灰樹花多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)表征及精氨酸酶抑制活性

李彥穎，張冰茹，林庚蘭，張安強(qiáng)*

1(浙江工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，浙江 杭州，310014)2(浙江省深藍(lán)漁業(yè)資源高效開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州，310014)

灰樹花[Grifolafrondosa(Dicks.) Gray]又名云蕈、蓮花菌等，在日本被稱為“舞茸”，是一種珍貴的藥食兩用真菌[1-2]?；覙浠ň哂胸S富的營養(yǎng)價(jià)值以及良好的風(fēng)味，不僅可以直接烹飪食用，還可以加工成食品添加劑以及保健食品，因此數(shù)百年來在日本、中國以及其他一些亞洲地區(qū)都頗受歡迎[3-4]。

在灰樹花的子實(shí)體和菌絲體中發(fā)現(xiàn)多種生物活性成分，包括多糖、蛋白質(zhì)、多酚、有機(jī)酸、氨基酸類、甾醇等[5-6]。20世紀(jì)80年代，從灰樹花子實(shí)體中提取出一種以β-1，6-連接的葡聚糖主鏈，并帶有1，3-連接分支的多糖，發(fā)現(xiàn)該多糖具有高效的抗癌活性[7]，此后對(duì)灰樹花活性成分的研究主要集中于多糖上?；覙浠ǘ嗵沁€具有顯著的免疫調(diào)節(jié)、降低血糖血脂、抗氧化、抗病毒和保護(hù)肝臟等功效[8]?，F(xiàn)階段研究主要以免疫學(xué)和細(xì)胞學(xué)的角度探究灰樹花多糖抗腫瘤等生物活性，而對(duì)酶機(jī)理的研究較少。

精氨酸酶是一種雙核含錳金屬酶，可催化L-精氨酸水解生成L-鳥氨酸和尿素[9]。在哺乳動(dòng)物中，精氨酸酶活性的增加與心血管系統(tǒng)、腎臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及免疫系統(tǒng)功能障礙和癌癥有著密切聯(lián)系[10]。精氨酸酶活性過高會(huì)減少NO合酶產(chǎn)生NO所需的L-精氨酸供應(yīng)[11]，研究發(fā)現(xiàn)精氨酸酶抑制劑 nor-NOHA對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖有抑制作用，并誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，這可能與高濃度NO的促凋亡作用有關(guān)[12]。抑制精氨酸酶還可改善肥胖誘導(dǎo)的脂肪組織炎癥[13]。因此精氨酸酶可作為一種新型的治療靶點(diǎn)。目前精氨酸酶抑制劑的開發(fā)主要集中于化學(xué)合成藥物上，如2(S)-氨基-6-硼己酸、(S)-(2-硼乙基)-L-半胱氨酸和Nω-羥基-nor-L-精氨酸等，存在一定的副作用，而從植物中提取的天然類精氨酸酶抑制劑，因其安全性及有效性表現(xiàn)出潛在的價(jià)值。BUJOR等[14]首次證明了山茱萸、花楸和莢蒾多酚提取物的精氨酸酶抑制作用與NO依賴性血管舒張作用有關(guān)；另外，植物中的糖苷化合物也表現(xiàn)出精氨酸酶抑制活性[15]?；覙浠ǘ嗵菍?duì)精氨酸酶抑制作用尚無研究報(bào)道，故結(jié)合灰樹花多糖藥理功效良好、無毒副作用等特點(diǎn)，探究其對(duì)精氨酸酶的抑制活性，并進(jìn)行初步的結(jié)構(gòu)表征，為尋找天然精氨酸酶抑制劑和開發(fā)灰樹花多糖新型藥物提供方向和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料與試劑

