超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法定量測(cè)定肉類特征肽的質(zhì)譜采集模式對(duì)比

王忠合，李曉婷，胡文梅，王軍*

1(韓山師范學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，廣東 潮州，521041)2(廣東省粵東藥食資源功能物質(zhì)與治未病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 潮州，521041)

肉類制品摻假造假現(xiàn)象頗為常見(jiàn)，在利益的驅(qū)使下，不法商販們常用較低廉的鴨肉、雞肉、豬肉等冒充牛肉、羊肉，摻入其肉類制品中，這不僅帶來(lái)極大的食品安全隱患，危害人們的宗教信仰，而且還嚴(yán)重侵害了消費(fèi)者的權(quán)益和食品的公平交易[1-2]，因此，建立一種肉類及其制品的快速、精準(zhǔn)檢測(cè)方法，用于鑒別肉類的不同種屬、及時(shí)發(fā)現(xiàn)摻假肉尤為重要?；谫|(zhì)譜的蛋白組學(xué)技術(shù)可以快速、精準(zhǔn)的檢測(cè)目標(biāo)化合物，是目前在肉類摻假鑒別中最常用的檢測(cè)方法之一。串聯(lián)質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring/selective reaction monitoring, MRM/SRM)定量方法，一直以來(lái)就是定量的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵是選擇出靶蛋白的典型肽段，要求肽段含有8～25個(gè)氨基酸、相對(duì)分子質(zhì)量適于四極桿掃描的質(zhì)核比范圍、離子化效率高，穩(wěn)定好、不易發(fā)生修飾、盡量不含有蛋氨酸(易發(fā)生氧化反應(yīng))和半胱氨酸(易發(fā)生脲甲基化和氧化反應(yīng))等殘基以減少可能的誤差[3]。同時(shí)，挑選的肽段應(yīng)是唯一對(duì)應(yīng)其蛋白質(zhì)，以提高檢測(cè)的特異性和減少對(duì)結(jié)果的干擾，由于生物樣本的復(fù)雜性，每一個(gè)肽段往往需要選擇3個(gè)離子對(duì)(母離子-子離子)所產(chǎn)生的信號(hào)。

四級(jí)桿-高分辨串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(如四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、四極桿軌道阱質(zhì)譜儀)是利用四極桿質(zhì)量過(guò)濾器對(duì)母離子的高選擇性和高特異性、高分辨率的質(zhì)量分析器的準(zhǔn)確質(zhì)量檢測(cè)能力，結(jié)合質(zhì)量過(guò)濾器和質(zhì)量分析器的優(yōu)勢(shì)實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確鑒別與高通量篩查，且該技術(shù)的發(fā)展和掃描速度的提升為目標(biāo)蛋白或肽段的定量測(cè)定也提供了新的途徑。平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)(parallel reaction monitoring，PRM)正是相對(duì)于傳統(tǒng)SRM建立起來(lái)的高分辨離子監(jiān)測(cè)技術(shù)[4-5]，基于以四極桿靜電場(chǎng)軌道阱(quadrupole orbitrap,Q-Orbitrap)為代表的四極桿-高分辨質(zhì)譜平臺(tái)，與SRM每次掃描一個(gè)離子對(duì)不同，PRM模式每次對(duì)一個(gè)母離子產(chǎn)生的所有離子對(duì)進(jìn)行全掃描，即平行監(jiān)測(cè)了一個(gè)母離子對(duì)應(yīng)的所有離子對(duì)，監(jiān)測(cè)精度高、無(wú)需事先確定離子對(duì)和優(yōu)化碰撞能量、線性范圍廣、靶向定量靈敏度和通量更高，去除基質(zhì)干擾能力強(qiáng)[6-7]。基于高分辨、高精度質(zhì)譜的離子監(jiān)視技術(shù)，能夠?qū)δ繕?biāo)蛋白質(zhì)、目標(biāo)肽段(如發(fā)生翻譯后修飾的肽段)進(jìn)行選擇性檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜樣本中的目標(biāo)蛋白質(zhì)/肽段進(jìn)行準(zhǔn)確地特異性分析和絕對(duì)定量。本文采用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法對(duì)肉類特征肽的檢測(cè)方法進(jìn)行探究，比較四極桿靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜的PRM模式和靶標(biāo)單一離子監(jiān)測(cè)/數(shù)據(jù)依賴掃描(targeted single ion monitoring/data-dependent MS/MS scans，tSIM/ddMS2)采集模式定量的差異，以期優(yōu)化出各肉類特征肽測(cè)定的條件，為更加快速、精準(zhǔn)的鑒別肉類及肉類制品的蛋白來(lái)源提供有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

