外周血單核細(xì)胞NLRP3在冠狀動(dòng)脈支架術(shù)后再狹窄患者中的表達(dá)水平及臨床意義*

徐 為，羅 浩△，唐 輝

1.陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院心血管內(nèi)科，重慶 400042；2.重慶市雙橋經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，重慶 400999

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)是阻塞性冠狀動(dòng)脈疾病最有效的治療手段之一，可明顯降低患者病死率并改善患者生活質(zhì)量[1]。然而支架植入狹窄的冠狀動(dòng)脈管腔，雖然改善了心肌血供，但術(shù)后支架內(nèi)再狹窄(ISR)仍不可避免，高達(dá)30%的裸金屬支架(BMS)植入患者1年內(nèi)會(huì)發(fā)生ISR，即使藥物洗脫支架(DES)的使用顯著減少了ISR的發(fā)生率，但臨床研究發(fā)現(xiàn)其1年內(nèi)ISR發(fā)生率仍在5%～10%[2]。ISR發(fā)生的原因在于球囊擴(kuò)張和支架植入引起的血管內(nèi)皮損傷，進(jìn)一步促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換(由收縮型轉(zhuǎn)換為分泌型)，導(dǎo)致新生內(nèi)膜形成[3]。該過(guò)程涉及眾多機(jī)制，如細(xì)胞周期蛋白的激活或抑制、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、表觀遺傳學(xué)修飾等[4-5]。近年來(lái)相關(guān)研究顯示，NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NLRP3)炎性小體的激活與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，通過(guò)抑制NLRP3炎性小體活性，可顯著降低血管平滑肌細(xì)胞的增殖能力，改善斑塊的穩(wěn)定性[6]。對(duì)于ISR患者體內(nèi)NLRP3炎性小體表達(dá)水平如何，目前尚無(wú)相關(guān)研究闡明。因此，本研究旨在觀察外周血單核細(xì)胞NLRP3炎性小體在ISR患者體內(nèi)的水平變化，探討其與ISR發(fā)生的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入2018年1月至2020年1月在陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院就診并成功接受冠狀動(dòng)脈內(nèi)DES植入術(shù)并在術(shù)后10～12個(gè)月行冠狀動(dòng)脈造影復(fù)查的患者215例，其中男122例、女93例，平均年齡(70.4±9.0)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均滿足冠心病診治指南[7]并達(dá)到冠狀動(dòng)脈支架植入標(biāo)準(zhǔn)；術(shù)后10～12個(gè)月在陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院行冠狀動(dòng)脈造影復(fù)查；規(guī)律服用抗血小板及調(diào)脂藥物；其中對(duì)于ISR患者，需滿足ISR診斷標(biāo)準(zhǔn)，其定義為原支架內(nèi)或支架兩端5 mm內(nèi)狹窄程度≥50%。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)中及術(shù)后1年內(nèi)死亡的患者；嚴(yán)重肝腎功能不全；既往行冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)；合并感染、自身免疫性疾病的患者。根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影檢查結(jié)果評(píng)估是否存在ISR，分為ISR組(52例)和非ISR組(163例)。該研究獲得陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并征得了患者家屬知情同意。

1.2主要器械與試劑 人淋巴細(xì)胞分離液(上海生工生物工程有限公司)；離心機(jī)(美國(guó)Thermofisher公司)；引物(上海生工生物工程有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海生工生物工程有限公司)；熒光定量PCR儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)。

1.3方法

1.3.1一般資料收集 收集患者一般資料，包括性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙史、家族史、基礎(chǔ)疾病、冠心病分型、冠狀動(dòng)脈病變部位、冠狀動(dòng)脈病變支數(shù)、植入支架枚數(shù)及植入前后心肌梗死溶栓治療(TIMI)分級(jí)。

1.3.2檢測(cè)外周血單核細(xì)胞NLRP3 mRNA水平 入院當(dāng)天收集患者外周血3 mL，置入乙二胺四乙酸抗凝管靜置，按1∶1比例將人外周血與淋巴細(xì)胞分離液混合，在3 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，吸取中層白膜層細(xì)胞即為單核細(xì)胞。采用反轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)NLRP3 mRNA相對(duì)水平，首先提取總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，NLRP3上游引物：5′-CATGAGTGCTGCTTCGACAT-3′，下游引物：5′-GCTTCAGTCCCACACAGA-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-AGACAGCCGCATCTTCTTGT-3′，下游引物：5′-CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT-3′。建立20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：預(yù)變性，95 ℃ 120 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。以GAPDH為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算NLRP3 mRNA相對(duì)水平。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者外周血單核細(xì)胞NLRP3 mRNA相對(duì)水平比較 ISR組外周血單核細(xì)胞NLRP3 mRNA相對(duì)水平為2.23±0.65，明顯高于非ISR組的1.08±0.31，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1、2。

圖1 兩組患者外周血單核細(xì)胞NLRP3 mRNA相對(duì)水平比較

2.2兩組一般資料比較 結(jié)果顯示，ISR組與非ISR組在基礎(chǔ)疾病糖尿病、高脂血癥的比例，以及急性冠脈綜合征、冠狀動(dòng)脈病變支數(shù)≥2支、植入支架枚數(shù)≥2枚、植入后TIMI分級(jí)>2級(jí)的比例比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組患者在性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)及有吸煙史、有家族史、基礎(chǔ)疾病高血壓比例等方面比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料比較

2.3Logistic回歸分析 以ISR發(fā)生為因變量，將2.1及2.2中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)為自變量，行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示患有糖尿病、植入支架枚數(shù)≥2枚、植入后TIMI分級(jí)≤2級(jí)及NLRP3 mRNA相對(duì)水平升高是ISR發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見(jiàn)表2。