灰樹花(Grifolafrondose)子實(shí)體，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院；單糖標(biāo)準(zhǔn)品(D-葡萄糖、D-半乳糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、L-鼠李糖、D-甘露糖、D-核糖、L-阿拉伯糖、D-巖藻糖、D-木糖、N-乙?；?D-葡萄糖胺、N-乙?；?D-半乳糖胺)、牛肝精氨酸酶，上海源葉生物科技有限公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、α-異亞硝基苯丙酮、三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)，阿拉丁化學(xué)試劑(上海)有限公司；MnCl2，麥克林生物科技有限公司；生物防腐劑Proclin 300、剛果紅，美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

DJ-04中藥粉碎機(jī)，上海淀久儀器公司；R-1001VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；QT-80FC-LCD智能自動(dòng)部分收集器，上海琪特分析儀器有限公司；HL-2恒流泵，上海滬西分析儀器有限公司；DAWN HELEOS Ⅱ多角度激光散射儀、RID-10A示差折光檢測器，美國懷亞特技術(shù)公司；Nicolet 6700傅里葉紅外光譜儀、UltiMate 3000高效液相液質(zhì)色譜儀，賽默飛世爾科技公司；TU-1900紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器公司；SU8010場發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本日立公司；XE-70原子力顯微鏡，韓國帕克股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 灰樹花多糖的提取、分離純化

稱取200 g灰樹花子實(shí)體，粉碎后過80目篩，加入4倍體積95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇，浸泡12 h，除去脂肪和色素。過濾后收集殘?jiān)?，自然晾干備用?/p>

稱取20 g灰樹花子實(shí)體水浸提后殘?jiān)尤?.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaOH溶液，料液比為1∶20(g∶mL)，混合均勻后在57 ℃的水浴鍋中浸提2.25 h，間斷性攪拌，10 000 r/min離心10 min，過濾收集殘?jiān)蜕锨逡?，重?fù)提取2次。收集所有上清液，3 mol/L乙酸中和，繼續(xù)離心收集上清液。在45 ℃下減壓濃縮，透析，除去中和堿液產(chǎn)生的鹽，最后加入4倍體積95%乙醇，靜置24 h，離心收集沉淀，得到灰樹花堿提水溶性粗多糖。經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow 離子交換柱層析，分別用經(jīng)0.45 μm 水系濾膜過濾后的0.1、0.2、0.4 mol/L NaCl 溶液洗脫，苯酚-硫酸法測定含糖量，繪制洗脫曲線。收集不同組分，濃縮、透析脫鹽、冷凍干燥。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出0.2 mol/L NaCl 溶液的洗脫組分再進(jìn)行Sephacryl S-500 High Resolution 凝膠柱層析，經(jīng)0.45 μm水系濾膜過濾后的蒸餾水洗脫，收集單一組分，凍干得到水溶性多糖GFPN-2-A組分。

1.2.2 灰樹花多糖的結(jié)構(gòu)表征

1.2.2.1 分子質(zhì)量及純度鑒定

采用高效尺寸排阻色譜-多角度激光散射儀-示差折光檢測(high-performance size exclusion chromatography-multi-angle laser light scattering-refractive index，HPSEC-MALLS-RI)測定多糖的重均分子質(zhì)量。準(zhǔn)確稱取多糖樣品5 mg，用1 mL的0.1 mol/L NaNO3溶液(含有體積分?jǐn)?shù)0.02% Proclin 300試劑)充分溶解，過2次0.22 μm水系濾膜，注射器吸取并手動(dòng)進(jìn)樣。儀器檢測條件為：激光光散射儀DAWN HELEOS II，示差折光檢測器RID-10A，系統(tǒng)DAWN HELEOS SYSTEM，進(jìn)樣器High-Pressure Injection System，色譜柱TSKgel G3000PWXL，流動(dòng)相0.1 mol/L NaNO3溶液和0.02% Proclin 300試劑，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量100 μL，示差折光檢測器溫度為35 ℃。