質(zhì)譜級(jí)乙腈、甲醇、甲酸(formic acid,FA)等，默克股份有限公司；正己烷(色譜級(jí))、牛胰蛋白酶(Type I, 活力10 000 BAEE/mg蛋白)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT,≥99.5%)，西格瑪有限公司；硫脲(≥99%)、CaCl2·H2O(≥99%)、尿素、NH4HCO3、三羥甲基氨基甲烷(Tris≥99%)、碘代乙酰胺(iodoacetamide, IAA)等，生工生物工程(上海)股份有限公司；合成肽(SALAHAVQSSR、LADNLDTLGAAAAK、NALAHALQSAR、ALEDQLSELK、YTPVEAIEK、AAIAQAGYTDK、FISLLDELQK、TLAFLFAER)，上海強(qiáng)耀生物科技有限公司；固相萃取柱(HLB柱、3 mL/200 mg)，Waters公司；超純水(電阻率≥18.2 MΩ·cm)，實(shí)驗(yàn)室自制；牛肉及牛肉丸，市售。

1.2 儀器與設(shè)備

Vanquish Flex Binary超高效液相色譜、EASY-nLC 1200納升級(jí)液相色譜、Q Extractive四極桿靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀，Thermo公司；ZX4漩渦振蕩器，意大利VELP公司；ME204E/02電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Milli-Q超純水機(jī)，密理博有限公司；2-16P高速離心機(jī)，西格瑪有限公司；移液槍，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；HH-30恒溫水浴鍋，江蘇科析儀器有限公司；As系列超聲波清洗機(jī)，天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白提取與酶解

分別稱取0.5 g攪碎的原料肉及肉制品置于10 mL離心管中，加入2.5 mL正己烷，超聲波處理3 min，渦旋5 min，4 500 r/min離心3 min，保留沉淀物。重復(fù)以上步驟2次，在N2的環(huán)境下使沉淀物干燥。加入4 mL提取液(6 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、50 mmol/L Tris-HCl)，旋渦混勻5 min，超聲波處理3 min，4 ℃、12 000 r/min離心4 min，收集上清液，轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中并渦旋1 min。隨后，將提取物在室溫下1 315×g離心3 min，以消除先前步驟中可能產(chǎn)生的泡沫[8]。該上清液即為肉蛋白原樣液，采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，4 ℃下保存。取0.1 mL肉蛋白提取液與0.9 mL水混合，渦旋30 s，取200 μL混合溶液加入裝有150 μL NH4HCO3(0.5 mol/L)的2 mL離心管中，渦旋30 s，加入10 μL DTT溶液(0.5 mol/L)，混勻后水浴處理(75 ℃，30 min)，以使溶液中的蛋白質(zhì)變性，提取物冷卻至室溫。添加150 mmol/L碘代乙酰胺使蛋白質(zhì)烷基化，最終濃度為15 mmol/L，暗處反應(yīng)30 min。隨后，添加50 μL牛胰蛋白酶溶液(0.5 mg/L，用30 mmol/L NH4HCO3溶液配制)和10 μL CaCl2溶液(0.1 mol/L)。立即將酶解液渦旋1 min，37 ℃水浴酶解12 h。向酶解液中加入20 μL甲酸終止反應(yīng)，混勻后置于室溫中15 min，加水定容至1 mL。

1.3.2 脫鹽

用HLB固相萃取柱進(jìn)行脫鹽處理，先用3 mL甲醇洗滌和活化柱，然后用3 mL體積分?jǐn)?shù)1% FA平衡[9]。取酶解液1 mL過(guò)柱，并用0.5 mL體積分?jǐn)?shù) 1%的甲酸沖洗空的離心管，將洗滌液裝入小柱，以定量轉(zhuǎn)移樣品。然后用2 mL體積分?jǐn)?shù) 1%的甲酸水洗滌小柱。最后，將肽用1 mLV(乙腈)∶V(0.1%甲酸水)=1∶1洗脫到10 mL的離心管中，加入洗脫液后將小柱浸泡10 min，使肽能完全洗脫。再加1 mL混合洗脫液重復(fù)洗脫1次。隨后，將全部洗脫液在N2流中吹干，色譜分析前將提取物用0.5 mL的V(乙腈)∶V(0.1%甲酸水)=3∶97復(fù)溶，渦旋30 s，過(guò)0.22 μm有機(jī)系濾膜，上機(jī)檢測(cè)。

