液態(tài)乳制品中乳清蛋白和酪蛋白含量分析

孔凡華，趙笑，李宏，白沙沙，楊春雪，孫曉辰，富宏坤，侯君釗，崔亞娟*

1(北京市營養(yǎng)源研究所有限公司，北京，100069)2(中國合格評定國家認可中心，北京，100062)3(北京聯(lián)合大學(xué) 自動化學(xué)院，北京，100101)

乳及乳制品是人體重要的蛋白質(zhì)來源，乳蛋白是牛乳中最有營養(yǎng)價值的部分。牛乳中約含有2.2%～4.4%的蛋白質(zhì)，主要包括乳清蛋白、酪蛋白及少量脂肪球膜蛋白等[1]。乳清蛋白由β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、免疫球蛋白、糖肽、牛血清白蛋白和次要蛋白(如乳過氧化物酶、溶菌酶、骨橋蛋白和乳鐵蛋白)組成[2]。乳清蛋白具有重要的營養(yǎng)價值和生物學(xué)效價[3]，是公認的人體優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)補充劑之一。β-乳球蛋白是由乳腺上皮細胞合成的乳特有蛋白質(zhì)，約占乳清蛋白總量的50%[4]。β-乳球蛋白具備最佳的氨基酸比例，支鏈氨基酸含量極高，有降低膽固醇、抗氧化、易被吸收、促進脂溶性營養(yǎng)素(如維生素A和維生素E)吸收等作用[5-6]，被認為是多功能蛋白。α-乳白蛋白占牛乳清蛋白的20%左右，作為輔酶參與乳糖的生物合成[3]，是泌乳階段的一個重要調(diào)節(jié)因子，也是必需氨基酸色氨酸和半胱氨酸的良好供體[7]。乳鐵蛋白是乳清蛋白中的一種重要的非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，具有獨特的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，在強化機體鐵吸收、對抗病原體、免疫調(diào)節(jié)及抗氧化等方面發(fā)揮著重要的作用[8-10]。骨橋蛋白是一種多功能磷酸化糖蛋白，參與細胞遷移、生存、炎癥反應(yīng)和腫瘤轉(zhuǎn)移等生理活動[11]。骨橋蛋白也是心室重塑過程中的重要糖蛋白，它通過影響炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)表達及腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)，可進一步影響心室重塑[12-13]。酪蛋白是乳中含量最高的蛋白質(zhì)[14]，約占牛乳蛋白含量的76%～86%，是由乳腺上皮細胞合成的一種含有大量鈣和磷的蛋白，以膠束形式存在于牛乳中[15]。牛乳含有4種酪蛋白，分別為αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白[16]。酪蛋白中包含多種人體必需的氨基酸，水解后可產(chǎn)生血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制肽、抗氧化肽、抗疲勞肽等功能肽段[17]，同時，可以促進Ca2+、Zn2+等離子吸收[18]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

市售風(fēng)味發(fā)酵乳和風(fēng)味酸乳共計13種，分別為A品牌炭燒風(fēng)味發(fā)酵乳、B品牌益菌多風(fēng)味發(fā)酵乳(原味)、C品牌炭燒風(fēng)味發(fā)酵乳(黃桃口味)、H品牌益生菌酸牛奶、I品牌原味酸牛奶、J品牌復(fù)原乳風(fēng)味發(fā)酵乳、B品牌風(fēng)味酸牛奶、B品牌風(fēng)味酸牛奶(原味)、C品牌復(fù)原乳風(fēng)味酸牛奶(原味)、D品牌老酸奶風(fēng)味酸牛奶、G品牌濃縮酸奶、G品牌熟酸奶和H品牌罐酸奶；其他液態(tài)乳共計15種，分別為B品牌鮮牛乳、C品牌鮮牛奶、E品牌純牛奶、B品牌脫脂鮮牛奶、A品牌純牛奶、A品牌優(yōu)選純牛奶、C品牌純牛奶、D品牌純牛奶、E品牌牛乳、F品牌純牛奶、F品牌100%純牛奶、D品牌悅鮮活牛奶、K品牌奶糖風(fēng)味牛奶、L品牌山羊奶、M品牌純羊奶。液態(tài)乳樣品采集后4 ℃保存，3 d內(nèi)測定。

1.2 試劑與儀器

NH4HCO3、CaCl2、乙酸、H2SO4、NaOH(均為分析純)，北京化工廠；甲酸、乙腈(均為色譜純)，賽默飛世爾科技有限公司；二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、碘代乙酰胺(iodoacetamide，IAA)，北京索萊寶科技有限公司；牛胰蛋白酶，美國Sigma公司；特異肽段(純度≥95%)，寧波康貝生化有限公司。

UPLC I-CLASS XEVO液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(帶電噴霧離子源)，美國Waters公司；BS224S分析天平，德國賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；QL-901旋渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；ZHWY-110X30往復(fù)式恒溫水浴搖床，上海智誠分析儀器制造有限公司；PS-60A超聲波振蕩器，深圳市深華泰實業(yè)有限公司；KJ2300全自動凱氏定氮儀，丹麥FOSS公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

