MALDI-TOF MS技術(shù)直接鑒定無(wú)菌體液病原菌的效果評(píng)價(jià)*

張鞠玲,康 琳,鮑春梅,王 歡,賈天野 ,陳素明,龐君麗,李伯安△

1.解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)科，北京 100039;2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071

膿毒癥是機(jī)體對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)進(jìn)而引發(fā)器官功能障礙、危及生命的疾病[1]。膿毒癥發(fā)生率高，全球每年有超過(guò)1 900萬(wàn)嚴(yán)重膿毒癥病例，美國(guó)每年有75萬(wàn)膿毒癥患者，造成超過(guò) 21萬(wàn)人死亡，是危重患者死亡的主要原因[2]。在臨床 ICU，血液感染所致膿毒癥的發(fā)生率可達(dá)到95%，病死率約為26%；腹腔感染所致膿毒癥的發(fā)生率可達(dá)到 40%，病死率約為 36%[3-4]。及時(shí)識(shí)別病原菌并使用適當(dāng)?shù)目咕幬镏委熆娠@著降低膿毒癥病死率[5-6]?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)是近年來(lái)關(guān)注度較高的鑒定技術(shù)，通過(guò)采集待檢標(biāo)本中的生物標(biāo)志物蛋白，得到目標(biāo)生物的蛋白指紋質(zhì)譜圖，與數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖進(jìn)行比對(duì)，從而鑒定細(xì)菌、真菌及分枝桿菌等，該方法具有快速、準(zhǔn)確、高通量、重復(fù)性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。本研究將血液和腹水陽(yáng)性培養(yǎng)瓶中的病原菌富集后，應(yīng)用MALDI-TOF MS進(jìn)行直接鑒定，與傳統(tǒng)培養(yǎng)法比較菌種鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，探討此方法在膿毒癥診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 連續(xù)收集2021年6-10月解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)科血液、腹水培養(yǎng)報(bào)警陽(yáng)性的標(biāo)本共418份(包括需氧瓶和厭氧瓶)。其中血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本220份，腹水培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本198份；單菌株感染培養(yǎng)瓶410份，混合感染培養(yǎng)瓶8份。單菌株感染中革蘭陰性菌244 株，革蘭陽(yáng)性菌149 株，真菌17株。對(duì)于同一患者不同部位感染的普通和厭氧培養(yǎng)瓶也同時(shí)納入本研究中。

1.2儀器與試劑 血平皿(英國(guó)Oxoid公司)、中國(guó)藍(lán)平皿(Oxoid公司，英國(guó))、沙保弱平皿(英國(guó)Oxoid公司)、1.5 mL離心管(美國(guó)Axygen公司)、α-氫基-4-羥基肉桂酸即HCCA(德國(guó)Bruker公司)、無(wú)水乙醇、乙腈及甲酸(美國(guó)Fisher Scientific公司)，溶血?jiǎng)?邁瑞南京生物技術(shù)有限公司)?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀Microflex LT(德國(guó)Bruker公司),VITEK-2全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析儀(法國(guó)梅里埃生物股份有限公司)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)，高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)，BACT/ALERT 3D 240全自動(dòng)血液培養(yǎng)儀(法國(guó)梅里埃生物股份有限公司)。

1.3方法

1.3.1MALDI-TOF MS檢測(cè)

1.3.1.1標(biāo)本的前處理 (1)含有血細(xì)胞陽(yáng)性瓶的前處理：用5 mL無(wú)菌注射器從血陽(yáng)性培養(yǎng)瓶中吸取2 mL液體至空白管中，15 000 r/min離心3 min，吸取200 μL上清液于EP管中，加入100 μL溶血?jiǎng)┱袷幓靹?0 s，將混合物12 000 r/min離心3 min吸去上清液，再加入700 μL蒸餾水振蕩混勻30 s，將混合物12 000 r/min離心3 min吸去上清液備用。(2)不含血細(xì)胞陽(yáng)性瓶的前處理：從培養(yǎng)瓶中吸取500 μL帶菌液體于EP管中，將混合物12 000 r/min離心3 min吸去上清液，加入700 μL蒸餾水振蕩混勻30 s，將混合物12 000 r/min離心3 min吸去上清液。(3)菌液富集：向留有沉淀的EP管中加入300 μL蒸餾水和900 μL無(wú)水乙醇振蕩混勻30 s，將混合物12 000 r/min離心3 min吸去上清液，加入50 μL 70%甲酸，再加入50 μL乙腈，振蕩混勻30 s，12 000 r/min離心2 min，得到上清液待用。