1.3.3 納流液相色譜-高分辨質(zhì)譜法分析篩選特征肽

將肉蛋白酶解復(fù)溶液以80 MPa的壓力直接上樣到PepMap 100 C18分析柱上(75 μm×250 mm，2 μm，美國(guó)Thermo公司)，再用300 nL/min的流速進(jìn)行洗脫，流動(dòng)相A為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液，流動(dòng)相B為80%體積分?jǐn)?shù)乙腈溶液(含0.1%甲酸)，梯度洗脫程序：0～2 min，2% B；2～40 min，2%～32% B；40～45 min，32%～37% B；45～50 min，37%～100% B；50～55 min，100% B。離子源為nano-Flex納噴霧離子源，正離子掃描模式，毛細(xì)管電壓2.0 kV，離子傳輸管溫度320 ℃，RF-lens為50%。數(shù)據(jù)依賴性質(zhì)譜(data-dependent acquisition，DDA)采集模式，一級(jí)質(zhì)譜分辨率70 000@m/z200，自動(dòng)增益目標(biāo)值(automatic gain control，AGC)值為1e6，最大注入時(shí)間(maximum injection time，MIT)為100 ms，掃描范圍為m/z300～1 500。二級(jí)譜圖分辨率設(shè)為17 500@m/z200，最大注入時(shí)間為80 ms，掃描范圍為m/z150～2 000，隔離窗口設(shè)為2.0 Da，碎裂能量設(shè)為28，碎裂模式為HCD，AGC值為1e5，采集top N設(shè)為20，其余參數(shù)按照默認(rèn)設(shè)置。

1.3.4 超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法測(cè)定特征肽的條件

分別取特征肽標(biāo)準(zhǔn)液或樣品溶液渦旋30 s、過(guò)0.22 μm濾膜，置于樣品瓶中，采用超高效液相色譜-四極桿靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜進(jìn)行DDA采集模式檢測(cè)。色譜條件：色譜柱：Hypersil GOLD C18選擇性柱(2.1 mm×100 mm，3.0 μm，Thermo公司)，柱溫40 ℃，進(jìn)樣室溫度10 ℃，流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；洗針進(jìn)樣，流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸乙腈；梯度洗脫程序?yàn)椋?～1 min，5% B；1～20 min，5% B～30% B；20～25 min，30% B～80% B；25～28 min，80% B；28～28.1 min，80% B～5% B；28.1～30 min，5% B。質(zhì)譜條件：正離子(ESI+)模式，鞘氣流速30 arb，輔助氣流速10 arb，毛細(xì)管電壓3.8 kV，離子源溫度320 ℃，S-lens RF 50%，輔助氣溫度350 ℃。一級(jí)母離子掃描范圍m/z300～2 000，二級(jí)碎片離子掃描范圍m/z50～2 000，前1 min和25 min后的流動(dòng)相進(jìn)廢液，離子列表為376.203 63+、576.317 62+、554.785 32+、384.547 53+、525.279 32+、672.361 92+、573.306 12+、534.297 82+、603.342 42+、563.801 82+；一級(jí)全掃描質(zhì)譜采集參數(shù)：分辨率70 000@m/z200，AGC值為1e6，MIT為100 ms，分離窗口2.0m/z；tSIM/ddMS2定量采集方法：一級(jí)質(zhì)譜采集參數(shù)同前，二級(jí)質(zhì)譜采集參數(shù)：分辨率35 000@m/z200，AGC值為2e5，MIT為80 ms，環(huán)數(shù)為15，分離窗口2.0m/z，各肽段碎片離子和碰撞能采用優(yōu)化后的值，肽段匹配優(yōu)選，動(dòng)態(tài)排除15.0 s，其他參數(shù)采用默認(rèn)值；PRM定量采集方法：分辨率35 000@m/z200，AGC值為2e5，MIT為80 ms，環(huán)數(shù)為8，分離窗口2.0m/z，各肽段碎片離子和碰撞能采用歸一化能量(normalized collision energy, NCE)值28，預(yù)設(shè)時(shí)間(time-scheduled)窗口為2.0 min。