稱取液態(tài)試樣10 g于100 mL容量瓶中，加90 mL水充分溶解后定容至刻度，旋渦混合器混合樣品。移取1.0 mL上述試樣，用水定容至10 mL，經(jīng)旋渦混合器混合均勻。移取混勻后的試樣溶液200 μL于2 mL離心管中，加入150 μL 500 mmol/L NH4HCO3溶液和10 μL 500 mmol/L DTT溶液，混勻后置于75 ℃恒溫水浴30 min；冷卻至室溫，加入30 μL 500 mmol/L IAA溶液，暗處靜置30 min；再加入10 μL 100 mmol/L CaCl2溶液和50 μL 500 μg/L牛胰蛋白酶溶液，充分混勻后置于37 ℃恒溫水浴中酶解5 h。胰蛋白酶可特異性的酶切賴氨酸和精氨酸位點，生成多條乳蛋白肽段。酶解后向樣液中加10 μL甲酸混勻，室溫下靜置15 min，加入490 μL水，渦旋混勻后，用0.22 μm濾膜過濾，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測[19]。

1.3.2 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC 300 Protein BEHC4色譜柱(2.1 mm × 100 mm，1.7 μm)，柱溫40 ℃，進樣量5 μL，流速0.3 mL/min。

流動相A為0.1%(體積分數(shù)，下同)甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸乙腈溶液，進行梯度洗脫。梯度洗脫程序如下：0～1.5 min，5% B；1.5～2.5 min，5%～38% B；2.5～6.5 min，38%～41% B；6.5～7.6 min，41%～95% B；7.6～8.0 min，保持95% B；8.0～8.1 min，95%～5% B；8.1～10.0 min，5% B[20]。

1.3.3 質(zhì)譜條件

毛細管電壓3.5 kV，錐孔電壓35 kV，脫溶劑溫度500 ℃，脫溶劑氣流量800 L/min，錐孔反吹氣流量30 L/h，碰撞室壓力0.3 Pa，低端分辨率1∶2.5 V，高端分辨率1∶15.0 V，離子能量1∶0.5，離子源溫度150 ℃，提取器壓力3.0 V，入口透鏡電壓0.5 V，碰撞梯度1.0。

α-乳白蛋白分子質(zhì)量為14 178 Da、β-乳球蛋白分子質(zhì)量為18 320 Da、骨橋蛋白分子質(zhì)量為44 000 Da、乳鐵蛋白分子質(zhì)量為76 095.1 Da、αs1-酪蛋白分子質(zhì)量為23 614 Da、αs2-酪蛋白分子質(zhì)量為25 230 Da、β-酪蛋白分子質(zhì)量為23 983 Da、κ-酪蛋白分子質(zhì)量為19 023 Da，采用特異肽段外標(biāo)法定量。乳清蛋白和酪蛋白特異肽段譜圖見圖1。

1.4 計算公式

試樣中乳清蛋白含量按照公式(1)計算：

ww=(wα+wβ)/F

(1)

式中：ww，試樣中乳清蛋白的含量，g/100 g；wα，試樣中α-乳白蛋白的含量，g/100 g；wβ，試樣中β-乳球蛋白的含量，g/100 g；F，折算系數(shù)，取值0.6。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗收集到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過Excel 2016和SPSS 2.0整理分析。

2 結(jié)果與分析

本文采用酶解法同時測定液態(tài)乳制品中乳清蛋白和酪蛋白的含量，由表1知，在風(fēng)味發(fā)酵乳和風(fēng)味酸乳中，α-乳白蛋白含量在49～195 mg/100 g，含量最高的為J品牌復(fù)原乳風(fēng)味發(fā)酵乳，含量最低為C品牌炭燒風(fēng)味發(fā)酵乳。β-乳球蛋白含量在108～441 mg/100 g，含量最高的為J品牌復(fù)原乳風(fēng)味發(fā)酵乳，含量最低為C品牌炭燒風(fēng)味發(fā)酵乳。骨橋蛋白含量在1.33～3.53 mg/100 g，含量最高的為J品牌復(fù)原乳風(fēng)味發(fā)酵乳，含量最低為C品牌復(fù)原乳風(fēng)味酸牛奶。乳鐵蛋白含量在0.062～0.342 mg/100 g，含量最高的為B品牌風(fēng)味酸牛奶，含量最低為D品牌老酸奶風(fēng)味酸牛奶。乳清蛋白含量在261～1 060 mg/100 g，含量最高的為J品牌復(fù)原乳風(fēng)味發(fā)酵乳，含量最低為C品牌炭燒風(fēng)味發(fā)酵乳。

a-α-乳白蛋白；b-β-乳球蛋白；c-骨橋蛋白；d-乳鐵蛋白；e-αs1-酪蛋白；f-αs2-酪蛋白；g-β-酪蛋白；h-κ-酪蛋白圖1 乳清蛋白和酪蛋白特異肽段譜圖Fig.1 Whey protein and casein specific peptide segment spectrum

