真武湯對高血壓小鼠血漿及腎組織ACE2的干預作用

周曉敏，朱紅俊，周春剛，徐 辰，高敬如，胡小海，姚元春，晏 涵

(1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210000；2.南京中醫(yī)藥大學附屬無錫市中醫(yī)醫(yī)院 心血管科，江蘇 無錫 214000)

原發(fā)性高血壓是臨床常見心血管疾病之一，2012-2015 年我國18歲及以上居民高血壓患病率達到27.9%[1]。研究表明，采用中西醫(yī)結合治療可有效降低原發(fā)性高血壓患者的血壓[2]，但是中醫(yī)藥的降壓機制不夠明確，需要探尋新的中醫(yī)藥治療思路以取得對原發(fā)性高血壓的根本性療效。有學者在學習和理解五運六氣理論的基礎上，對脈象沉弦、沉緊的患者，采用真武湯等從太陽寒水論治，取得了顯著的臨床效果[3]。文獻研究也證實，對氣虛血瘀、腎陽虧虛型原發(fā)性高血壓伴舒張性心力衰竭患者，真武湯合桂枝茯苓湯具有良好的臨床療效[4]。由于真武湯治療高血壓作用機制的相關研究文獻較少，故本研究采用L-NAME(硝基精氨酸甲酯)誘導高血壓小鼠模型，以驗證真武湯對高血壓的治療效果及對血漿ACE2水平的干預作用，現(xiàn)將研究情況報道如下。

1 材料與試劑

1.1 實驗動物

SPF級C57BL6雄性小鼠40只，周齡5周，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證編號：20170005022803。實驗小鼠在江南大學動物實驗房飼養(yǎng)(實驗動物使用許可證號：SYXK(蘇)2017-0052)。動物房環(huán)境清潔，通風設備良好，溫度保持在20～25 ℃，相對濕度50%。所有小鼠在同等條件下分籠飼養(yǎng)，12 h燈光晝夜交替，飲食、飲水自由。本實驗方案通過江南大學實驗動物倫理委員會批準(倫理審查號：JN.No20191230c1300630[373])，遵循實驗動物倫理委員會指導原則。

1.2 藥物

普通標準飼料由江南大學動物實驗中心提供，真武湯灌胃藥劑由無錫市中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供，處方組成及劑量根據(jù)《傷寒論》原方比例，1兩按照15 g計算，每劑含生白芍45 g、茯苓45 g、生白術30 g、生姜45 g、黑順片15 g，藥材從蘇州天靈中藥飲片有限公司購入。水煎，每劑煎成2袋，每袋90 mL。貝那普利(北京諾華制藥有限公司，批號：X2872)由無錫市中醫(yī)醫(yī)院藥房提供，10 mg/片，采用生理鹽水配置成0.2 mg/mL溶液。

1.3 儀器及試劑

主要儀器：酶標儀(Bio Tek Instruments，USA)；離心機(Fresco17，Thermo Fisher公司)；Mrbp-mmc嚙齒動物無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)(美國，IITC Life Science)。主要試劑：L-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)(美國，Sigma公司，貨號：N5751)；血漿ACE2水平Elisa試劑盒(美國，ABCAM公司，批號：GR3326353-1)；組織ACE2水平Elisa試劑盒(美國，RB公司，批號：DRE-M3394c)；組織腎素水平Elisa試劑盒(美國，RB公司，批號：DRE-M0560c)。

2 實驗方法

2.1 建模方法

高血壓小鼠模型建立及分組干預由江南大學實驗室完成。將購買的40只雄性C57BL6小鼠(5周齡)預適應1周后(按照SPF級飼養(yǎng)標準適應性喂養(yǎng))，隨機進行分組標號，分為空白對照組(WT)10只(空白組)和L-NAME模型建模組30只。空白組以標準飼料喂養(yǎng)，并正常自由飲水。L-NAME模型組飲用添加 L-NAME含量為0.5 g/L的無菌水，誘導高血壓模型，2周后通過尾壓法檢測血壓是否達到高血壓標準，當小鼠收縮壓維持在130 mmHg時，表明高血壓模型誘導成功。建模成功后繼續(xù)飲用添加 L-NAME含量為0.5 g/L的無菌水。

