西弗射盾子囊霉引起外耳道炎1例*

張媛媛，潘李燕，魯 莉，智深深，鄔文燕

重慶大學(xué)附屬中心醫(yī)院/重慶市急救醫(yī)療中心檢驗(yàn)科,重慶 400014

西弗射盾子囊霉屬子囊菌類酵母菌，其可通過有性繁殖在子囊中產(chǎn)生子囊孢子，雖與孢子絲菌屬和念珠菌屬同源，但二者形態(tài)與生長(zhǎng)屬性有明顯區(qū)別[1]。西弗射盾子囊霉是一種少見的機(jī)會(huì)致病真菌，目前對(duì)其致病性的研究較少[2-3]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，西弗射盾子囊霉可能為人體表面或腸道中的正常菌群，當(dāng)機(jī)體免疫力低下時(shí)，可引起甲溝、外耳道等部位的感染，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致患者腹膜、腦膜等部位的深部感染和系統(tǒng)性感染[4-5]。本文報(bào)道了1例由西弗射盾子囊霉引起雙耳疼痛、聽力下降的病例，從該菌的形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)鑒定技術(shù)、藥物敏感性等方面闡述現(xiàn)代檢驗(yàn)技術(shù)對(duì)臨床少見病原菌菌種的鑒定和實(shí)施精準(zhǔn)治療的重要性。

1 病例資料

患者，男，64歲，因“掏耳后雙耳疼痛、聽力下降、流液5 d”就診于本院耳鼻喉科門診?；颊唠p側(cè)外耳道充血，可見白色分泌物附著，內(nèi)部結(jié)構(gòu)窺視不清。耳鏡檢查可見右耳道大量膿性分泌物，耳道皮膚充血，鼓膜充血水腫，下方小穿孔可見波動(dòng)，表面分泌物附著；左耳道壁見白色霉菌附著，鼓膜充血。左耳分泌物真菌涂片熒光染色查見菌絲(圖1)，故以真菌性外耳道炎收治入院。

注：箭頭所示為真菌菌絲、孢子。

患者既往有高血壓史，口服硝苯地平1片/天降壓治療，自訴血壓控制尚可。入院后測(cè)血壓116/78 mm Hg，根據(jù)患者既往病史診斷為高血壓。患者否認(rèn)有糖尿病史，入院時(shí)查隨機(jī)血糖為11.57 mmol/L,完善口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)及糖化血紅蛋白等檢查進(jìn)一步明確診斷。OGTT提示餐后2 h血糖顯著升高，達(dá)糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，胰島素及C肽釋放試驗(yàn)結(jié)果提示患者存在胰島素抵抗及胰島素釋放延遲，考慮為2型糖尿病。相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果：降鈣素原(PCT)0.08 ng/mL，白細(xì)胞介素-6(IL-6)<0.01 pg/mL，糖化血紅蛋白6.8%，甘油三酯(TG)3.74 mmol/L,尿酸436 μmol/L,乳酸2.72 mmol/L，尿糖++++，尿蛋白+。血常規(guī)、凝血功能、肝功能指標(biāo)檢測(cè)未見異常。

2 病原菌培養(yǎng)與鑒定

2.1菌落形態(tài)及鏡下形態(tài) 將左耳分泌物接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基、嗜血桿菌巧克力瓊脂選擇培養(yǎng)基，于35 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。24 h后血平板可見未溶血葡萄球菌生長(zhǎng)，巧克力平板未見菌落生長(zhǎng)，將原始血平板、巧克力平板放入CO2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后巧克力平板上可見2個(gè)直徑約2 mm、表面干燥的白色菌落生長(zhǎng)，經(jīng)革蘭染色，鏡下可見真、假菌絲和孢子，菌體周圍可見一層透明淺莢膜帶(圖2)。

圖2 西弗射盾子囊霉孢子、菌絲(革蘭染色，×1 000)

將巧克力平板上白色小菌落轉(zhuǎn)種至沙保羅平板，原始血平板、巧克力平板繼續(xù)于35 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。96 h后血平板上可見葡萄球菌與小菌落混合生長(zhǎng)(圖3A)，巧克力平板上見毛絨狀菌落生長(zhǎng)(圖3B)；24 h后沙保羅平板上見白色圓形菌落生長(zhǎng)(圖3C)。將沙保羅平板繼續(xù)于35 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，至11 d時(shí)菌落逐漸變得干燥，表面可見腦回狀皺褶，菌落與培養(yǎng)基鑲嵌，不易挑取和研磨，見圖4。將沙保羅平板培養(yǎng)的菌落進(jìn)行革蘭染色涂片、鏡檢，鏡下可見革蘭陽性酵母樣真菌及細(xì)長(zhǎng)菌絲，孢子呈圓形或卵圓形，周圍可見淺透明帶，見圖5。

