氯化膽堿/乳酸低共熔溶劑預處理對筍殼物化性質及酶解效率的影響

胡強，王延云，蔣瓊，龔衛(wèi)華，王燕

1(樂山師范學院 竹類病蟲防控與資源開發(fā)四川省重點實驗室，四川 樂山，614000)2(樂山師范學院 生命科學學院，四川 樂山，614000)3(吉首大學 杜仲綜合利用技術國家地方聯(lián)合工程實驗室，湖南 吉首，416000)

中國竹資源豐富，約有39個屬500多種竹子，竹林面積達土地總面積的5‰以上。竹筍是源于竹林的主要蔬菜食品，因其味美而長期受到國內外消費者的喜愛，竹筍產(chǎn)業(yè)已逐漸成為我國農(nóng)民致富增收的支柱產(chǎn)業(yè)之一[1]。但竹筍產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，隨之也帶來了數(shù)量巨大的加工副產(chǎn)物——筍殼。目前，在竹筍加工過程中，筍殼通常被作為廢棄物而直接丟棄，這不僅增加了廢棄物的處置難度，還造成了生物資源的極大浪費[2]。筍殼是木質纖維素類生物質，由纖維素、半纖維素和木質素構成，其中纖維素和半纖維素是由單糖組成的，通過預處理和酶解可以轉化為可發(fā)酵糖。然而，木質素由3種苯基丙烷結構單元(愈創(chuàng)木酰、紫丁香基和對羥基苯基)聚合，通過共價鍵與纖維素和半纖維素交聯(lián)，組成復雜的三維網(wǎng)絡結構，形成了酶解的關鍵性屏障[3-4]。為了打破這種屏障，人們采用了許多基于不同機制的預處理方法，如：水熱、稀酸、稀堿、蒸汽爆破、有機溶劑等，但由于制備成本高、二次污染環(huán)境、有一定毒性、生物降解性差以及難以回收等缺點，限制了其進一步的發(fā)展與應用[5-9]。

近年來，低共熔溶劑(deep eutectic solvent，DES)作為預處理方法被發(fā)掘出來，它是由一定摩爾比的氫鍵受體和氫鍵供體通過氫鍵相互作用結合，熔點低于其原組分的共晶混合物。據(jù)報道，DES可以溶解木質素，選擇性地降解木質素-碳水化合物復合物(lignin-carbohydrate complex, LCC)，是一種高效的破壞木質纖維素生物質屏障性的預處理方法[10-13]。更重要的是，DES對提取木質素有較高的選擇性，這有利于再生木質素和保留纖維素的高價值利用。并且DES還具有綠色環(huán)保、成本低、毒性小、可回收和熱穩(wěn)定性良好等優(yōu)點，從而引起了國內外學者的廣泛關注[14]。氯化膽堿/乳酸溶劑已被證明是一種優(yōu)良的酸性DES體系，該體系預處理樣品后木質素的去除率較高[5,15-16]。但預處理條件對預處理后樣品的酶解效果影響很大，ALVAREZ-VASCO等[17]使用乳酸/氯化膽堿為DES，預處理楊木與花旗松，結果表明，溫度升高，酶解效果越好，但溫度過高會抑制木質素的分離；ZHANG等[18]用乳酸/氯化膽堿為DES，對玉米芯材進行處理，結果表明，DES摩爾比由1∶1增至1∶15，木質素的去除效率由33%增至61%。說明DES的溶劑摩爾比和預處理溫度會影響木質素的脫除效果和打破木質纖維素生物質屏障的程度。

本研究以氯化膽堿和乳酸(摩爾比為1∶3、1∶6和1∶9)合成DES，分別在90、110和130 ℃條件下預處理筍殼木質纖維素，脫除木質素，并通過成分分析、掃描電鏡(scanning electron microscope, SEM)、X-射線衍射及結晶度指數(shù)(crystallinity index，CrI)、傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectrum，F(xiàn)T-IR)表征DES預處理前、后筍殼木質纖維素的化學成分及物化特征的變化，以及對木質纖維素酶解效率的影響，以期實現(xiàn)筍殼高效酶解轉化，為獲得高值化利用提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦竹[Pleioblastusamarus(Keng) keng]筍殼采自四川省樂山市冠英鎮(zhèn)。筍殼用蒸餾水清洗干凈，晾干，使用高速粉碎機粉碎，并篩選40～60目顆粒，隨后放入烘箱60 ℃干燥至恒重；用定性濾紙包好，置于索式抽提器內，以V(甲苯)∶V(乙醇)=2∶1溶液為抽提劑，抽提6 h，取出放入烘箱60 ℃烘干至恒重，置于干燥器中備用。

