結(jié)合蛋白S100B，透化中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞中PS向線粒體的輸入顯著增強(qiáng)，這表明S100B可能促進(jìn)MAM和線粒體之間的相互作用（Seguella等，2020）。在其他研究中，產(chǎn)生了一種突變CHO細(xì)胞系R41（Shiino等，2021），其中PS的熒光類似物從線粒體外膜的外葉輸入到線粒體內(nèi)膜外側(cè)的PSD位點(diǎn)被抑制。哺乳動物細(xì)胞中線粒體泛素連接酶MITOL調(diào)節(jié)ER到線粒體接觸的形成（Sugiura等，2013），這表明哺乳動物細(xì)胞的泛素化也可能促進(jìn)MAM到線粒體接觸位點(diǎn)的形成。

5 MAM參與細(xì)胞凋亡

哺乳動物細(xì)胞線粒體動力學(xué)和形態(tài)（即融合和裂變）受MAM到線粒體接觸點(diǎn)形成的調(diào)節(jié)（Hoppins等，2012）。在細(xì)胞凋亡過程中，由于分裂蛋白DRP1募集到線粒體外膜，線粒體碎片增加。相反，當(dāng)線粒體融合增加時(shí)，細(xì)胞凋亡會減弱（Wasiak等，2007），在MAM的多功能分選蛋白PACS2耗盡后也誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。PACS2的消耗使ER與線粒體解離并誘導(dǎo)線粒體斷裂（Simmen等，2005）。而Drp1與線粒體的結(jié)合在細(xì)胞凋亡過程中增加（Wang等，2015），并且線粒體斷裂位點(diǎn)的Drp1與細(xì)胞凋亡期間線粒體上的促凋亡蛋白Bax共定位（Wu等，2011）。雖然線粒體斷裂本身并不一定會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，但線粒體裂變?nèi)诤蠙C(jī)制的組成部分可以正負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡?？梢?，線粒體裂變和融合的速度可能與細(xì)胞程序性死亡過程直接相關(guān)。因此，MAM與線粒體接觸位點(diǎn)的破壞以及線粒體裂變的相應(yīng)增加與細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)有關(guān)，細(xì)胞凋亡也與線粒體的鈣狀態(tài)密切相關(guān)。電子斷層掃描研究表明，ER和線粒體的接觸部位可以增加細(xì)胞凋亡（Csordas等，2006）。例如，當(dāng)過量的鈣通過高度集中在MAM中的1，4，5-三磷酸肌醇受體，它從ER流出進(jìn)入線粒體時(shí)，就會發(fā)生細(xì)胞凋亡。相反，在部分耗盡肌醇-1，4，5-三磷酸受體的細(xì)胞中，細(xì)胞凋亡減弱 （Liang等，2017）。鈣從ER流入線粒體，促進(jìn)了促凋亡線粒體外膜蛋白Bax的寡聚化，并導(dǎo)致線粒體外膜的透化。因此，細(xì)胞色素C被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，在此處激活半胱天冬酶級聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（Deng等，2021）。Ca2+介導(dǎo)的線粒體分裂蛋白DRP1的激活也刺激Bax寡聚化并增加細(xì)胞凋亡（Hoppins等，2012）。綜上所述，MAM和線粒體之間接觸位點(diǎn)的形成，在功能上與線粒體Ca2+以及細(xì)胞凋亡有關(guān)。