注：A為血平板培養(yǎng)結(jié)果；B為巧克力平板培養(yǎng)結(jié)果；C為沙保羅平板培養(yǎng)結(jié)果。

圖4 沙保羅平板培養(yǎng)11 d結(jié)果

圖5 沙保羅平板培養(yǎng)11 d后菌落鏡下形態(tài)(革蘭染色，×1 000)

2.2菌種鑒定

2.2.1基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF MS)鑒定 取沙保羅平板上培養(yǎng)的純菌落，將其點(diǎn)在質(zhì)譜靶板上，加1 μL 70%甲酸溶液進(jìn)行蛋白裂解，干燥后加1 μL CHCA基質(zhì)液充分混勻，靜置、干燥后在質(zhì)譜儀上進(jìn)行鑒定。質(zhì)譜鑒定結(jié)果為西弗射盾子囊霉(置信度75分)。

2.2.2Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)及配套YST鑒定卡鑒定 取沙保羅平板上培養(yǎng)的菌落，用0.45%NaCl溶液中配制成2.0麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，采用Vitek YST卡進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果為西弗射盾子囊霉，可信度為93.0%。

2.2.316S DNA測(cè)序 采用EasyPure?Genomic DNA Kit試劑盒提取分離菌株的DNA。使用真菌通用引物ITS1 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括2×PCR Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。陽性產(chǎn)物送重慶默賽樂生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed網(wǎng)站BALST比對(duì),同源性為99.74%。

2.3藥敏試驗(yàn) 采用Sensititre YeastOne進(jìn)行真菌藥敏試驗(yàn)，取沙保羅平板上的菌落制備成為0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙海?0 μL菌懸液加入真菌藥敏液中混勻，試劑板每孔加入混勻后的真菌藥敏液100 μL，密封后于35 ℃孵育48 h后測(cè)得體外最低抑菌濃度(MIC)分別為阿尼芬凈0.03 mg/L、米卡芬凈0.03 mg/L、卡泊芬凈0.03 mg/L、5-氟胞嘧啶 2 mg/L、泊沙康唑 0.25 mg/L、伏立康唑 0.12 mg/L、伊曲康唑0.5 mg/L、氟康唑32 mg/L、兩性霉素B 2 mg/L。參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI) M60S2、CLSI M59和歐洲藥敏試驗(yàn)委員會(huì)(EUCAST) Version 9.0中念珠菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果判定規(guī)則，該菌對(duì)氟康唑耐藥。

3 治 療

給予患者外耳道耵聹沖洗，萘替芬酮康唑乳膏外用，口服抗菌藥物伊曲康唑膠囊0.2 g/d，微波治療2次/天，每次10 min。同時(shí)給予二甲雙胍緩釋片0.5 g 2次/天及達(dá)格列凈片10 mg 1次/天聯(lián)合降血糖治療。治療12 d后，患者雙耳無明顯流液，聽力較前提高，雙耳疼痛明顯好轉(zhuǎn)，外耳道通暢，充血好轉(zhuǎn)，水腫吸收，雙耳未見異常分泌物。

4 討 論

西弗射盾子囊霉屬于酵母菌亞門、酵母菌綱、酵母菌目、酵母菌科，需與念珠菌、隱球菌鑒別。本例患者左耳分泌物直接涂片查見菌絲，根據(jù)涂片中菌絲、孢子的形態(tài)特點(diǎn)，可大致對(duì)真菌種屬進(jìn)行區(qū)分，可為臨床經(jīng)驗(yàn)性用藥提供重要參考。標(biāo)本直接涂片法經(jīng)濟(jì)易行，在快速識(shí)別真菌感染中具有重要價(jià)值。白假絲酵母菌在科瑪嘉顯示平板上呈翠綠色，生長(zhǎng)速度明顯快于西弗射盾子囊霉，菌落呈光滑奶油樣，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間不能形成腦回狀菌落。西弗射盾子囊霉在科瑪嘉顯色平板上形成中心藍(lán)色、邊緣白色的腦回狀菌落。鏡下白假絲酵母菌呈橢圓形，菌絲為假菌絲，墨汁染色無透明帶，而西弗射盾子囊霉革蘭染色可見厚壁孢子、芽生孢子，可見真菌絲和假菌絲，墨汁染色可見一層透明淺莢膜帶，與新型隱球菌的厚莢膜有明顯差別。