1.3.1.2MALDI-TOF MS鑒定 取1 μL上清液點(diǎn)在MALDI靶板上，干燥后表面加入1 μL基質(zhì)，再次室溫干燥后將靶板放入質(zhì)譜儀中進(jìn)行蛋白質(zhì)指紋圖譜的采集。使用MALDI Biotyper 3.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和比對(duì)得出鑒定結(jié)果。每株菌點(diǎn)2個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行平行檢測(cè)，取最高評(píng)分計(jì)入數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.3.1.3MALDI-TOF MS 結(jié)果判讀 MALDI-TOF MS系統(tǒng)鑒定分值>2.0為菌株鑒定結(jié)果到種水平可信；分值在1.7～2.0為菌株鑒定結(jié)果到屬水平可信，重新檢測(cè)或補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)幫助鑒定；分值<1.7結(jié)果不可信。

1.3.2病原菌培養(yǎng)與生化鑒定 血培養(yǎng)儀陽(yáng)性瓶報(bào)警后，經(jīng)涂片、革蘭染色、鏡檢、轉(zhuǎn)種血平皿、中國(guó)藍(lán)平皿或厭氧平板，培養(yǎng)24～48 h，挑取純菌落，選取合適的鑒定卡用VITEK-2鑒定并記錄結(jié)果。VITEK-2鑒定結(jié)果同MALDI-TOF MS直接鑒定結(jié)果不同的菌株，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行PCR測(cè)序。

1.3.3質(zhì)量控制 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀Microflex LT和VITEK-2全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析儀均使用大腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923、白色念珠菌ATCC14053和肺炎鏈球菌ATCC49619作為質(zhì)控菌株，菌株購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或百分率表示,比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher檢驗(yàn)。比較MALDI-TOF MS與VITEK-2菌株鑒定的準(zhǔn)確率。準(zhǔn)確率=準(zhǔn)確鑒定菌株數(shù)/菌株總數(shù)×100%。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1MALDI-TOF MS單一病原菌的直接鑒定 410份單菌株感染所致的陽(yáng)性標(biāo)本中，MALDI-TOF MS 直接鑒定準(zhǔn)確率為98.54%(404/410)，VITEK-2鑒定的準(zhǔn)確率為98.54%(404/410)，兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.085，P>0.05)。革蘭陰性菌MALDI-TOF MS 直接鑒定的準(zhǔn)確率為99.59%(243/244)，VITEK-2鑒定的準(zhǔn)確率為98.77%(241/244),兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.252，P>0.05)。革蘭陽(yáng)性球菌MALDI-TOF MS鑒定的準(zhǔn)確率為97.32%(145/149)，VITEK-2鑒定的準(zhǔn)確率為99.33%(148/149)，兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.814，P>0.05)。17株真菌MALDI-TOF MS 直接鑒定的準(zhǔn)確率為94.12%(16/17)，VITEK-2鑒定的準(zhǔn)確率為88.24%(15/17),兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.5)。見(jiàn)表1。MALDI-TOF MS和VITEK-2鑒定結(jié)果不同的單菌株共12株，經(jīng)分子生物學(xué)方法確認(rèn)，MALDI-TOF MS鑒定準(zhǔn)確6株，準(zhǔn)確率為50.00%(6/12)。見(jiàn)表2。

表1 單菌株感染MALDI-TOF MS和VITEK-2鑒定結(jié)果

續(xù)表1 單菌株感染MALDI-TOF MS和VITEK-2鑒定結(jié)果

表2 兩種方法鑒定結(jié)果不同的單菌株分子生物學(xué)方法鑒定情況分析

續(xù)表2 兩種方法鑒定結(jié)果不同的單菌株分子生物學(xué)方法鑒定情況分析

2.2MALDI-TOF MS直接鑒定分值分布 MALDI-TOF MS直接鑒定，410株單菌株鑒定分值>1.7即鑒定至屬水平占93.17%(382/410)，分值>2.0即鑒定至種水平占82.68%(339/410)。其中革蘭陰性菌中屬、種水平鑒定率分別為97.54%(238/244)、89.34%(218/244),革蘭陽(yáng)性球菌中屬、種水平鑒定率分別為87.92%(131/149)、74.50%(111/149),真菌中屬、種水平鑒定率分別為76.47%(13/17)、58.82%(10/17)。革蘭陰性菌中鑒定分值<1.7的共6株，其中5株結(jié)果正確(腸炎沙門菌1株、嗜麥芽窄食單胞菌2株、黏質(zhì)沙雷菌2株)，1株產(chǎn)酸克雷伯菌鑒定不正確。革蘭陽(yáng)性球菌中鑒定分值<1.7的共18株，其中14株結(jié)果正確(頭狀葡萄球菌2株、肺炎鏈球菌2株、副血鏈球菌1株、唾液鏈球菌4株、星座鏈球菌3株、停乳鏈球菌2株)，4株未鑒定出結(jié)果(唾液鏈球菌2株、緩癥鏈球菌2株)。真菌中鑒定分值<1.7的共4株，其中2株薩希毛孢子菌、1株葡萄牙假絲酵母菌鑒定分值<1.7，但結(jié)果正確，而1株新型隱球菌MALDI-TOF MS未鑒定出結(jié)果。復(fù)合菌株中屬、種水平鑒定率分別為75.00%(6/8)、25.00%(2/8)，2株復(fù)合菌鑒定分值<1.7,但是結(jié)果正確。見(jiàn)表3。

