AHP法結(jié)合Box-Benhnken試驗優(yōu)化傷科噴膜劑提取工藝

許慧春，鄒福賢，黃秋萍，褚克丹，李 煌

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬泉州市正骨醫(yī)院，福建 泉州 362000；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122)

傷科噴膜劑處方來源于泉州市正骨醫(yī)院老中醫(yī)經(jīng)驗方傷科搽劑，為泉州市正骨醫(yī)院的院內(nèi)制劑(閩藥制備字Z20200034000)，由黃連、大黃、紅花、延胡索、胡黃連、蟾酥、夾竹桃和冰片組成，方中黃連具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，為君藥；臣藥大黃、延胡索、紅花和胡黃連；佐藥蟾酥；使藥冰片；諸藥合用，發(fā)揮清熱解毒、活血袪瘀、消腫止痛等功效。傷科搽劑廣泛應(yīng)用于骨折脫位及軟組織損傷后局部腫脹疼痛，但因患者依從性問題，使用不便，故擬將其開發(fā)為噴膜劑，為保證療效及后期質(zhì)量的穩(wěn)定可控，因此對前期的提取工藝進行優(yōu)化。中藥復(fù)方制劑通過多組分、多靶點發(fā)揮療效，因此在前期的提取工藝優(yōu)化時需要考慮多個有效成分的含量。多屬性決策是指在同時考慮多個屬性情況下，優(yōu)選最佳方案，非常適合于中藥及復(fù)方制劑的研究，其中層次分析法(AHP)結(jié)合主觀意愿和客觀分析進行權(quán)重系數(shù)計算，是目前中藥領(lǐng)域常見的決策分析方法之一[1]。響應(yīng)面分析法可用于一個或多個響應(yīng)值與幾種因素的交互作用，其中Box-Behnken設(shè)計所需試驗次數(shù)少、效率高[2]。將AHP法與響應(yīng)面法結(jié)合可獲得更能體現(xiàn)復(fù)方制劑質(zhì)量的提取工藝，目前已有報道運用此法獲得養(yǎng)陰清肺湯、連翹提取工藝和復(fù)方肉蓯蓉合劑提取工藝等[3-5]，該工藝較為成熟、簡便。

本研究通過單因素考察，確定影響提取率的因素及其范圍，采用Box-Behnken對試驗進行工藝優(yōu)化，以AHP法獲得的各指標權(quán)重值進行綜合評價，最后應(yīng)用響應(yīng)面模型對試驗數(shù)據(jù)進行分析和訓(xùn)練，并進行預(yù)測和驗證，以獲得最佳提取工藝條件，為傷科噴膜劑的研發(fā)提供參考資料和數(shù)據(jù)支撐，為后期的臨床研究服務(wù)，并最終造福廣大患者。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CPA225D型1/10 萬分析天平(德國Sartorius公司)；Milli-Q 超純水(美國Millipore 公司)；Agilent 1100 高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)。

1.2 材料

試驗所用飲片購自安徽亳州聚草中藥飲片有限公司；鹽酸小檗堿對照品(批號：110713-202015)，胡黃連苷II(批號：111596-201805)均購自中國食品藥品檢定研究院；羥基紅花黃色素A(批號：MUST-20080111)購自成都曼斯特生物科技有限公司；乙腈(色譜級)購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～3 min，15%～20% A；3～15 min，20%～25% A；15～25 min，25%～25% A，25～30 min，25%～55% A)；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；VWD檢測器(檢測波長：0～10 min，403 nm；10～20 min，280 nm；20～30 min，345 nm)；進樣量：10 μL。

2.1.2 對照品溶液配制 精密稱取鹽酸小檗堿、羥基紅花黃色素A和胡黃連苷II對照品適量，至10 mL容量瓶中，加入純甲醇溶解后定容，分別獲得濃度為738 μg/mL、555 μg/mL、946 μg/mL的對照品儲備液。

2.1.3 供試品溶液制備 稱取組方中各飲片，置于1 000 mL圓底燒瓶中，加入適量一定濃度的乙醇，回流提取。取適量提取液稀釋2.5倍，過0.45 μm濾膜，即得供試品溶液。

2.1.4 陰性供試品制備 分別稱取去除黃連、紅花和胡黃連之外的飲片，按“2.1.3”項方法制備供試品溶液，結(jié)果見圖1。

注：1.羥基紅花黃色素A；2.胡黃連苷II；3.鹽酸小檗堿；A.標準品圖；B.供試品圖；C.缺紅花陰性圖；D.缺胡黃連陰性圖；E.缺黃連陰性圖。

2.1.5 標準曲線制備 精密吸取鹽酸小檗堿、羥基紅花黃色素A和胡黃連苷II對照品溶液適量，配制成濃度分別為177.12、113.52、333 μg/mL的混合對照品溶液，并用甲醇稀釋成多個梯度的混合對照品，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，結(jié)果見表1。