纖維素酶Novozyme Ctec2，諾維信(中國)生物技術有限公司；葡萄糖，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；乳酸、氯化膽堿、濃硫酸、無水乙醇、DNS、乙酸、乙酸鈉等均為分析純。

1.2 儀器與設備

KYKY-FM6900LV掃描電子顯微鏡，北京中科科儀股份有限公司；D8 ADVANCE X-射線衍射儀，德國布魯克公司；Nicolet iS10傅里葉變換紅外光譜儀，美國尼高力公司；iMark酶標儀，深圳市科力易翔儀器設備有限公司；DHG-2050恒溫干燥箱，鄭州生元儀器有限公司；HWS電熱恒溫水浴鍋，上海惠泰儀器制造有限公司；ST16/ST16R高速冷凍離心機，美國熱電實驗設備有限公司；GR100DP高壓滅菌鍋，致微(廈門)儀器有限公司；FP-25馬弗爐，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；FDU-2110真空冷凍干燥機，日本東京理化。

1.3 筍殼DES預處理

1.3.1 DES準備

分別按摩爾比(1∶3、1∶6和1∶9)準確稱取氯化膽堿與乳酸，將其混合后置于60 ℃、200 r/min的搖床上搖晃20 min進行合成，直至體系變?yōu)闊o色透明液體，將合成的DES室溫儲存待用。

1.3.2 DES預處理

準確稱取5.00 g筍殼樣品于250 mL的三角瓶中，加入50 g合成的DES(摩爾比分別為1∶3、1∶6和1∶9)混合，油浴加熱處理(溫度分別為90、110和130 ℃)，處理時間為3 h，反應過程中每隔20 min搖晃三角瓶一次。反應結束后，立即將三角瓶置于冷水中終止反應，然后用真空過濾法分離所得的預處理液和固相殘渣，并將固體殘渣用150 mL丙酮洗滌，后用過量去離子水洗滌，直至濾液的pH值變?yōu)橹行?。最后將固體殘渣置于凍干機中，-40 ℃真空干燥48 h，保存于干燥器中備用。并根據(jù)公式(1)計算樣品的固體回收率。

(1)

1.4 筍殼成分分析

筍殼中木質纖維素的組分含量根據(jù)NY/T 3494—2019《農(nóng)業(yè)生物質原料 纖維素、半纖維素、木質素測定》方法測定。

1.5 表征方法

1.5.1 SEM分析

將未處理和DES處理的筍殼樣品表面分別進行噴金處理，然后采用掃描電鏡拍攝不同放大倍數(shù)(200和2 000倍)的照片。

1.5.2 CrI分析

采用X-射線衍射儀分別對未處理和DES處理筍殼樣品進行測試，主要條件：管壓40 kV，管流40 mA，掃描范圍5°～40°，掃描速度5 °/min，步長1°。并根據(jù)公式(2)計算樣品的結晶度指數(shù)。

(2)

式中：I002，002衍射晶面2θ=22.8°的強度；Iam，2θ=18°散射峰的強度[19]。

1.5.3 FT-IR分析

將未處理和DES處理筍殼樣品分別均勻分散于KBr中，再用壓片機壓片，采用傅里葉變換紅外光譜儀進行測定，主要條件：光譜分辨率為4 cm-1，波數(shù)范圍400～4 000 cm-1，信躁比50 000∶1, 掃描64次。