鮮牛奶和純牛奶中α-乳白蛋白含量在90～179 mg/100 mL，含量最高的為E品牌牛乳，此樣品為高溫殺菌乳，含量最低的為K品牌奶糖風(fēng)味牛奶，此樣品為調(diào)制乳。β-乳球蛋白含量在199～343 mg/100 mL，含量最高的為E品牌牛乳，此樣品為高溫殺菌乳，含量最低的為K品牌奶糖風(fēng)味牛奶，此樣品為調(diào)制乳。骨橋蛋白含量在3.11～5.72 mg/100 mL，含量最高的為E品牌牛乳，此樣品為高溫殺菌乳，含量最低的為K品牌奶糖風(fēng)味牛奶，此樣品為調(diào)制乳。乳鐵蛋白含量在0.039～7.845 mg/100 mL，含量最高的為E品牌牛乳，此樣品為高溫殺菌乳，含量最低的為A品牌優(yōu)選純牛奶，此樣品為高溫殺菌乳。乳清蛋白含量在486～833 mg/100 mL，含量最高的為E品牌牛乳，此樣品為高溫殺菌乳，含量最低的為K品牌奶糖風(fēng)味牛奶，此樣品為調(diào)制乳。液態(tài)乳中酪蛋白主要是β-酪蛋白和αs1-酪蛋白，β-酪蛋白含量整體高于αs1-酪蛋白，αs2-酪蛋白和κ-酪蛋白含量相近。鮮牛奶和純牛奶中4種酪蛋白的含量整體高于風(fēng)味發(fā)酵乳和風(fēng)味酸乳。在風(fēng)味發(fā)酵乳和風(fēng)味酸乳中，αs1-酪蛋白含量為0.516～0.968 g/100 g，含量最高的為B品牌益菌多風(fēng)味發(fā)酵乳，含量最低為G品牌熟酸奶。αs2-酪蛋白含量在0.047～0.206 g/100 g，含量最高的為B品牌益菌多風(fēng)味發(fā)酵乳，含量最低為G品牌熟酸奶。β-酪蛋白含量在0.44～1.07 g/100 g，含量最高的為B品牌益菌多風(fēng)味發(fā)酵乳，含量最低為G品牌熟酸奶。κ-酪蛋白含量在0.082～0.298 g/100 g，含量最高的為B品牌益菌多風(fēng)味發(fā)酵乳，含量最低為G品牌熟酸奶。鮮牛奶和純牛奶中，αs1-酪蛋白含量在0.874～1.083 g/100 mL，含量最高的為E品牌牛乳，此樣品為高溫殺菌乳，含量最低的為K品牌奶糖風(fēng)味牛奶，此樣品為調(diào)制乳。αs2-酪蛋白含量在0.17～0.234 g/100 mL，含量最高的為E品牌牛乳，此樣品為高溫殺菌乳，含量最低的為K品牌奶糖風(fēng)味牛奶，此樣品為調(diào)制乳。β-酪蛋白含量在0.955～1.20 g/100 mL，含量最高的為E品牌牛乳，此樣品為高溫殺菌乳，含量最低的為K品牌奶糖風(fēng)味牛奶，此樣品為調(diào)制乳。液態(tài)羊乳中各種功能蛋白的含量和液態(tài)牛乳相近。

風(fēng)味發(fā)酵乳和風(fēng)味酸乳中，B品牌益菌多風(fēng)味發(fā)酵乳和J品牌復(fù)原乳風(fēng)味發(fā)酵乳中功能蛋白含量較高，C品牌炭燒風(fēng)味發(fā)酵乳功能蛋白含量較低。鮮牛奶和純牛奶中，E品牌牛乳(高溫殺菌乳)功能蛋白含量較高，K品牌奶糖風(fēng)味牛奶(調(diào)制乳)功能蛋白含量較低。

3 結(jié)論與討論

28種液態(tài)乳制品中，乳清蛋白主要是β-乳球蛋白和α-乳白蛋白，β-乳球蛋白含量整體高于α-乳白蛋白，同時，含有少量的骨橋蛋白和乳鐵蛋白。酪蛋白的含量普遍大于乳清蛋白，其中，αs1酪蛋白和β-酪蛋白占比為最高的2種酪蛋白。鮮牛奶和純牛奶中乳清蛋白和酪蛋白的含量整體高于風(fēng)味發(fā)酵乳和風(fēng)味酸乳。

28種液態(tài)乳制品中，乳清蛋白和酪蛋白含量差異非常顯著，這是因為28種液態(tài)乳制品中有牛乳、羊乳、復(fù)配乳、濃縮乳等不同來源的乳品，可能直接導(dǎo)致了乳清蛋白和酪蛋白的差異。不同液態(tài)乳制品的加工處理方式不同，對各種功能蛋白的含量具有顯著影響。此外高溫殺菌乳、超瞬時殺菌乳貯藏時間的不同可能也會導(dǎo)致蛋白含量的差異性。后續(xù)研究應(yīng)該側(cè)重不同乳來源、不同熱處理方式、不同保質(zhì)期液態(tài)乳制品中功能蛋白含量的差異研究。