1.3.5 方法學(xué)驗(yàn)證

本研究對(duì)超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法測(cè)定特征肽的線性范圍、檢出限(limit of detection, LOD)、定量限(limit of quantification, LOQ)、基質(zhì)效應(yīng)、加標(biāo)回收率、精密度等方法學(xué)參數(shù)進(jìn)行分析。加標(biāo)回收率采用在牛肉丸基質(zhì)中添加低(4 μg/g)、中(20 μg/g)、高(100 μg/g)3個(gè)濃度的混合肽標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.1和1.3.2方法酶解和過(guò)柱脫鹽后進(jìn)行檢測(cè)分析，計(jì)算回收率和準(zhǔn)確度。分別按照3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)為依據(jù)，計(jì)算該方法測(cè)定各種特征肽的LOD和LOQ。精密度實(shí)驗(yàn)分別在不同時(shí)間重復(fù)測(cè)定100 μg/L的特征肽標(biāo)準(zhǔn)溶液的含量，以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)表示。移取適量的特征肽混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按質(zhì)量比加入到按1.3.1和1.3.2處理的肉丸蛋白酶解液中，配制成一定濃度梯度的混合工作液，渦旋30 s、過(guò)0.22 μm濾膜，按照1.3.4方法測(cè)定，繪制各特征肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照公式(1)計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)：

(1)

式中：KS和KM，分別為純?nèi)軇┖腿馔璧鞍酌附庖夯|(zhì)配制的特征肽工作液標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

1.4 數(shù)據(jù)檢索及處理

質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集用Xcalibur 4.2.47軟件(Thermo Scientific)，肽段DDA數(shù)據(jù)使用Proteome Discoverer 2.4(Thermo Scientific)和MaxQuant軟件進(jìn)行搜庫(kù)鑒定，檢索UniProt_Bovine(包含876 759條蛋白序列)、_Chicken(包含709 277條蛋白序列)、_Pig(包含709 277條蛋白序列)、_Duck(包含842 876條蛋白序列)數(shù)據(jù)庫(kù)，一級(jí)質(zhì)譜中母離子質(zhì)量誤差為10×10-6，二級(jí)質(zhì)譜中碎片離子質(zhì)量精度：0.02 Da，酶為胰蛋白酶(trypsin)，完全酶切，漏切數(shù)目為0個(gè)，固定修飾為半胱氨酸的烷基化(C，+57.021 50 Da)，可變修飾為甲硫氨酸的氧化(M，+15.994 92 Da)，鑒定結(jié)果作為譜圖庫(kù)進(jìn)行特征肽段的挑選與鑒別，通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST算法驗(yàn)證其種屬特異性。特征肽參數(shù)優(yōu)化和譜圖庫(kù)離子挑選、定性確證等分析使用Skyline 20.1軟件，參數(shù)設(shè)置：截止得分0.99；添加修飾：半胱氨酸碘乙酰化(carbamidomethyl)、氧化(oxidation)；配置離子對(duì)設(shè)置：母離子電荷：2+、3+、4+，子離子電荷：1+、2+，離子類型：y、b、p；串聯(lián)質(zhì)譜篩選參數(shù)設(shè)置：采集方法：targeted，子離子質(zhì)量分析儀：Orbitrap，分辨率：35000@200；導(dǎo)入fasta文件。tSIM/ddMS2和PRM數(shù)據(jù)使用Processing模板建立處理文件，導(dǎo)入Xcalibur采集序列表進(jìn)行批處理，將處理后的序列文件用Quan Browser插件打開(kāi)查看質(zhì)譜圖、標(biāo)準(zhǔn)曲線等。

