熱療通過靶向HOXB1誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡的研究

劉 威，張 帆，龍永貴

四川省樂山市人民醫(yī)院胸外科，四川樂山 614000

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占肺癌的85%，NSCLC患者總體5年生存率為 17.1%[1]。目前針對肺癌的治療是手術(shù)切除、聯(lián)合化療和放療[2-3]。盡管一些分子靶向藥物[如酪氨酸激酶抑制劑 (TKIs)]已應(yīng)用于治療表皮生長因子受體 (EGFR) 突變的 NSCLC 患者，但該疾病患者的總生存率仍然不高[4]。因此，需要開發(fā)新的治療策略來改善臨床結(jié)果。近年來，熱療已被公認(rèn)為某些癌癥(例如NSCLC)的臨床治療方法，可通過射頻消融(RFA)等技術(shù)誘發(fā)[5]。了解熱療作用背后的分子機(jī)制也許在一定程度上可以為臨床熱療提供進(jìn)一步的信息。然而，熱療影響NSCLC的確切機(jī)制仍未確定。基于此，本研究以NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827、NCI-H1299為研究對象，旨在探討熱療調(diào)控NSCLC細(xì)胞凋亡的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827、NCI-H1299購自普諾賽生物公司(貨號：CL-0016、CL-0094、CL-0165)。MTT試劑盒購自廣州珀西生物科技有限公司(貨號：M1020-500T)。Annexin V-FITC Apoptosis Kit購自深圳市文樂生物科技有限公司(貨號：K2003-400)。Cellfectin購自寶如億(北京)生物技術(shù)有限公司(貨號：10362100)。TRIzol試劑購自杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司(貨號：5301100)。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、核因子-κB(NF-κB)、同源盒結(jié)構(gòu)基因B1 (HOXB1)、N-α-乙酰轉(zhuǎn)移酶25NatB輔助亞單位蛋白(NAA25)、磷脂轉(zhuǎn)運ATP酶11A (ATP11AUN)、α-甲基?；?CoA消旋酶(AMACR)、含N-乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域蛋白1(NATD1)、含有無菌阿爾法和TIR結(jié)構(gòu)域蛋白1(SARM1)、驅(qū)動蛋白家族成員1C (KIF1C)、高爾基相關(guān)的含有γ適應(yīng)素耳的ARF結(jié)合蛋白2(GGA2)、激活T細(xì)胞的核因子2(NFATC2)的抗體均購自Abcam公司(貨號：ab9485、ab28849、ab168279、ab79490、ab105351、ab268062、ab109114、ab226930、ab125903、ab185557、ab2722)。C17orf49的抗體購自賽默飛公司(貨號：PA5-55083)。NF-κB luciferase reporter plasmid購自Yeasen公司(貨號：11501ES03)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理 將NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827、NCI-H1299維持在RPMI-1640培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有10%胎牛血清和100 U/mL青鏈霉素。細(xì)胞在含有37 ℃、5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本研究所有轉(zhuǎn)染均使用Cellfectin進(jìn)行。使用siHOXB1敲低目的基因(序列：正向5′-GAUCCCCUUCUUAGAGUACCCACUUUCAAGAGAAGUGGGUACU CUAAGAAGGUUUUUUA-3′，反向5′-AGCUUAAA AAACCUUCUUAGAGUACCCACUUCUCUUGAAA GUGGGUACUCUAAGAAGGG-3′)，對照為siGFP(GFP序列在人基因組中不存在，故作為陰性對照，序列：正向5′-GCCACAACGUCUAUAUCAUUU-3′，反向3′-UUCGGUGUUGCAGAUAUAGUA-5′)。使用HOXB1過表達(dá)質(zhì)粒過表達(dá)HOXB1(克隆于PCDNA3.1質(zhì)粒)，對照為Vector(PCDNA3.1空載體)。轉(zhuǎn)染前1 d，將NSCLC細(xì)胞以5×105細(xì)胞/孔的密度鋪板在6孔板中，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時生長到 70%～80% 的匯合度。根據(jù)制造商的方案，使用 Cellfectin時用上述siRNA或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在初始轉(zhuǎn)染后 48～72 h收獲NSCLC細(xì)胞用于進(jìn)一步分析。敲低或過表達(dá)效果使用免疫印跡檢測。

1.2.2細(xì)胞活力的檢測 為了分析熱療對NSCLC的影響，首先在37、40、43 、46 ℃的溫度下處理NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827、NCI-H1299 40 min。隨后，將細(xì)胞在 37 ℃、5%CO2的環(huán)境中再培養(yǎng)24 h，并且使用MTT法測定、評估細(xì)胞活力。

1.2.3細(xì)胞凋亡水平的檢測 為了確定用熱療處理的NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827、NCI-H1299是否發(fā)生凋亡，熱療處理細(xì)胞24 h后用Annexin V-FITC 和PI對細(xì)胞進(jìn)行染色，通過流式細(xì)胞術(shù)評估NSCLC細(xì)胞的凋亡水平。細(xì)胞凋亡定義為Annexin V陽性和 PI 陽性。