表1 標準曲線結(jié)果

2.1.6 專屬性試驗 精密吸取供試品溶液、陰性供試品溶液和混合對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，結(jié)果見圖1。由圖1可知各目標峰分離度和對稱因子均符合要求，塔板數(shù)均>20 000，并且無干擾，表明專屬性良好。

2.1.7 精密度試驗 精密吸取供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，鹽酸小檗堿、羥基紅花黃色素A和胡黃連苷II的峰面積RSD分別為0.11%、0.09%和0.61%，表明儀器精密度良好。

2.1.8 重復(fù)性試驗 稱取6份處方，按“2.1.3”項制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，將峰面積代入標準曲線中計算含量，結(jié)果鹽酸小檗堿、羥基紅花黃色素A和胡黃連苷II含量的RSD分別為1.45%、1.73%和1.68%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.9 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12和24 h，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，結(jié)果鹽酸小檗堿、羥基紅花黃色素A和胡黃連苷II峰面積的RSD分別為1.93%、1.94%和2.98%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)較為穩(wěn)定。

2.1.10 加樣回收率試驗 采用已知含量的飲片，稱取處方量的一半，加入鹽酸小檗堿、羥基紅花黃色素A和胡黃連苷II適量，平行操作6份，按“2.1.3”項制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，結(jié)果鹽酸小檗堿、羥基紅花黃色素A和胡黃連苷II的加樣回收率分別為96.38%、98.59%和101.50%，RSD分別為1.43%、3.45%和4.22%，表明該方法準確度高。

2.2 綜合評價指標計算

采用1～9標度法對鹽酸小檗堿、羥基紅花黃色素A和胡黃連苷II進行兩兩比較，評價各指標的相對重要性，再按幾何平均法(根法)計算各指標的權(quán)重系數(shù)，得到鹽酸小檗堿、羥基紅花黃色素A和胡黃連苷II的權(quán)重系數(shù)分別為0.649、0.279、0.072。對各權(quán)重系數(shù)進行一致性檢驗，CI(一致性指標)=0.047≠0，CR(隨機一致性比率)=0.081<0.1，說明指標的權(quán)重通過一致性檢驗[6]，數(shù)據(jù)有效。因此綜合評分=(鹽酸小檗堿含量/鹽酸小檗堿最大含量)×0.649+(羥基紅花黃色素A含量/羥基紅花黃色素A最大含量)×0.279+(胡黃連苷II含量/胡黃連苷II最大含量)×0.072。

2.3 單因素試驗

2.3.1 溶劑濃度考察 稱取組方各飲片，按10倍量(mL/g)分別加入30%、40%、50%、60%、70%、80%乙醇，均提取1次，提取時間60 min。按“2.1.5”項計算含量和綜合評分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)綜合評分隨溶劑溶度的增大而先增后減，60%時的評分最高。結(jié)果見圖2。

圖2 溶劑濃度考察綜合指標評分

2.3.2 提取時間考察 稱取組方各飲片，按10倍量(mL/g)加入60%乙醇，均提取1次，分別提取30 min、60 min和90 min。按“2.1.5”項計算含量和綜合評分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)綜合評分隨提取時間的增加而逐漸增加，變化較為平緩，說明提取時間因素對有效成分的溶出影響較小。結(jié)果見圖3。

圖3 提取時間考察綜合指標評分

2.3.3 提取次數(shù)考察 稱取組方各飲片，按10倍量加入60%乙醇，分別提取1次、2次和3次，提取時間60 min。按“2.1.5”項計算含量和綜合評分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取2次和3次的綜合評分顯著高于提取1次的，提取3次的評分略高于提取2次的，考慮時間和溶劑等因素，最終確定提取次數(shù)為2次。結(jié)果見圖4。

圖4 提取次數(shù)考察綜合指標評分

2.3.4 提取倍量考察 稱取組方各飲片，分別加入6、8、10、12、14、16倍量(mL/g)的60%乙醇，均提取1次，提取時間60 min。按“2.1.5”項計算含量和綜合評分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)綜合評分隨倍量的增大而先增后減，在12～16倍之間變化較為緩慢，14倍量時的評分最高。結(jié)果見圖5。

圖5 提取倍量考察綜合指標評分

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化工藝

2.4.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計 響應(yīng)面分析法是一種用于在多因素系統(tǒng)中尋找最佳測試條件的統(tǒng)計方法。在單因素考察結(jié)果的基礎(chǔ)上選取溶劑濃度、提取時間和料液比作為三因素，提取次數(shù)固定為2次，以綜合評分作為指標，根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計17組試驗，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面法設(shè)計方案及試驗結(jié)果