圖2 兩組患者外周血單核細(xì)胞NLRP3 mRNA表達(dá)差異的電泳圖

表2 ISR發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素分析

2.4ROC曲線分析 ROC曲線分析表明，外周血單核細(xì)胞NLRP3 mRNA診斷ISR的AUC為0.778(95%CI：0.677～0.878)，最佳臨界點(diǎn)為1.53，靈敏度和特異度分別為77.27%和61.29%，見(jiàn)圖3。

圖3 NLRP3 mRNA診斷ISR的ROC曲線分析

3 討 論

冠心病是最常見(jiàn)的動(dòng)脈粥樣硬化疾病之一，對(duì)人民群眾的生命健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。目前，PCI是治療冠心病的主要方法，但在PCI過(guò)程中，球囊對(duì)靶血管狹窄部位的擴(kuò)張，可損傷內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血小板在局部聚集，從而激活單核細(xì)胞黏附于內(nèi)皮下，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和泡沫化，導(dǎo)致新生內(nèi)膜形成，這是引起ISR發(fā)生的重要原因之一[8]。目前，如何早期預(yù)測(cè)ISR的發(fā)生，對(duì)于其防治具有重要的臨床意義。有研究顯示，microRNA如miR-126、miR-224、載脂蛋白A及半胱氨酸等，與ISR形成具有一定相關(guān)性，是ISR發(fā)生的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素[9-10]。但上述指標(biāo)的相關(guān)臨床研究證據(jù)仍偏少，部分指標(biāo)靈敏度或特異度偏低，無(wú)法有效預(yù)測(cè)ISR的形成。

支架內(nèi)新生內(nèi)膜增生的特點(diǎn)是血管內(nèi)側(cè)平滑肌細(xì)胞異常的增殖和遷移，導(dǎo)致支架局部管腔面積減少。既往研究表明炎癥反應(yīng)的激活參與了新生內(nèi)膜的形成，抑制炎癥反應(yīng)如NLRP3、NF-κB通路，可顯著減少小鼠頸動(dòng)脈損傷和靜脈移植后新生內(nèi)膜形成[11-12]。在炎癥激活的條件下，血管平滑肌細(xì)胞可分化為巨噬細(xì)胞，并伴有血管平滑肌細(xì)胞α-肌動(dòng)蛋白表達(dá)的降低，表明炎癥的激活可能在血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要作用[13]。此外，巨噬細(xì)胞的增加可導(dǎo)致局部炎癥和促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖效應(yīng)的相關(guān)細(xì)胞因子如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板源生長(zhǎng)因子等的合成與釋放，從而進(jìn)一步促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞異常增殖[14]。外周血單核細(xì)胞的激活，是全身炎癥反應(yīng)的重要標(biāo)志，有研究顯示動(dòng)脈粥樣硬化患者單核細(xì)胞可顯著激活，該激活程度與斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān)[15]。對(duì)于ISR患者，體內(nèi)單核細(xì)胞NLRP3炎性小體表達(dá)水平如何，是否與ISR的發(fā)生相關(guān)，相關(guān)研究較少。本研究結(jié)果顯示，與非ISR組比較，ISR組患者外周血單核細(xì)胞NLRP3 mRNA相對(duì)水平顯著升高，提示ISR組患者體內(nèi)NLRP3炎性小體處于激活狀態(tài)。既往針對(duì)ISR發(fā)生的危險(xiǎn)因素的相關(guān)研究較多，已有的研究發(fā)現(xiàn)血脂水平升高、合并糖尿病、冠狀動(dòng)脈病變重及吸煙等均可能是引起ISR發(fā)生的危險(xiǎn)因素[16-17]。本研究結(jié)果顯示：植入支架枚數(shù)≥2枚、植入后TIMI分級(jí)≤2級(jí)及NLRP3 mRNA相對(duì)水平升高是ISR發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；而高血脂、吸煙等因素，雖然在ISR和非ISR組間存在差異，但上述因素并不是ISR發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與張春艷等[18]研究存在一定差異，其原因可能與回顧性分析的樣本量、回訪就診的時(shí)間等差異有關(guān)。進(jìn)一步評(píng)估外周血單核細(xì)胞NLRP3 mRNA水平診斷ISR的價(jià)值，通過(guò)ROC曲線分析顯示，其對(duì)ISR的診斷價(jià)值較高，同時(shí)具有較高的靈敏度和特異度。NLRP3作為一項(xiàng)生化指標(biāo)，對(duì)ISR患者早期評(píng)估，顯示出了較強(qiáng)的臨床運(yùn)用前景。NLRP3炎性小體激活是ISR發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這可能與NLRP3的激活可促進(jìn)下游炎性因子IL-1β水平的增加，IL-1β可招募中性粒細(xì)胞、細(xì)胞內(nèi)黏附分子-1等至受損血管內(nèi)皮處，致使血管通透性增加，同時(shí)還可增加纖溶酶激活物抑制物1和纖維蛋白原水平，促進(jìn)血栓形成等有關(guān)[19]。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，外周血單核細(xì)胞NLRP3炎性小體的激活是ISR發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，通過(guò)檢測(cè)患者外周血單核細(xì)胞NLRP3 mRNA相對(duì)水平，對(duì)ISR發(fā)生的早期預(yù)測(cè)具有一定臨床價(jià)值。本研究局限性：(1)單核細(xì)胞NLRP3炎性小體及下游相關(guān)通路的激活及調(diào)控機(jī)制目前未充分闡明，如何調(diào)控并靶向抑制NLRP3炎性小體，是下一步研究的方向；(2)本研究回顧性分析的病例量偏少，可能會(huì)對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生影響。