2 結(jié)果與分析

2.1 特征肽的篩選

納升級(jí)高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜能靈敏快速的鑒定多肽，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，短時(shí)間內(nèi)可獲得大分子蛋白質(zhì)的序列數(shù)據(jù)。采用高分辨率、高掃描速度的質(zhì)譜對(duì)牛肉、豬肉、雞肉和鴨肉等4個(gè)物種肉中的蛋白質(zhì)進(jìn)行了分析鑒定，極大豐富了分析結(jié)果中的蛋白質(zhì)和多肽的信息，同時(shí)，也增加了質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果中的同源蛋白質(zhì)和肽生物標(biāo)志物的數(shù)量。圖1展示的是牛屬肌球蛋白-1來(lái)源的特征肽ALEDQLSELK(理論m/z573.306 12+)和肌紅蛋白來(lái)源的特征肽HPSDFGADAQAAMSK(理論m/z766.843 52+)的母離子色譜質(zhì)譜提取峰及其二級(jí)碎片離子質(zhì)譜圖，由于胰蛋白酶是在精氨酸(R)和賴氨酸(K)的羧基端將肽切斷，大部分多肽段的母離子帶有2個(gè)或3個(gè)正電荷，在低能碰撞誘導(dǎo)裂解產(chǎn)生的碎片離子主要是b-離子和y-離子，前者含有氨基末端、后者含有羧基末端，通常Q、R、K殘基會(huì)丟失氨基(-17)，S、T、E殘基等會(huì)丟失水分子(-18)，如特征肽ALEDQLSELK中y1(K-)和y6(-Q-L-S-E-L-K)分別脫氨形成m/z130.086 6和m/z700.387 0的碎片離子峰，特征肽ALEDQLSELK和HPSDFGADAQAAMSK中碎片離子y3(-E-L-K)和b8(-H-P-S-D-F-G-A-D-)失去水分子形成m/z371.228 9和m/z809.315 9的碎片離子峰。碎片離子的實(shí)測(cè)m/z與理論m/z偏差均在10×10-6范圍以內(nèi)的水平，譜圖質(zhì)量非常高，結(jié)果非常可信，可用于鑒別分析。

圖1 特征肽ALEDQLSELK(a)和HPSDFGADAQAAMSK(b)的二級(jí)碎片離子圖Fig.1 Fragment ion spectra of marker peptide ALEDQLSELK (a) and HPSDFGADAQAAMSK (b)

根據(jù)測(cè)定到的y系列和b系列離子的匹配情況鑒別備選特征肽段，借助UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST算法[10-11]可鑒定出特征肽的數(shù)量如下：雞屬19條、牛屬15條、鴨屬16條、豬屬12條，而用于定量測(cè)定分析的特征肽選擇常遵循以下原則[12]：含8～18個(gè)氨基酸、不易發(fā)生修飾而影響定量、易被質(zhì)譜檢測(cè)、色譜保留性適當(dāng)、碎片離子響應(yīng)較強(qiáng)、氨基酸序列中不含C或M，從中分別選擇8條特征肽作為各種屬肉類的鑒別，具體信息如表1所示。

2.2 色譜參數(shù)的優(yōu)化

肽段氨基酸序列構(gòu)成會(huì)影響其溶解性、親水疏水性，從而影響其色譜保留行為和分離效果。極性較小的肽段通常需要更高比例的有機(jī)相才能洗脫出，部分性質(zhì)相似的肽段需要更長(zhǎng)時(shí)間的洗脫才能分離，但加長(zhǎng)洗脫梯度又不可避免地會(huì)導(dǎo)致色譜峰變寬以及母離子信噪比降低。同時(shí)，較低的流速可以延長(zhǎng)目標(biāo)物的保留時(shí)間，但是過(guò)低的流速將引起峰展寬和拖尾，如圖2所示，親水性或疏水性較強(qiáng)的特征肽比較容易洗脫，且峰型較好，而特征肽1和8的拖尾現(xiàn)象非常明顯，這與2種特征肽的平均疏水性值(表1)接近于0的結(jié)果一致，因此應(yīng)當(dāng)考慮提高流速以獲得理想的梯度洗脫分離效果和良好的重現(xiàn)性，實(shí)驗(yàn)表明0.3 mL/min的流速非常適合分離特征肽與兼容質(zhì)譜分析。采用同樣的二元流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫優(yōu)化，根據(jù)前期研究[8]分別探討了梯度洗脫時(shí)間25、30、42 min等對(duì)特征肽分離效果的影響，25 min的梯度洗脫效果較差，部分特征肽不能完全分開(kāi)；30 min梯度洗脫能實(shí)現(xiàn)特征肽較好地分離，且減少了溶劑峰的干擾；42 min梯度洗脫時(shí)特征肽的分離度最好，但分析所需時(shí)間較長(zhǎng)，溶劑消耗量較多；30 min梯度洗脫既可降低分析所需時(shí)間和溶劑消耗量，又能夠達(dá)到快速、高效分離的要求，適合于質(zhì)譜檢測(cè)，優(yōu)化后的梯度洗脫條件如方法1.3.4所示。