1.2.2.2 紫外全掃描

配制1.0 mg/mL 的多糖溶液，在200～400 nm進(jìn)行紫外光譜掃描，檢測多糖中是否存在核酸和蛋白質(zhì)。

1.2.2.3 單糖組成分析

精確稱取多糖2 mg，加入5.0 mL 2 mol/L TFA，110 ℃下酸解8 h，水解后的多糖樣品和單糖標(biāo)準(zhǔn)品混合物在堿性條件下，加入500 μL的0.4 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one，PMP)-甲醇進(jìn)行衍生化處理，再加入1.0 mL氯仿反復(fù)萃取至無色，3 000 r/min下離心10 min，吸取上清液，過0.22 μm濾膜，進(jìn)行HPLC分析。檢測條件：色譜柱Xtimate C18(4.6 mm × 200 mm × 5 μm)，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長250 nm，進(jìn)樣量20 μL，流動(dòng)相：0.05 mol/L KH2PO4溶液(pH 6.7)和乙腈，體積比為83∶17。

1.2.2.4 紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR)掃描

取適量的多糖樣品與KBr粉末(100～200 mg)混合，研磨均勻，壓片后在4 000～500 cm-1范圍內(nèi)測定紅外光譜。

1.2.2.5 剛果紅實(shí)驗(yàn)

配制2 mg/mL的多糖溶液和80 μmol/L的剛果紅溶液，各取15 mL混合，取適量混合溶液加入1 mol/L的NaOH溶液，并使得混合液中NaOH的最終濃度達(dá)到 0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mol/L，反應(yīng)10 min后，在400～600 nm進(jìn)行紫外掃描，記錄每個(gè)混合液的最大吸收波長[16]。以各樣品的最終NaOH濃度為橫坐標(biāo)，最大吸收波長為縱坐標(biāo)，繪圖。

1.2.2.6 掃描電子顯微鏡分析

取適量干燥的GFPN-2-A粉末，粘在樣品板上，放入真空噴鍍儀中噴金，加速電壓為7 kV。在高真空條件下通過掃描電子顯微鏡系統(tǒng)進(jìn)行掃描，記錄不同放大倍數(shù)下樣品的形態(tài)。

1.2.2.7 原子力顯微鏡分析

用超純水配制0.1 mg/mL的GFPN-2-A多糖溶液，攪拌24 h以上，使多糖充分溶解，再稀釋10倍，攪拌均勻后吸取50 μL，均勻地滴在干凈的云母片上，水分自然揮干后用原子力顯微鏡在非接觸模式下觀察。

1.2.3 精氨酸酶抑制活性測定

1.2.3.1 多糖組分對(duì)精氨酸酶活性的抑制率

參考BORDAGE等[17]的方法并稍作改進(jìn)，按照以下順序添加溶液(共350 μL)：(1)50 μL 0.1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)BSA緩沖液(含或不含200 U/mL的精氨酸酶)；(2)150 μL含有10 mmol/L MnCl2的Tris/HCl緩沖液(50 mmol/L，pH 7.5)；(3)50 μL含有灰樹花多糖的溶液或其溶劑作為對(duì)照；(4)100 μLL-精氨酸(pH 9.7，0.1 mmol/L)。將上述混合溶液放入37 ℃水浴中反應(yīng)40 min，后置于冰上，迅速加入600 μLV(H2SO4)∶V(H3PO4)∶V(H2O)=1∶3∶7終止反應(yīng)。添加50 μL α-異亞硝基苯丙酮(5%乙醇配制)與生成的尿素反應(yīng)，100 ℃下避光反應(yīng)45 min(保持黑暗直到讀數(shù))，冷卻后離心，5 min后在550 nm下測定吸光值，重復(fù)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。多糖組分對(duì)精氨酸酶活性抑制率按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：Aa，不含多糖的精氨酸酶活性的吸光值；Ac1，0.1% BSA緩沖液代替精氨酸酶的對(duì)照1吸光值；Ab，含灰樹花多糖和酶反應(yīng)的吸光值；Ac2，含灰樹花多糖和不含酶反應(yīng)的對(duì)照2吸光值。