表3 響應(yīng)面二次回歸方程方差分析

2.4.2 響應(yīng)面結(jié)果分析 運用Design-Expert 8.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸擬合，對提取時間(A)、溶劑濃度(B)、提取倍量(C)的綜合評分回歸模型方程為：綜合評分=-26.347 71+0.214 59×A+2.527 87×B+7.986 10×C+1.621 97×10-3×AB+7.920 40×10-3×AC-2.761 79×10-3×BC-3.045 32×10-3×A2-0.024 553×B2-0.328 30×C2(R2=0.922 0)?；貧w方程各項方差分析中F檢驗可以判斷自變量對因變量的影響，由此得到各因素對綜合評分影響的主次順序為溶劑濃度>提取倍量>提取時間。回歸方程和方差分析還表明，模型中一次項溶劑濃度對綜合評分的影響達到極顯著水平(P<0.01)，提取倍量、提取時間對綜合評分具有顯著影響(P<0.05)；模型中二次項A2和C2對綜合評分的影響達到顯著水平(P<0.05)。

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對各試驗因素A、B、C所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，在其他試驗因素固定不變的情況下，考察交互項對得率的影響，響應(yīng)面分析圖可用于評價試驗因素對綜合評分影響的兩兩交互作用，響應(yīng)面坡度越陡峭，表明響應(yīng)值對于操作條件的改變越敏感，該因素對綜合評分的影響越大；反之則表明因素對綜合評分的影響越小，結(jié)果見圖6。當(dāng)提取倍量一定時，綜合評分隨著提取時間的增加呈現(xiàn)出先增后減的趨勢，隨著溶劑濃度的增加呈現(xiàn)略增加隨即減小的趨勢；當(dāng)溶劑濃度一定時，綜合評分隨著提取倍量和提取時間的增加呈現(xiàn)出先增后減的趨勢；同樣提取時間一定時，綜合評分隨著提取倍量和溶劑濃度的增加呈現(xiàn)出略增加后隨即減小的趨勢。通過分析三者的交互作用，發(fā)現(xiàn)因素溶劑濃度與提取倍量的相互作用對綜合評分的影響最大。

圖6 各因素之間兩兩相互作用三維曲面圖

2.5 最佳工藝條件驗證

通過響應(yīng)面模型優(yōu)化后的提取條件：提取時間65.88 min、溶劑濃度52.93%、提取倍量12.73(mL/g)，并根據(jù)實際情況對提取工藝進行驗證試驗。采用12.7倍量的53%乙醇回流提取66 min，共提取2次，分別進行了3次重復(fù)試驗，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，計算綜合評分，結(jié)果分別為98.57、98.67和99.39，平均98.87，與理論值98.48誤差為0.4%，證明響應(yīng)面模型優(yōu)化傷科噴膜劑提取工藝方法較為可靠可行。

3 討論

3.1 指標性成分選擇

根據(jù)《中國藥典》2020版，本方組成在藥典中的指標性成分主要有鹽酸小檗堿、胡黃連苷I、胡黃連苷II、羥基紅花黃色素A、延胡索乙素、大黃酸等蒽醌類成分[7]。通過前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)在10倍量提取后，延胡索乙素、大黃酸等蒽醌類成分檢測限較低，不適于提取工藝優(yōu)化的指標選擇；剩余成分含量較高，并且分別來源于君藥黃連、臣藥紅花和佐藥胡黃連，其中鹽酸小檗堿和胡黃連苷II具有抗炎、抗病原微生物的作用[8- 9]，羥基紅花黃色素A為紅花黃色素中活血化瘀成分的最有效部分[10]。因此選擇鹽酸小檗堿、胡黃連苷II、羥基紅花黃色素A作為提取工藝考察的指標成分。

3.2 色譜條件優(yōu)化

色譜條件在前期優(yōu)化過程中分別考察流動相組成比例、色譜柱溫度和流速等因素對目標峰的影響情況。有機相通過比較乙腈和甲醇，發(fā)現(xiàn)乙腈作為有機相，洗脫能力更強，使得圖譜噪音更低，峰型更為對稱[10]。關(guān)于水相，考察酸性對其的影響，發(fā)現(xiàn)加入酸水后，鹽酸小檗堿峰型更為尖銳，減少脫尾情況，而其中又以0.2%磷酸水效果最好。因此，選擇乙腈-0.2%磷酸水作為流動相。在柱溫和流速的考察上，30、35、40 ℃不同柱溫以及0.8、1.0、1.2 mL/min對樣品峰形、保留時間、分離度的影響均較大，可根據(jù)色譜峰型和分離度的情況做出選擇。因此，本試驗選擇了乙腈-0.2%磷酸水作為流動相，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min作為本次實驗的色譜條件。

本試驗以提取時間、提取次數(shù)、提取溶劑和提取倍量為考察因素，結(jié)合HPLC測定羥基紅花黃色素A、胡黃連苷II和鹽酸小檗堿的含量，通過AHP法計算出各指標的權(quán)重值，并將綜合評價值作為評價指標，采用響應(yīng)面法優(yōu)化出最佳提取工藝為：12.7倍量的53%乙醇回流提取66 min，提取2次。三批工藝驗證結(jié)果表明該工藝可行、穩(wěn)定性好，可為傷科噴膜劑的批量生產(chǎn)提供參考。