1.6 筍殼酶水解

1.6.1 纖維素酶活性的測定

纖維素酶Novozyme Ctec2的酶活性采用濾紙酶活力法測試，主要步驟：將濾紙剪至1.0 cm×6.0 cm大小并卷起，放入10 mL離心管底中，加入1.0 mL的HAc-NaAc緩沖溶液(0.05 mol/L，pH 4.8)和0.5 mL經(jīng)HAc-NaAc緩沖溶液稀釋后的酶液，然后將離心管置于50 ℃恒溫振蕩器中，在120 r/min下振蕩1 h，取出離心管后，置入沸水中5 min滅除酶活性。然后采用DNS法測得上清液產(chǎn)生的還原糖量，并按照公式(3)計算濾紙酶活力。

(3)

式中：m，葡萄糖含量，mg；180，分子質量，mg/mmol；60，時間，min；0.5，加入酶的體積，mL；N，稀釋倍數(shù)。

1.6.2 酶水解測定

將未處理和DES處理筍殼樣品分別進行酶水解，主要步驟：準確稱取200 mg筍殼樣品于50 mL離心管，加入5 mL HAc-NaAc緩沖溶液(0.05 mol/L，pH 4.8)和適量纖維素酶Novozyme Ctec2，置于恒溫振蕩器中(50 ℃，160 r/min)振蕩72 h，取樣，在沸水中煮沸10 min停止酶解，離心(6 000 r/min)5 min，然后采用DNS法對上清液中的還原糖進行測定，并計算酶水解率。

1.6.3 DNS法

采用DNS法測定還原糖含量[20]，主要步驟：分別取上述上清液和葡萄糖標準溶液，加入DNS試劑和蒸餾水，沸水浴中煮沸5 min，然后立即冷水冷卻。取冷卻液200 μL于酶標板中，在540 nm酶標儀中測定光密度值(OD)，以葡萄糖含量作為橫坐標，光密度值為縱坐標，繪制葡萄糖溶液標準曲線，并通過樣品光密度值與葡萄糖標準曲線，計算酶水解率。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016軟件數(shù)據(jù)處理，SPSS 26軟件差異性分析(P<0.05表示顯著性差異)，結果表示為平均值±標準差，試驗為3次平行；使用PowerPoint 2016版、Origin 2021軟件制圖和繪圖。

2 結果與分析

2.1 成分分析

苦竹筍殼DES預處理前后固體回收率和成分分析結果見表1。從固體回收率結果可見，DES預處理溫度從90 ℃上升到130 ℃，固體回收率從82.79%下降到69.38%，說明苦筍筍殼木質纖維素在DES預處理過程中均有半纖維素和木質素因溶解而被去除。從成分分析結果可見，與未處理相比，預處理后固體殘渣中纖維素的含量均有提高，從35.86%上升至48.63%；半纖維素的含量略有下降，從19.13%下降到15.59%；然而，木質素的含量下降明顯，從28.67%下降到14.82%，這與固體回收率結果相一致?？梢姡珼ES預處理可高度保留苦竹筍殼木質纖維素中的纖維素，而選擇性的溶解去除大部分的木質素和少量的半纖維素，這與SU等[21]采用DES預處理楊樹原料的結果一致。

表1 DES預處理前后筍殼成分分析Table 1 Composition analysis of bamboo shoot shell before and after DES pretreatment

2.2 SEM分析

采用掃描電鏡對苦竹筍殼木質纖維素預處理前后的表面結構、形貌特征進行了觀察，見圖1。從圖1-a可見，未處理的筍殼木質纖維素表面結構緊密、排列有序，其中纖維素相互粘結，這種天然的致密結構是抵抗酶水解的有力屏障，可以阻止纖維素酶進入筍殼內部，降低酶的可及性，因此未處理苦竹筍殼的酶解效率很低，與之后未處理苦竹筍殼酶水解效率低的結果一致。從圖1-b～圖1-j可見，經(jīng)過DES預處理后，苦竹筍殼木質纖維素完整有序的外觀結構被破壞，被分解成纖維束，以及單獨的條狀纖維，甚至是不規(guī)則的絲線狀碎片和多孔隙的結構，說明DES預處理會破壞纖維素與木質素以及半纖維素的連接，不同程度地去除了木質素及半纖維素，暴露出了纖維素。這種破壞解除了酶水解的物理結構屏障，增加了纖維素酶的可及性，提高了酶水解效率。