1.2.3.2 多糖濃度對(duì)精氨酸酶抑制率的影響

分別配制質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mg/mL的GFPN-2-A多糖溶液，按1.2.3.1中步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算各個(gè)質(zhì)量濃度下多糖對(duì)精氨酸酶活性的抑制率，每個(gè)濃度重復(fù)3次，取平均值，繪制多糖濃度-抑制率關(guān)系圖，并進(jìn)行回歸分析，得到抑制率為50%時(shí)多糖的質(zhì)量濃度，即IC50值。

1.2.3.3 多糖對(duì)精氨酸酶抑制類型判斷

在不同的多糖質(zhì)量濃度(0.4、0.6、0.8 mg/mL)下，改變精氨酸酶濃度(50、100、150、200 U/mL)，按1.2.3.1中步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測定多糖對(duì)酶活力的影響，以酶濃度為橫坐標(biāo)，酶反應(yīng)速率為縱坐標(biāo)，繪制不同多糖濃度下的酶濃度-反應(yīng)速率關(guān)系圖，確定GFPN-2-A對(duì)精氨酸酶的抑制類型。

1.2.3.4 多糖對(duì)精氨酸酶抑制動(dòng)力學(xué)研究

在不同的多糖質(zhì)量濃度(0.4、0.6、0.8 mg/mL)下，改變底物精氨酸質(zhì)量濃度(0.025、0.05、0.1、0.2 mg/mL)，按1.2.3.1中步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算出酶反應(yīng)速率，以底物質(zhì)量濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，以酶反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制雙倒數(shù)圖，確定抑制類型，并求得抑制動(dòng)力學(xué)常數(shù)Ki。

2 結(jié)果與分析

2.1 GFPN-2-A的提取、分離純化

堿提法從灰樹花子實(shí)體中獲取水溶性粗多糖，通過DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱，在不同鹽濃度的洗脫下，測定每管洗脫液的多糖含量，得到洗脫曲線如圖1-a，分別收集0.1、0.2、0.4 mol/L NaCl溶液洗脫出的多糖樣品，命名為GFPN-1、GFPN-2、GFPN-4，收率分別為22.3%、5.4%和1.3%。根據(jù)前期活性實(shí)驗(yàn)篩選結(jié)果，發(fā)現(xiàn)GFPN-2具有較好的精氨酸酶抑制活性，綜合考慮選取該組分進(jìn)行后續(xù)分析。GFPN-2經(jīng)Sephacryl S-500凝膠洗脫結(jié)果如圖1-b，在第56～70管，有一個(gè)狹窄單一的峰，說明純化效果好。將第60、61管合并收集，冷凍干燥后得到多糖組分，命名為GFPN-2-A。

a-DEAE離子交換洗脫曲線；b-Sephacryl S-500凝膠洗脫曲線圖1 GFPN-2-A的DEAE離子交換洗脫曲線和Sephacryl S-500凝膠洗脫曲線Fig.1 DEAE ion exchange elution curve and Sephacryl S-500 gel elution curve of GFPN-2-A

2.2 GFPN-2-A的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 分子質(zhì)量及純度鑒定

多糖純度指多糖分子質(zhì)量在某一定范圍內(nèi)，相似鏈長的平均分布。由圖2可知，經(jīng)HPSEC-MALLS- RI檢測， GFPN-2-A的出峰時(shí)間在19～25 min， 并為一個(gè)單一且狹窄的峰，由此判定GFPN-2-A的分子質(zhì)量分布比較均一，純度相對(duì)較高，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算得到其分子質(zhì)量為4.56 × 106Da。

圖2 GFPN-2-A的 HPSEC-MALLS-RI圖譜Fig.2 HPSEC-MALLS-RI profile of GFPN-2-A

2.2.2 紫外全掃描

GFPN-2-A的紫外全掃描光譜如圖3所示，在206 nm處有一個(gè)明顯的多糖吸收峰，而在260 nm和280 nm處無明顯的吸收峰，說明GFPN-2-A中不含游離的核酸或蛋白質(zhì)類物質(zhì)[18]。