圖2 低流速(0.2 mL/min)洗脫對(duì)色譜峰形狀的影響Fig.2 Effect of low flow rate (0.2 mL/min) elution on shape of chromatographic peaks

2.3 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

碰撞能量是影響質(zhì)譜信號(hào)和測(cè)定結(jié)果的重要因素，過(guò)低的碰撞能量，母離子被轟擊打碎的分子碎片較少，不利于目標(biāo)物的鑒別；而過(guò)高的碰撞能量母離子被過(guò)度打碎，分子碎片增多且碎片離子較小，也不利于鑒別和定量。此外，較高碰撞能下二級(jí)定量碎片離子的信號(hào)強(qiáng)度較高，無(wú)其他碎片離子干擾、可提高定量分析的準(zhǔn)確度。將選擇的特征肽段導(dǎo)入Skyline 20.1軟件，利用該軟件也可自動(dòng)優(yōu)化出四極桿靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜平臺(tái)上系列離子對(duì)、碰撞能量等參數(shù)以建立定量方法，軟件優(yōu)化的碰撞能如表2所示。為簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)程序可直接采用Skyline軟件優(yōu)化的碰撞能進(jìn)行測(cè)定，tSIM質(zhì)譜采集模式測(cè)定結(jié)果也表明，用自動(dòng)優(yōu)化的碰撞能(collision energy, CE)值所測(cè)得的母離子和碎片離子的信號(hào)強(qiáng)度無(wú)顯著差異(P>0.05)。同時(shí)，采用該高分辨質(zhì)譜法可解決傳統(tǒng)三重四極桿質(zhì)譜儀中需要優(yōu)化母離子與子離子對(duì)進(jìn)行定量的問(wèn)題，高分辨質(zhì)譜儀可記錄目標(biāo)母離子的全部碎片離子圖譜，且全是高分辨、高質(zhì)量精度的子離子，這為準(zhǔn)確鑒別干擾離子排除假陽(yáng)性提供了非常好的幫助。PRM模式中無(wú)需優(yōu)化碰撞能量，肽段測(cè)定中常用NCE值為28，其中NCE是一個(gè)無(wú)量綱數(shù)值，大致相當(dāng)于質(zhì)量數(shù)為500、電荷數(shù)為1的參比離子的碰撞能(單位eV)，實(shí)際使用的能量是根據(jù)所選母離子的質(zhì)量和電荷數(shù)實(shí)時(shí)自動(dòng)計(jì)算的，這進(jìn)一步簡(jiǎn)化了方法開(kāi)發(fā)所需的時(shí)間。PRM模式中目標(biāo)肽段預(yù)設(shè)時(shí)間窗口大小也是影響檢測(cè)的主要參數(shù)，預(yù)設(shè)時(shí)間窗口大小直接受目標(biāo)肽段保留時(shí)間偏移的影響，窗口設(shè)定太小，目標(biāo)物保留時(shí)間出現(xiàn)偏移檢測(cè)不出；窗口設(shè)定太大，則肽段檢測(cè)比例及掃描點(diǎn)數(shù)明顯減少[12]。較短的色譜梯度下肽段保留時(shí)間的偏移相對(duì)更低，且色譜表現(xiàn)更穩(wěn)定，優(yōu)化后的參數(shù)見(jiàn)實(shí)驗(yàn)方法部分。2種采集模式下，8條特征肽段的色譜-質(zhì)譜圖如圖3所示，色譜峰形尖銳，分離效果好，可用于定量分析特征肽的含量。

a-tSIM/ddMS2;b-PRM圖3 不同質(zhì)譜采集模式下特征肽段的色譜-質(zhì)譜圖Fig.3 Chromatography-mass spectrometry of marker peptides in different acquisition modes