6 MAM參與自噬

MAM自噬是一種細(xì)胞內(nèi)降解過程，是一種重要的機(jī)制，其需要不斷降解功能失?；虿恍枰?xì)胞的結(jié)構(gòu)，其中細(xì)胞質(zhì)成分被稱為自噬體的隔離雙膜結(jié)構(gòu)（Lamb等，2013）。自噬體與溶酶體融合成為自噬溶酶體，成分被溶酶體內(nèi)的蛋白酶和水解酶降解?；A(chǔ)自噬發(fā)生在條件正常的情況下，但營養(yǎng)缺乏和其他壓力會刺激自噬。自噬的執(zhí)行是由自噬相關(guān)蛋白質(zhì)Atg與參與膜運(yùn)輸?shù)牡鞍踪|(zhì)共同介導(dǎo)。自噬始于隔離膜即細(xì)胞自我吞噬的一個(gè)過程，隔離膜在ER富含磷脂酰肌醇3-磷酸（PI3P）的亞區(qū)中形成。隔離膜的擴(kuò)增可能是由于從起始開始合成脂質(zhì)，這是由兩種復(fù)合物ULK和PI3-激酶復(fù)合物的循環(huán)激活驅(qū)動的（Ktistakis等，2016），以及來自ER、高爾基體中間隔室、高爾基體、內(nèi)體和質(zhì)膜（Lamb等，2013）的膜供應(yīng)。新生的隔離膜吞噬細(xì)胞質(zhì)成分和隨著膜的閉合，它們最終從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分離以形成自噬體。通過MAM導(dǎo)入的PS在線粒體中合成的PE熒光類似物被遞送至自噬體。此外，自噬體的形成在細(xì)胞中受到嚴(yán)重?fù)p害，其中ER與線粒體接觸已因線粒體融合蛋白的消耗而中斷（Hamasaki等，2013）。因此，這些研究表明，自噬體的形成和自噬需要MAM與線粒體接觸。PE代謝和自噬體之間是自噬體標(biāo)記蛋白LC3與PE共價(jià)的連接（Magalhaes等，2021），增加了與LC3結(jié)合的PE在線粒體中由PS合成的可能性，即通過MAM輸入線粒體。

自噬體形成發(fā)生在MAM和線粒體接觸部位，自噬體標(biāo)記蛋白ATG5和ATG14在饑餓誘導(dǎo)的自噬過程中僅定位于ER與線粒體接觸位點(diǎn)，而在進(jìn)食狀態(tài)下，在MAM（Hong等，2019）中未檢測到ATG14。此外，ER線粒體接觸位點(diǎn)的破壞阻止了ATG14與MAM的關(guān)聯(lián)，并排除了自噬體形成。這表明饑餓誘導(dǎo)的自噬體的產(chǎn)生發(fā)生在MAM與線粒體接觸部位，并且可能需要線粒體衍生的PE的參與?？梢奙AM參與并調(diào)控細(xì)胞的自噬。

7 小結(jié)

細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持涉及多個(gè)細(xì)胞器的參與。作為ER與線粒體之間最直接的連接媒介，MAM直接位于這兩個(gè)細(xì)胞器之間，并緊密參與從ER到線粒體的應(yīng)激信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)；在某些情況下，它們會將凋亡信號傳遞回ER。這不僅保證了兩個(gè)細(xì)胞器之間功能的互補(bǔ)性，而且放大了兩個(gè)細(xì)胞器之間的凋亡信號，從而促進(jìn)了協(xié)調(diào)的功能反應(yīng)。MAM富含脂質(zhì)代謝酶和鈣處理蛋白。在細(xì)胞應(yīng)激情況下，如細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的改變，MAM會改變其調(diào)節(jié)蛋白組，從而改變MAM的功能。此外，MAM和線粒體接觸的缺陷可以導(dǎo)致心肌病、肥胖、癌癥和神經(jīng)退行性疾病等（Islam等，2020），有些疾病表現(xiàn)出線粒體形態(tài)和鈣穩(wěn)態(tài)的改變，增加的線粒體碎片可以通過氧化磷酸化減少ATP的產(chǎn)生，這都嚴(yán)重影響了線粒體的功能。這些表明MAM的功能改變可能是這些常見疾病發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)，這為后續(xù)的研究提供了理論依據(jù)。盡管近年來對MAM的研究取得了一些進(jìn)展，但MAM的潛在機(jī)制仍有一些不確定性，仍需要解決。因此對MAM需要更加深入的研究，期許MAM更進(jìn)一步的研究會使生殖醫(yī)學(xué)及生物工程技術(shù)產(chǎn)生新突破。