2.2 分組方法

隨機分為4組，分別為空白對照組(空白組)、模型對照組(模型組)、貝那普利干預組(貝那普利組)、真武湯干預組(真武湯組)，每組各10只。

2.3 給藥方法

真武湯組每只小鼠每天灌胃1次。根據(jù)體質(zhì)量換算，每20 g小鼠體質(zhì)量灌胃真武湯0.5 mL。貝那普利組每只小鼠每天灌胃貝那普利0.2 mg/mL水溶液一次，按照小鼠體質(zhì)量6 mg/kg給藥。

2.4 取材方法

各組連續(xù)灌胃2周，最后一次灌胃干預后，各組小鼠禁食、不禁水12 h，CO2麻醉并稱重后留取血漿及腎臟組織。心臟搏動最強處取血，置于EDTA抗凝管中，離心后留取血漿，分管留存。各組小鼠均取1個完整腎臟組織，-80 ℃保存?zhèn)錂z。檢測時，首先將全自動快速研磨儀的模塊和研磨珠放置于-20 ℃冰箱中冷卻。將預先稱重好的小鼠腎臟和3粒研磨珠置于無 RNA 酶的2 mL離心管中，并加入預冷的1 mL PBS。將該離心管置于預冷的模塊中并在研磨儀上固定，設置參數(shù)為1 500轉(zhuǎn)/min，離心半徑5 cm，運行20 s，間隔10 s，重復3次，得小鼠腎臟勻漿。然后于低溫離心機12 000 g/min，離心半徑5 cm，離心20 min，取上清液備用以檢測腎臟組織renin和ACE2水平。

2.5 指標檢測

本研究通過尾袖法測量小鼠的收縮壓和舒張壓。使用了Mrbp-mmc嚙齒動物無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)(美國IITC Life Science)，每周檢測1次血壓。血漿ACE2水平、腎臟組織renin和ACE2水平采用Elisa方法測量，全部檢測在無錫市中醫(yī)醫(yī)院心血管疾病實驗室進行，采用酶標儀測定。

2.6 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 周齡增長前后血壓與血漿ACE2水平的變化

小鼠隨年齡增長收縮壓和舒張壓升高，ACE2水平下降。與第9周齡比較，29周齡小鼠的舒張壓升高、ACE2水平下降，變化幅度有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.001)。而模型組小鼠的收縮壓、舒張壓持續(xù)升高，29周齡小鼠的收縮壓、舒張壓顯著高于基礎水平；血漿ACE2水平先升高后下降，最終低于基礎水平(P<0.001)和同齡空白組水平(P<0.05)。見表1、表2、表3。

表1 小鼠周齡增加時收縮壓的變化

表2 小鼠周齡增加時舒張壓的變化

表3 小鼠周齡增加時血漿ACE2水平的變化

3.2 真武湯對高血壓小鼠血壓和血漿ACE2水平的干預作用

干預后真武湯組、貝那普利組的收縮壓、舒張壓低于干預前，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.001)。真武湯組ACE2水平略微高于干預前，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；貝那普利組的ACE2水平低于干預前，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見表4、表5、表6。

干預后真武湯組、貝那普利組的收縮壓、舒張壓顯著低于模型組，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.001)；而ACE2水平高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4、表5、表6。

干預后，真武湯組收縮壓、舒張壓、血漿ACE2水平均高于貝那普利組。其中，兩組舒張壓、ACE2水平的差異有顯著統(tǒng)計學意義(P=0.017；P<0.001)。見表4、表5、表6。

表4 真武湯對高血壓小鼠收縮壓的干預作用

表5 真武湯對高血壓小鼠舒張壓的干預作用

表6 真武湯對高血壓小鼠血漿ACE2水平的干預作用

3.3 真武湯對高血壓小鼠腎組織Renin、ACE2水平及其比值的干預作用

干預后真武湯組、貝那普利組腎臟組織中的renin和ACE2含量均低于模型組，其中renin及R/A比值的降低有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。真武湯對腎臟組織renin及R/A比值的降低作用顯著優(yōu)于貝那普利(P<0.01)。但是，真武湯和貝那普利對腎臟組織ACE2水平的降低，與模型組比較無統(tǒng)計學意義。見表7。

表7 真武湯對高血壓小鼠腎組織Renin、ACE2水平及其比值的干預作用

4 討論

根據(jù)中醫(yī)五運六氣理論，世界由五種穩(wěn)定的勢態(tài)和六種變化的時態(tài)即五運、六氣構成[5]?！饵S帝內(nèi)經(jīng)·素問·血氣形志篇》云：“夫人之常數(shù)，太陽常多血少氣，少陽常少血多氣，陽明常多氣多血，少陰常少血多氣，厥陰常多血少氣，太陰常多氣少血，此天之常數(shù)?！标幯?，則循環(huán)容量多，血壓高。陽氣少則陽氣溫煦不足而內(nèi)寒，寒主收引，經(jīng)脈弦緊，則血壓高。因此，我們將脈象沉弦、沉緊的高血壓歸為太陽寒水型高血壓。真武湯可以有效治療此類高血壓[3]，但是真武湯降低血壓的機制尚不清楚。