2.4 方法學(xué)考察

將配制好的合成肽混合標(biāo)準(zhǔn)系列樣品液按1.3的色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜測(cè)定，記錄各特征肽出峰時(shí)間和母離子及碎片離子的峰面積，以各特征肽的峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，8條特征肽在2種質(zhì)譜采集模式(tSIM/ddMS2和PRM)下具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均>0.99，2種質(zhì)譜采集模式下的相關(guān)性差異不大(P>0.05)，2種采集模式下的檢出限分別為0.04～0.19 μg/L、0.01～0.16 μg/L，PRM模式采用二級(jí)碎片離子加和方式表示出峰情況，其檢測(cè)限更低。

由表3可知，牛肉丸樣品提取液不影響特征肽pep2、pep5、pep6、pep7、pep8的測(cè)定，即不存在基質(zhì)效應(yīng)，而對(duì)特征肽pep1、pep3、pep4產(chǎn)生一定的抑制效應(yīng)。各特征肽的加標(biāo)回收率高，該回收率與多肽平均疏水性的相關(guān)系數(shù)為0.982，這主要是由于HLB為反相親水性的改性苯乙烯聚合物，對(duì)蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸等具有較好的保留，表1中多肽平均疏水值<0表示多肽為疏水性，疏水值>0表示多肽為親水性，pep5和pep6的疏水性較強(qiáng)，其保留效果較差、回收率偏低，應(yīng)用中可根據(jù)多肽的平均疏水性值選擇合適的固相萃取柱和洗脫溶液。

2.5 樣品測(cè)定

為了驗(yàn)證所建立分析方法的適用性，對(duì)市場(chǎng)上購(gòu)買的不同價(jià)位的12種牛肉丸樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表4所示。本次抽樣篩查的牛肉丸樣品中共檢測(cè)出5條不同種屬的特征肽，其種屬來(lái)源分別為牛肉2條、豬肉1條、雞肉1條、牛肉和雞肉共有1條，在檢測(cè)的樣品中不含其他種屬肉類的比例為41.7%，牛肉丸樣品中標(biāo)明混有其他肉類的比例為42.8%，這表明市售的牛肉丸中部分產(chǎn)品混有其他種類的肉，其混入量不等，且有的產(chǎn)品中豬肉混入的量非常高。

如圖4所示，2種質(zhì)譜采集模式下均測(cè)出強(qiáng)信號(hào)的豬肉源特征肽。

a-PRM;b-tSIM/ddMS2圖4 兩種采集模式測(cè)定的樣品2中特征肽的色譜-質(zhì)譜圖Fig.4 Chromatography-mass spectrometry of marker peptides in sample 2 determined by two acquisition modes

鴨肉中的1條特征肽(pep4)在部分樣品的色譜-質(zhì)譜圖中也出峰，如圖5-a所示，但與特征肽pep4的二級(jí)質(zhì)譜(圖5-b)對(duì)比可以看出碎片離子不同，出峰的應(yīng)為干擾雜質(zhì)，即鴨肉的2條特征肽均未測(cè)得，這表明牛肉丸樣品中未混入鴨肉。從測(cè)定結(jié)果可以看出，本方法可以利用高分辨質(zhì)譜的二級(jí)圖譜有效排除假陽(yáng)性結(jié)果，抽檢的樣品中S2和S7的測(cè)定結(jié)果與標(biāo)識(shí)一致，這表明所建方法可靠，可用于肉及肉制品中蛋白種屬來(lái)源的鑒別和測(cè)定，比已報(bào)道[13-14]的三重四極桿質(zhì)譜法的鑒定能力更強(qiáng)。

a-干擾物的二級(jí)質(zhì)譜圖；b-特征肽pep4的二級(jí)質(zhì)譜圖圖5 樣品8中干擾物與特征肽pep4的質(zhì)譜圖對(duì)比Fig.5 Comparison of mass spectrograms of interfering substances in the sample 8 with pep4