1.2.4高通量測序 RNA-seq由睿博公司進(jìn)行。用 TRIzol試劑提取37 ℃和43 ℃處理的NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827、NCI-H1299的總 RNA。根據(jù)制造商的說明，使用 TruSeq Small RNA Library Prep 試劑盒構(gòu)建 RNA 測序文庫。RNA 在 Illumina HiSeqTM2500 測序儀上進(jìn)行單端測序。 使用R軟件中的“edgeR”包分析 RNA-seq 數(shù)據(jù)。使用|log2(倍數(shù)變化)| ≥1的閾值過濾差異表達(dá)譜，且P<0.05。

1.2.5NF-κB活性的檢測 NF-κB luciferase reporter plasmid中插入了多個NF-κB的結(jié)合位點，激活的NF-κB可以結(jié)合質(zhì)粒上的元件進(jìn)行熒光素酶的轉(zhuǎn)錄、翻譯，因此可以通過熒光素酶活性檢測NF-κB的活性。將NF-κB luciferase reporter plasmid轉(zhuǎn)染NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827、NCI-H1299后，在43 ℃時裂解細(xì)胞并檢測luciferase活性。

1.2.6免疫共沉淀與免疫印跡 使用免疫共沉淀試劑盒檢測HOXB1與NF-κB之間的相互作用。用 RIPA 裂解緩沖液收集43 ℃時NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827、NCI-H1299中的蛋白質(zhì)，并補充有苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑。用二辛可寧酸(BCA)法測定上清液中的總蛋白含量，適當(dāng)質(zhì)量蛋白的變性蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后電轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜，使用抗GAPDH的抗體、抗NF-κB的抗體和抗HOXB1的抗體在 4 ℃ 下過夜。通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒觀察蛋白質(zhì)條帶。

2 結(jié) 果

2.1在37、40、43、46 ℃條件下NSCLC細(xì)胞的活力和凋亡水平 相比于37 ℃，NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827、NCI-H1299在40、43、46 ℃下的活力均顯著降低(P<0.05)，凋亡水平均顯著上升(P<0.05)。相比于37、40、46 ℃，NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827、NCI-H1299在43 ℃的凋亡水平顯著上升(P<0.05)。見表1、表2、圖1。

注：A表示在37、40、43、46 ℃條件下A549細(xì)胞系的細(xì)胞活力；B表示在37、40、43、46 ℃條件下HCC827細(xì)胞系的細(xì)胞活力；C表示在37、40、43、46 ℃條件下NCI-H1299細(xì)胞系的細(xì)胞活力；D表示在37、40、43、46 ℃條件下A549細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡水平；E表示在37、40、43、46 ℃條件下HCC827細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡水平；F表示在37、40、43、46 ℃條件下NCI-H1299細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡水平；與37 ℃比較，*P<0.05。

表1 在37、40、43、46 ℃條件下NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827、NCI-H1299的細(xì)胞活力

表2 在37、40、43、46 ℃條件下NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827、NCI-H1299的細(xì)胞凋亡水平

2.243 ℃條件下誘導(dǎo)HOXB1表達(dá)對NSCLC細(xì)胞凋亡的影響 將37 ℃和43 ℃處理的NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827、NCI-H1299進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組高通量測序，發(fā)現(xiàn)有10個基因在這3個細(xì)胞系中均受到調(diào)控，分別是NAA25、HOXB1、ATP11AUN、AMACR、NATD1、SARM1、C17orf49、KIF1C、GGA2、NFATC2。使用相應(yīng)的siRNA分別敲低上述基因后，與siGFP組比較，發(fā)現(xiàn)敲低HOXB1后，43 ℃時NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549的凋亡水平下降(P<0.05)，見圖2A。同時，與siGFP組比較，敲低HOXB1后，43 ℃時NSCLC細(xì)胞系HCC827、NCI-H1299的凋亡水平下降(P<0.05)，見圖2B和圖2C。與Vector組比較，過表達(dá)HOXB1后，37 ℃時NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827、NCI-H1299的凋亡水平上升(P<0.05)。見表3～5和圖2D～F。

注：A表示siRNA敲低篩選影響43 ℃條件下A549細(xì)胞凋亡水平的基因；B表示敲低HOXB1后，43 ℃條件下HCC827細(xì)胞的凋亡水平；C表示敲低HOXB1后，37 ℃條件下NCI-H1299細(xì)胞的凋亡水平；D表示過表達(dá)HOXB1后，37 ℃條件下A549細(xì)胞的凋亡水平；E表示過表達(dá)HOXB1后，37 ℃條件下HCC827細(xì)胞的凋亡水平；F表示過表達(dá)HOXB1后，43 ℃條件下NCI-H1299細(xì)胞的凋亡水平；與siGFP組或Vector組比較，*P<0.05。