本實驗小鼠模型研究結果進一步顯示，對于L-NAME誘導的小鼠高血壓模型，真武湯在1～2周內(nèi)即可發(fā)揮降血壓的作用，這與一些學者的臨床經(jīng)驗一致[3]，本實驗也證實，其作用機制可能和真武湯調(diào)節(jié)了血漿ACE2水平有關。

研究還發(fā)現(xiàn)，在L-NAME誘導小鼠血壓升高的過程中，小鼠血漿ACE2水平先升高后顯著下降。由于L-NAME是NO 合酶抑制劑，可以抑制內(nèi)源性NO 的產(chǎn)生[6]，造成內(nèi)皮功能障礙導致小鼠高血壓。而ACE2在腎素-血管緊張素系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中起關鍵作用，主要受到RAS系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。ACE2在血壓調(diào)節(jié)方面的主要作用是將Ang II代謝為血管緊張素II(1-7)，擴張血管，從而降低血壓[7]。因此，可以推測，L-NAME誘導小鼠血壓升高的過程中，血漿ACE2水平首先反應性升高以對抗血壓升高的生理學過程；而后在持續(xù)誘導血壓升高的過程中，出現(xiàn)調(diào)節(jié)障礙最終導致血漿ACE2水平顯著下降，進一步升高了小鼠的血壓水平。

本研究結果還顯示，真武湯可以恢復高血壓小鼠受損的血壓調(diào)節(jié)機能，升高血漿ACE2水平。對于L-NAME誘導的高血壓小鼠，真武湯升高血漿ACE2水平的能力要優(yōu)于貝那普利(1 459.27±141.2 ng/L VS 1 049.6±233.5 ng/L)。但是，貝那普利降低L-NAME誘導的高血壓血壓小鼠的舒張壓的能力要強于真武湯(72.8±2.5 mmHg VS 77.5±4.3 mmHg)。從這個角度說，L-NAME誘導的高血壓小鼠的血壓水平和血漿ACE2水平雖然有負相關趨勢，但不是完全平行。

ACEI的作用機制是通過阻斷ACE將AngⅠ水解為升高血壓的AngⅡ，從而降低血壓。研究表明，ACEI還可以升高ACE2的水平和活性，依那普利也可以增加心臟ACE2的表達[8]，ACEI治療也可增加糖尿病患者血清ACE2活性[9]。因此，貝那普利作為經(jīng)典的ACEI制劑，在本研究中升高高血壓小鼠的ACE2水平是可預期的結果；而真武湯升高血漿ACE2水平則缺乏文獻證明。本研究中，真武湯可以升高小鼠血漿ACE2水平，且升高幅度優(yōu)于貝那普利，從而降低了高血壓小鼠的血壓。

同時，對腎臟組織renin和ACE2水平的檢測表明，真武湯組的腎組織ACE2水平和模型組沒有差異，但是腎組織中的renin含量和R/A比值，真武湯要顯著低于模型組，也低于貝那普利組。有研究證實，醛固酮/腎素濃度比值對降低我國人群原發(fā)性醛固酮增多癥篩查中洗脫藥物的風險有幫助[10]。但是，本研究中真武湯和貝那普利在降低血壓的同時，雖然恢復了血漿降低的ACE2水平，但是并沒有能夠恢復L-NAME誘導的高血壓小鼠腎臟組織renin和ACE2水平。故推測，真武湯更可能是通過調(diào)節(jié)腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的血漿中的整體平衡關系來降低血壓的。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，采用真武湯辨證加減內(nèi)服治療維持性血液透析患者可維護殘余腎功能[11]，本研究結果可部分解釋其作用機制。而對芪蛭真武湯減少單側輸尿管結扎大鼠的尿蛋白的機制研究則認為與真武湯抑制TGF-β1/Smads信號通路和氧化應激反應的作用有關[12]，這又提示了真武湯的多重作用機制。

綜上所述，真武湯對L-NAME誘導的小鼠高血壓模型具有良好的降血壓作用，其作用機制與真武湯升高血漿ACE2水平有關。