本病例采用病原菌培養(yǎng)、涂片染色及傳統(tǒng)的生化反應(yīng)完成了菌株鑒定，同時(shí)采用質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF MS)鑒定菌株，兩種方法鑒定結(jié)果一致，且后者的報(bào)告時(shí)間較前者縮短24 h。最后采用16S DNA測(cè)序分析，證實(shí)此菌株為西弗射盾子囊霉，進(jìn)一步驗(yàn)證了各種鑒定技術(shù)結(jié)果的一致性。近年來，各種少見致病菌或新的菌種被檢出和發(fā)現(xiàn)，不但需要微生物檢驗(yàn)人員不斷深入了解和研究菌株的生物學(xué)特性與致病性，同時(shí)也需要充分應(yīng)用新的檢測(cè)手段，協(xié)助臨床對(duì)疾病實(shí)現(xiàn)快速診治。

西弗射盾子囊霉檢出率較低，目前尚未建立該菌的MIC標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)室大多參照念珠菌的判定標(biāo)準(zhǔn)[2]。西弗射盾子囊霉菌落干燥，且鑲嵌在平板里，菌落不易挑取和混勻，因此實(shí)施藥敏鑒定時(shí)需將菌落研磨后調(diào)整菌懸液濃度。西弗射盾子囊霉對(duì)抗真菌藥物的耐藥性較高，主要表現(xiàn)為對(duì)氟康唑耐藥，本例患者檢出的菌株對(duì)氟康唑耐藥，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[6-7]。研究表明，真菌耐藥機(jī)制主要與膜通透性降低、細(xì)胞壁合成障礙等相關(guān)[8-9]，西弗射盾子囊酶的耐藥機(jī)制是否與已知的耐藥機(jī)制一致尚需進(jìn)一步研究。近年來侵襲性真菌的耐藥率逐年上升，對(duì)少見菌株進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地鑒定及藥敏試驗(yàn)，對(duì)臨床精準(zhǔn)抗真菌治療具有重要意義。

西弗射盾子囊霉是一種條件致病真菌，在免疫力正常的個(gè)體中極少致病或僅出現(xiàn)淺表感染。隨著激素及其他免疫抑制劑類藥物的廣泛使用，西弗射盾子囊霉等少見真菌引起的感染逐年增多，尤其是合并惡性腫瘤、糖尿病、粒細(xì)胞減少癥等基礎(chǔ)疾病的患者，可能出現(xiàn)深部感染，甚至系統(tǒng)性感染，導(dǎo)致嚴(yán)重后果[10-11]。目前報(bào)道顯示，西弗射盾子囊霉淺表感染以耳部、皮膚、足部等較為常見，深部感染及系統(tǒng)性感染以腹膜、腦膜等最為常見[12-14]。該菌可導(dǎo)致新生兒血流感染，慢性阻塞性肺疾病患者肺部感染，免疫功能低下患者血流和中心靜脈感染等。在一項(xiàng)針對(duì)慢性腹瀉患者的研究中發(fā)現(xiàn)，該菌可加重身體衰弱、免疫功能低下、幼兒及老年人等免疫功能低下人群腹瀉的嚴(yán)重程度，導(dǎo)致嚴(yán)重脫水、營(yíng)養(yǎng)不良，甚至休克。西弗射盾子囊霉可引起腫瘤患者和粒細(xì)胞減少患者發(fā)生播散性念珠菌病這一嚴(yán)重并發(fā)癥，可引發(fā)患者發(fā)生膿毒血癥、多器官功能衰竭，甚至死亡。本例患者入院隨機(jī)血糖檢測(cè)結(jié)果為11.57 mmol/L,結(jié)合OGTT等相關(guān)檢測(cè)結(jié)果，符合2型糖尿病的診斷，屬于西弗射盾子囊霉感染的高危人群。西弗射盾子囊霉相關(guān)的慢性化膿性中耳炎常表現(xiàn)為耳道流膿，膿液呈黃色略帶臭味，常伴耳鳴，甚至引起聽力下降，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。本病例中患者年齡>60歲，隨著年齡的增長(zhǎng)，皮膚黏膜屏障功能下降，免疫及其調(diào)節(jié)功能減低，易出現(xiàn)感染等其他并發(fā)癥[15]。因此，須盡快明確病原菌，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果開展精準(zhǔn)治療，降低嚴(yán)重系統(tǒng)性感染的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，對(duì)發(fā)生淺表感染的老年糖尿病患者進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)時(shí)應(yīng)考慮少見真菌感染的可能。本研究通過鏡下形態(tài)、菌落形態(tài)、生化反應(yīng)初步識(shí)別病原菌，結(jié)合先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)快速鑒定病原菌并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，為臨床早期開展精準(zhǔn)治療提供重要依據(jù)。同時(shí)，抗菌藥物的敏感性降低不可避免，積極開展藥敏試驗(yàn)，對(duì)發(fā)現(xiàn)和了解耐藥性的傳播以及降低耐藥率也具有重要意義[16]。因此實(shí)驗(yàn)室應(yīng)綜合利用多種檢測(cè)方法，提高對(duì)少見病原菌的鑒定能力。