比較不同預處理溫度(90、110、130 ℃)的掃描電鏡圖時發(fā)現(xiàn)，DES預處理溫度為90 ℃時，苦竹筍殼木質纖維素結構部分被分離，不再緊密結合，但表面仍然存在粘結，將纖維素包裹在內，整個筍殼木質纖維素結構仍然完整有序，使纖維素酶只能有限地接觸到內部纖維素，這也是之后酶解效率僅小幅度增加的原因；隨著預處理溫度上升至110 和130 ℃時，半纖維素和木質素的去除程度增加，筍殼木質纖維素的結構變得更加疏松，纖維素大部分都被分離開，呈多間隙結構。由此可見，預處理的溫度為110和130 ℃時比90 ℃對筍殼木質纖維素結構的破壞程度更為顯著。

圖1 DES預處理前后筍殼掃描電鏡圖Fig.1 SEM images of bamboo shoot shell before and after DES pretreatment

2.3 CrI分析

采用X-射線衍射法研究苦竹筍殼木質纖維素DES預處理前后的晶體結構變化，見圖2。

圖2 DES預處理前后筍殼X-射線衍射圖Fig.2 X-ray diffraction pattern of bamboo shoot shell before and after DES pretreatment

未處理和預處理筍殼樣品的X-射線衍射圖峰型沒有明顯的區(qū)別，在2θ=18.0°和2θ=22.8°左右均出現(xiàn)吸收峰，分別代表無定形區(qū)Iam和結晶區(qū)I002的衍射強度，說明苦竹筍殼木質纖維素在DES預處理前后均為天然Ⅰ型結晶結構，DES預處理未改變樣品纖維素的晶型[22-23]。

研究了DES預處理反應溫度和組分摩爾比對苦竹筍殼木質纖維素晶體結構的影響。由圖3可見，未處理筍殼樣品的結晶度為52.7%，經(jīng)過DES預處理筍殼樣品的結晶度為54.7%～61.5%，均有不同程度的增加。纖維素的結晶結構對酶水解有著重要作用，高結晶度的纖維素不易被酶解，結晶度降低可以有效促進初始酶水解[24]，這一現(xiàn)象說明，DES預處理未有效破壞筍殼樣品晶體結構，但結晶度與半纖維素和木質素的含量也緊密相關，脫去無定形區(qū)的半纖維素和木質素導致了筍殼樣品結晶度的升高[5,25]，這與前面DES預處理前后筍殼成分分析結果一致。從反應溫度來看，預處理溫度為90 ℃時，筍殼樣品的結晶度為54.7%～56.8%，預處理溫度升至110 和130 ℃時，結晶度略有升高，分別為57.4%～61.5%和57.2%～61.1%。從DES組分摩爾比來看，氯化膽堿與乳酸摩爾比為1∶6，預處理溫度為110 和130 ℃時，筍殼樣品的結晶度分別增至61.5%和61.1%。說明，DES預處理反應溫度為110 和130 ℃和組分摩爾比為1∶6，苦竹筍殼樣品中的半纖維素和木質素的去除效果最好。

圖3 DES預處理前后筍殼的結晶度指數(shù)Fig.3 Crystallinity index of bamboo shoot shell before and after DES pretreatment

2.4 FT-IR分析

通過傅里葉紅外光譜分析了苦竹筍殼木質纖維素DES預處理前后各功能團及化學鍵的變化，見圖4。與纖維素相關特征峰為898(β-1,4糖苷鍵的C—O—C拉伸)、1 373(C—H彎曲振動)與1 425 cm-1(C—H剪切振動)[18,26-27]，這些吸收峰在苦竹筍殼木質纖維素DES預處理前后都存在，說明DES預處理未改變筍殼樣品中纖維素的結構；在898 cm-1處吸收峰強度有所增加，說明筍殼樣品在DES預處理后，纖維素含量略有增長，這與成分分析結果一致。

圖4 DES預處理前后筍殼紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectra pattern of bamboo shoot shell before and after DES pretreatment