圖3 GFPN-2-A的紫外全掃描光譜圖Fig.3 UV scanning spectra of GFPN-2-A

2.2.3 單糖組成

單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品和經(jīng)水解、衍生處理后的GFPN-2-A的HPLC譜圖如圖4所示，對(duì)比單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品的乙?；Y(jié)果可知，GFPN-2-A主要由葡萄糖組成，還含有少量的葡萄糖醛酸、甘露糖、核糖和半乳糖，其物質(zhì)的量比為54.00∶1.00∶0.51∶0.37∶0.68。

1-D-甘露糖；2-D-核糖；3-L-鼠李糖；4-D-葡萄糖醛酸；5-D-半乳糖醛酸；6-N-乙酰-氨基葡萄糖；7-D-葡萄糖；8-N-乙酰-氨基半乳糖；9-D-半乳糖；10-L-木糖；11-L-阿拉伯糖；12-L-巖藻糖a-單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品；b-GFPN-2-A圖4 單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品和GFPN-2-A的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of monosaccharide mixed standard and GFPN-2-A

2.2.4 FT-IR分析

GFPN-2-A的紅外光譜如圖5所示。

圖5 GFPN-2-A的紅外光譜圖Fig.5 FT-IR spectrum of GFPN-2-A

在3 382.53 cm-1處出現(xiàn)的強(qiáng)吸收峰代表—OH基團(tuán)的伸縮振動(dòng)，2 919.70 cm-1處的吸收峰是由于C—H的伸縮振動(dòng)的結(jié)果，在1 639.20、1 421.28 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰分別是羧酸根基團(tuán)的對(duì)稱和不對(duì)稱的伸縮振動(dòng)，表明GFPN-2-A中存在糖醛酸，與單糖組成的分析結(jié)果一致[19]。在1 730.00 cm-1附近沒有明顯的吸收峰出現(xiàn)，表明GFPN-2-A中的糖醛酸沒有被酯化[20]。在1 000.00～1 200.00 cm-1的吸收峰是由于C—O—C和C—O—H的拉伸振動(dòng)，在896.74 cm-1處的吸收峰表明GFPN-2-A是β構(gòu)型多糖[21-22]。

2.2.5 剛果紅實(shí)驗(yàn)

剛果紅是一種酸性染料，分子式為C32H22N6Na2O6S2。當(dāng)具有三股螺旋鏈構(gòu)象的多糖分子與剛果紅形成絡(luò)合物時(shí)，在一定濃度范圍內(nèi)的NaOH溶液中，其紫外最大吸收波長與剛果紅相比會(huì)向長波方向移動(dòng)，尤其當(dāng)NaOH濃度>0.3 mol/L后，該絡(luò)合物的最大吸收波長會(huì)發(fā)生明顯的下降[23]。由圖6可知，GFPN-2-A和剛果紅的絡(luò)合物的最大吸收波長隨著NaOH濃度的增加，逐漸向長波方向移動(dòng)，說明已經(jīng)形成了絡(luò)合物，而當(dāng)NaOH濃度>0.3 mol/L后，相比于剛果紅溶液，最大吸收波長無明顯下降，故GFPN-2-A不具有三螺旋構(gòu)象。三螺旋結(jié)構(gòu)與多糖生物活性密切相關(guān)，而單糖種類較多的多糖不容易形成三螺旋結(jié)構(gòu)[24]，結(jié)合單糖組成結(jié)果，GFPN-2-A是由5種單糖組成的均一多糖，因此對(duì)其三螺旋結(jié)構(gòu)的形成有一定影響。

圖6 GFPN-2-A和剛果紅絡(luò)合物在不同 NaOH濃度下的最大吸收波長變化Fig.6 Change curves of maximum absorption wavelength of complexes formed by GFPN-2-A and Congo red at different concentrations of NaOH