表3 418份陽(yáng)性標(biāo)本MALDI-TOF MS直接鑒定分值分布(n)

2.3時(shí)間比較 MALDI-TOF MS從陽(yáng)性培養(yǎng)瓶報(bào)警、卸載、提取菌液到鑒定出結(jié)果需要30 min，VITEK-2從陽(yáng)性培養(yǎng)瓶報(bào)警、卸載、標(biāo)本接種、培養(yǎng)、挑取純菌落上機(jī)到鑒定出結(jié)果需要24～48 h，分子生物學(xué)方法經(jīng)測(cè)序鑒定需要 24～48 h。

3 討 論

膿毒癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及全身多個(gè)系統(tǒng)，發(fā)病率和病死率居高不下。病程早期難以察覺(jué)，常缺乏指向性的臨床表現(xiàn)，容易被誤診成局部病灶感染，進(jìn)而發(fā)展成膿毒性休克，識(shí)別致病菌并合理選用抗菌藥物是膿毒癥個(gè)體化診斷和精準(zhǔn)治療的關(guān)鍵[9-10]。MALDI-TOF MS在微生物病原菌的快速鑒定中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用[11-12]，目前已報(bào)道的MALDI-TOF MS直接鑒定的標(biāo)本種類包括血、腦脊液、尿等[13-14]，鮮見(jiàn)直接鑒定腹水標(biāo)本的相關(guān)報(bào)道。本研究中，腹水和血液培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本預(yù)處理后經(jīng)MALDI-TOF MS直接鑒定準(zhǔn)確度高，可為快速診斷由腹水和血液感染所致的膿毒癥帶來(lái)極大的便利。

利用質(zhì)譜技術(shù)直接分析臨床標(biāo)本，其前處理方法至關(guān)重要。本研究通過(guò)裂解破壞宿主細(xì)胞，再經(jīng)離心收集菌體進(jìn)行鑒定，溶血?jiǎng)﹪L試選擇實(shí)驗(yàn)室血常規(guī)儀器配套試劑，無(wú)需其他試劑及耗材，與傳統(tǒng)生化VITEK-2鑒定方法相比，鑒定符合率高，與王林等[15]研究結(jié)果相同。Bruker Sepsistyper試劑盒對(duì)革蘭陰性菌和革蘭陽(yáng)性球菌的鑒定率接近但略低于LIN方法[16-17]，但試劑盒成本高且部分試劑采購(gòu)受限，目前不適合在臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛推廣。本研究顯示，MALDI-TOF MS直接鑒定革蘭陰性菌屬、種的準(zhǔn)確率最高，其次是革蘭陽(yáng)性球菌、真菌，與張浩然等[18]報(bào)道相同。本研究中，1株產(chǎn)酸克雷伯菌鑒定不準(zhǔn)確，這可能與表層黏液影響有效菌體蛋白的獲取有關(guān)。鏈球菌鑒定分值普遍較低，這可能與鏈球菌生長(zhǎng)緩慢，細(xì)菌富集量相對(duì)較少，細(xì)胞壁較厚增加其抗溶解性有關(guān)，同時(shí)溶解后的血細(xì)胞成分也對(duì)結(jié)果產(chǎn)生了干擾[19]。新型隱球菌未鑒定出結(jié)果，可能與隱球菌細(xì)胞壁過(guò)厚不易破壞，且離心獲得菌量不足導(dǎo)致未獲得足夠的菌體蛋白譜峰，無(wú)法完成質(zhì)譜分析有關(guān)。MALDI-TOF MS可將兩種菌分開(kāi)鑒定，本研究中復(fù)合菌屬鑒定率達(dá)75.00%，與侯偉偉等[20]報(bào)道基本一致。通過(guò)對(duì)現(xiàn)有鑒定方法用時(shí)比較，發(fā)現(xiàn)VITEK-2鑒定單菌株需24～48 h，MALDI-TOF MS對(duì)單菌株鑒定耗時(shí)約 30 min且可多菌株同時(shí)檢測(cè)，用時(shí)最短、操作簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)室人員經(jīng)過(guò)培訓(xùn)可獨(dú)立完成，人為誤差較小。

綜上所述，本研究利用MALDI-TOF MS對(duì)血和腹水培養(yǎng)瓶標(biāo)本進(jìn)行快速直接鑒定，與傳統(tǒng)菌落培養(yǎng)鑒定方法相比較，鑒定準(zhǔn)確度高、快速、高效、成本低廉且實(shí)用性強(qiáng)，可為膿毒癥病原菌的鑒定提供有效、可行的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段，適合在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行推廣。