1 737 cm-1處吸收峰對應的是半纖維素乙?；纳炜s振動，DES預處理后筍殼樣品此處吸收峰強度增加；與木質素相關的吸收峰在833、1 250、1 511、1 604 cm-1附近，833 cm-1處對應是丁香基木質素中的平面振動，1 250 cm-1處對應的是木質素的C—O拉伸，1 511 cm-1處對應的是芳香苯環(huán)骨架拉伸，1 604 cm-1處對應的是芳香族苯環(huán)骨架拉伸[18,26-27]，DES預處理后，這些吸收峰強度均有所減弱，甚至消失。說明DES預處理后，筍殼樣品中的木質素-半纖維素連接酯鍵結構被打破，木質素大部分被脫除，但結構未被完全破壞，半纖維素仍有部分保留，這與王延云等[20]在堿聯(lián)合超高壓預處理筍殼酶解效率的研究結果一致。

2.5 酶水解

苦竹筍殼木質纖維素DES預處理前后酶水解率是評價DES預處理效果的關鍵指標，采用濾紙酶活力法測得纖維素酶Novozyme Ctec2的酶活性為181.39 FPU/mL，然后按200 mg筍殼樣品加入80 μL纖維素酶Novozyme Ctec2進行酶水解，結果見圖5。未處理的苦竹筍殼中纖維素酶水解率為29.24%，DES預處理的苦竹筍殼中纖維素的酶水解率達到66.78%～90.43%，是未處理苦竹筍殼的2.3～3.1倍，說明DES預處理可以有效提高筍殼的酶水解率，這與DES預處理導致筍殼木質纖維素結構破壞(圖1)、部分半纖維素和大量木質素的去除(表1)有關。

圖5 DES預處理前后筍殼的酶水解率Fig.5 Enzymatic hydrolysis rate of bamboo shoot shell before and after DES pretreatment

研究了DES預處理反應溫度和組分摩爾比對苦竹筍殼木質纖維素酶水解率的影響。通常木質素的存在對木質纖維素的酶水解效率有抑制作用，因為木質素粘結在纖維素表面，不僅阻礙了纖維素的酶水解，還與酶吸附形成木質素-酶復合物，降低酶解效率[27]。隨著DES預處理溫度從90 ℃提高到130 ℃，酶水解率分別為66.78%～75.91%(90 ℃)、88.65%～90.43%(110 ℃)和69.75%～74.98%(130 ℃)，可見DES預處理在90 ℃時，筍殼樣品的纖維素酶水解率最低，說明隨著DES預處理溫度升高，筍殼木質纖維素的物理結構破壞加劇(圖1)，去除了更多的半纖維素和木質素(表1)，有利于提高筍殼樣品中纖維素的酶水解率；但DES預處理在130 ℃時，筍殼樣品中纖維素酶水解率卻低于110 ℃時的酶水解率，這一現(xiàn)象說明，在DES預處理過程中過高的溫度(130 ℃)可能會導致纖維素和殘留木質素發(fā)生化學修飾(?；磻?，從而降低底物的酶水解率[28-30]。另外，預處理溫度為110 ℃時，DES預處理組分(氯化膽堿和乳酸)摩爾比不同，竹筍筍殼酶水解率相當，均達到89%以上。

3 結論

采用DES預處理苦竹筍殼，探究DES預處理對筍殼木質纖維素組分、物化特征的變化及纖維素的酶水解效率的影響。研究表明，DES預處理破壞了苦竹筍殼木質纖維素完整有序的外觀結構，將其分解成纖維束，并選擇性地溶解、去除大部分的木質素和少量的半纖維素，使纖維素保留、暴露；DES預處理未改變筍殼纖維素的晶體結構，但筍殼木質纖維素會因脫去無定形區(qū)的部分半纖維素和大量木質素，從而導致筍殼樣品結晶度的提高，這些DES預處理后筍殼木質纖維素的性質改變都大幅度促進了其酶水解率的提升，筍殼木質纖維素的酶水解率從29.24%(未處理)提升至66.78%～90.43%(DES處理)，提升了2.3～3.1倍。另外發(fā)現(xiàn)，DES預處理溫度升高，筍殼木質纖維素的酶水解率會相應增加，但DES預處理溫度過高(130 ℃)，反而會降低筍殼的酶水解率。本研究可為食品加工副產(chǎn)物的高值化利用(生產(chǎn)發(fā)酵糖、乙醇、乳酸等)提供指導。