基于超高效液相色譜-四極桿靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜的tSIM/ddMS2和PRM兩種采集模式建立的定量測(cè)定8條不同種屬來(lái)源的肉類特征肽的方法檢出限分別為9.84～33.13 μg/kg、2.46～27.90 μg/kg，遠(yuǎn)優(yōu)于采用納升級(jí)液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜的數(shù)據(jù)依賴型采集模式測(cè)定5條特征肽的方法[15]，且本文建立的方法重現(xiàn)性和測(cè)定所需時(shí)間也優(yōu)于納升級(jí)液相色譜法，這與文獻(xiàn)[16]報(bào)道的鑒別出的蛋白數(shù)量少而夠用的情況下采用超高效液相色譜分析以提高其重現(xiàn)性的結(jié)果一致。同時(shí)，基于高分辨質(zhì)譜法的靈敏度遠(yuǎn)低于三重四極桿質(zhì)譜法的靈敏度[13,17]，這主要是由于三重四極桿質(zhì)譜在靶向定量方面具有非常出色的檢測(cè)能力，但在鑒別復(fù)雜基質(zhì)中共洗脫的質(zhì)核比相近的肽段方面的分辨率較低而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果[18]，而采用四極桿靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜的tSIM/ddMS2和PRM兩種采集模式可借助二級(jí)圖譜的精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行鑒別有效排除假陽(yáng)性結(jié)果。隨著高分辨質(zhì)譜技術(shù)的進(jìn)步和設(shè)備升級(jí)、檢測(cè)能力增強(qiáng)，特別是近年來(lái)報(bào)道的四極桿靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜的PRM模式在定量能力方面可以“媲美”高端三重四極桿[19]，使其在定量檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，因而本文建立的采用tSIM/ddMS2模式的一級(jí)質(zhì)譜圖和PRM模式的二級(jí)質(zhì)譜圖定量測(cè)定特征肽的方法可為準(zhǔn)確快速地鑒別肉制品中蛋白質(zhì)種屬來(lái)源和肉類摻假情況提供強(qiáng)有力的支撐。

3 結(jié)論

納升級(jí)高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法篩選出的8條特征肽碎片離子的實(shí)測(cè)質(zhì)核比與理論值偏差小，譜圖質(zhì)量高，結(jié)果可信，可用于肉種屬鑒別和分析。牛肉丸樣品中蛋白質(zhì)變性程度大，需用強(qiáng)提取緩沖液經(jīng)超聲輔助法提取，胰蛋白酶酶解后經(jīng)固相柱凈化去除基質(zhì)中的鹽類等干擾物，超高效液相色譜梯度洗脫分離，采用四極桿靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜的PRM和tSIM/ddMS2采集模式定量測(cè)定，較低的色譜流速對(duì)平均疏水性值接近0的2條特征肽洗脫難、拖尾嚴(yán)重，梯度洗脫流速增加至0.3 mL/min可有效減少峰展寬與拖尾，且采用前1 min的液相洗脫液直接進(jìn)廢液的方式可有效降低鹽分對(duì)質(zhì)譜儀的損害和目標(biāo)肽段離子化的抑制效應(yīng)。碰撞能是影響質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果的重要因素，PRM采集模式不需優(yōu)化碰撞能可直接采用NCE為28的值，tSIM/ddMS2采集模式可采用Skyline軟件優(yōu)化出的最優(yōu)CE值，從而簡(jiǎn)化優(yōu)化CE的過(guò)程。PRM模式在測(cè)定較多目標(biāo)物時(shí)需預(yù)設(shè)時(shí)間窗口，以提高目標(biāo)物檢測(cè)的通量，常用時(shí)間窗口為1.5～2.0 min，以盡量避免出峰時(shí)間波動(dòng)對(duì)目標(biāo)物檢測(cè)的影響和窗口太大肽段檢測(cè)比例及掃描點(diǎn)數(shù)明顯減少的影響。不同采集模式下各特征肽標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度的線性關(guān)系良好(相關(guān)系數(shù)≥0.99)，tSIM/ddMS2和PRM采集模式下的檢出限分別為0.04～0.19 μg/L、0.01～0.16 μg/L，在牛肉丸提取液中的基質(zhì)效應(yīng)介于81.3%～114.7%，3個(gè)添加濃度下的加標(biāo)回收率在89%～117%且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤10%(n=5)。2種采集模式均可利用二級(jí)碎片離子鑒別目標(biāo)物以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，且PRM采集模式應(yīng)用二級(jí)質(zhì)譜的加和峰進(jìn)行定量檢測(cè)限更低，12批次牛肉丸樣品檢測(cè)中共檢出含有豬肉源或雞肉源特征肽的比例為58.3%，其中有明確標(biāo)識(shí)的為42.8%，部分產(chǎn)品中檢測(cè)出豬肉源特征肽的信號(hào)強(qiáng)度非常高。