表3 siRNA敲低篩選影響A549在43 ℃時凋亡水平的基因

表4 敲低或不敲低HOXB1后NSCLC細(xì)胞系HCC827、NCI-H1299在43 ℃時的凋亡水平

2.3HOXB1通過NF-κB對NSCLC細(xì)胞凋亡的影響 見表6。與siGFP組比較，敲低HOXB1后，43 ℃時NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827、NCI-H1299中熒光素酶活性上升，因此敲低HOXB1后NF-κB的活性上升(P<0.05)，見圖3A、圖3B和圖3C。同時，43 ℃條件下，免疫共沉淀通過HOXB1抗體能夠結(jié)合NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827、NCI-H1299的NF-κB，見圖3D。

表5 過表達(dá)或不過表達(dá)HOXB1后，NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827、NCI-H1299在37 ℃時的凋亡水平

表6 敲低或不敲低HOXB1后，NSCLC細(xì)胞系HCC827、NCI-H1299在43 ℃時的NF-κB活性 (熒光素酶活性值，

注：A表示敲低HOXB1后，43 ℃條件下A549細(xì)胞中NF-κB的活性；B表示敲低HOXB1后，43 ℃條件下NCI-H1299細(xì)胞中NF-κB的活性；C表示敲低HOXB1后，43 ℃條件下HCC827細(xì)胞中NF-κB的活性；D表示43 ℃條件下A549、HCC827、NCI-H1299細(xì)胞中HOXB1與NF-κB亞基p65的相互作用；與siGFP組比較，*P<0.05。

3 討 論

最近，術(shù)后熱療已被用作重要的輔助治療手段，以提高傳統(tǒng)化療和(或)放療的療效[6]。由于過去的技術(shù)無法在不損傷周圍非腫瘤組織的情況下有效且均勻地向腫瘤部位傳遞熱量，因此現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中熱療的發(fā)展相對過時[7]。但是，最近直接應(yīng)用熱處理的新技術(shù)(如計算機(jī)建模和無創(chuàng)測溫)使熱療成為新的治療腫瘤方案[8]。許多臨床數(shù)據(jù)表明，微波 (MW) 消融可以改善肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)性結(jié)直腸癌肺轉(zhuǎn)移患者的腫瘤學(xué)結(jié)果[9]。MW熱療(溫度通常在 42～45 ℃)已廣泛用于淺表腫瘤的臨床試驗[10]。因此，本研究選擇在37、40、43、46 ℃下處理NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827、NCI-H1299。相比于37 ℃，NSCLC細(xì)胞系在40、43、46 ℃下的活力均顯著降低(P<0.05)、凋亡水平均顯著上升(P<0.05)。相比于37、40、46 ℃條件下，NSCLC細(xì)胞系在43 ℃的凋亡水平顯著上升(P<0.05)。因此，熱療可以與放療和化療有效結(jié)合使用，以促進(jìn)機(jī)體免疫反應(yīng)對抗靶腫瘤。

同源盒 (HOX) 基因編碼一個轉(zhuǎn)錄因子家族，這些因子可以與靶基因序列結(jié)合以調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)水平[11]。HOXB1是HOX 家族的重要成員，多項研究表明HOXB1是包括癌癥在內(nèi)的許多疾病發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因子[11-14]。本研究發(fā)現(xiàn)敲低HOXB1后，43 ℃時NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827、NCI-H1299的凋亡水平下降(P<0.05)。因此，HOXB1是一個受熱療調(diào)控的抑癌因子，有望成為治療NSCLC的新靶標(biāo)。

有研究報道HOXB1能夠抑制NF-κB信號通路的活性[15]。因此，為了檢測HOXB1的促凋亡作用是否與NF-κB信號通路相關(guān)，本研究檢測了敲低HOXB1后NF-κB的活性。與siGFP組比較，敲低HOXB1后，43 ℃時NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827、NCI-H1299中熒光素酶活性上升，因此敲低HOXB1后NF-κB的活性上升(P<0.05)。因此，HOXB1能夠抑制NF-κB信號通路的活性。同時，43 ℃時NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、HCC827、NCI-H1299中NF-κB能夠與HOXB1相互作用。NF-κB是一種多功能轉(zhuǎn)錄因子，是NF-κB/Rel 蛋白家族的成員[16]。哺乳動物有5個亞基，但最常見的形式是p65/p50二聚體復(fù)合物，它在炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡中起重要作用[17]。NF-κB能夠通過抑制促凋亡因子Bax的表達(dá)來抑制凋亡[18]。因此，HOXB1可能與基因組中NF-κB靶向的元件競爭性地結(jié)合NF-κB以抑制NF-κB活性，最后促進(jìn)了NSCLC細(xì)胞凋亡。

綜上所述，熱療處理NSCLC細(xì)胞后，HOXB1的表達(dá)水平上升，HOXB1可與NF-κB結(jié)合并抑制NF-κB的活性，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。