2.2.6 掃描電鏡分析

如圖7所示，在500、1 000、5 000、10 000的放大倍數(shù)下觀察GFPN-2-A的形貌特征，發(fā)現(xiàn)GFPN-2-A主要以不規(guī)則的碎屑狀和片狀堆積的形式存在，在5 000和10 000的放大倍數(shù)下觀察到GFPN-2-A的表面較為光滑平整，無孔狀結(jié)構(gòu)，說明分子間作用力較強(qiáng)，多糖分子間存在的相互排斥力較小。

a-×500；b-×1 000；c-×5 000；d-×10 000圖7 GFPN-2-A的掃描電鏡圖Fig.7 SEM images of GFPN-2-A

2.2.7 原子力顯微鏡分析

原子力顯微鏡是觀察多糖大分子形態(tài)的有效工具。由圖8可知，GFPN-2-A在水溶液中的表面形貌呈現(xiàn)出圓柱和圓錐的塊狀特征，平均高度約為13.2 nm。WANG等[25]研究發(fā)現(xiàn)單個(gè)多糖鏈的高度約0.5 nm， 表明GFPN-2-A分子間的相互作用使得分子鏈發(fā)生了聚集。

圖8 GFPN-2-A的原子力顯微鏡圖Fig.8 AFM topographic image of GFPN-2-A

2.3 GFPN-2-A的精氨酸酶抑制活性測定

2.3.1 GFPN-2-A濃度與精氨酸酶抑制率

精氨酸酶催化精氨酸轉(zhuǎn)化為鳥氨酸和尿素，根據(jù)尿素與α-異硝基丙苯酮反應(yīng)生成粉紅色亞胺，分光光度法測定在550 nm處產(chǎn)生的一個(gè)最大吸光度。如圖9-a所示，GFPN-2-A的質(zhì)量濃度在0～1 mg/mL時(shí)，其對(duì)精氨酸酶的抑制率逐漸增加，當(dāng)質(zhì)量濃度>1 mg/mL后，抑制率的增加幅度開始減小，說明GFPN-2-A并沒有使精氨酸酶失去活性，而在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其對(duì)精氨酸酶的抑制率有劑量依賴性。進(jìn)行回歸分析，得到GFPN-2-A對(duì)精氨酸酶的IC50值為(0.855 ± 0.64)mg/mL。

2.3.2 GFPN-2-A對(duì)精氨酸酶的抑制作用分析

固定底物質(zhì)量濃度不變，分別在不同的多糖質(zhì)量濃度下，測定不同酶濃度的反應(yīng)速率。如圖9-b，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，酶反應(yīng)速率與酶濃度的關(guān)系擬合直線的斜率逐漸降低，且每個(gè)多糖質(zhì)量濃度下的擬合直線都經(jīng)過原點(diǎn)，這說明GFPN-2-A對(duì)精氨酸酶的抑制作用是可逆的，屬于可逆抑制[26]。

2.3.3 GFPN-2-A對(duì)精氨酸酶的抑制動(dòng)力學(xué)分析

通過酶促動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，在不同抑制劑質(zhì)量濃度下，以底物質(zhì)量濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，酶反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制線性直線，由各直線的交點(diǎn)所在位置即可判斷酶抑制劑的抑制類型，即雙倒數(shù)作圖法。由圖9-c可知，4組直線相交于y軸，且隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，直線與x軸的交點(diǎn)離原點(diǎn)越接近即斜率逐漸增大，說明酶促反應(yīng)的Vm不隨抑制劑濃度的改變而改變，符合競爭性抑制的動(dòng)力學(xué)特征，GFPN-2-A對(duì)精氨酸酶的抑制作用屬于競爭性可逆抑制。以雙倒數(shù)線性直線的斜率為縱坐標(biāo)，多糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作圖，根據(jù)競爭性抑制的動(dòng)力學(xué)方程(2)，得到的線性直線與x軸的交點(diǎn)，即為Ki。

(2)

根據(jù)圖9-d，求得GFPN-2-A對(duì)精氨酸酶的抑制常數(shù)為0.284 mg/mL。MOTOSHIMA等[27]報(bào)道了一種茶樹菇中的巖藻半乳聚糖FG-Aa，對(duì)精氨酸酶的抑制作用也為競爭性抑制，其IC50值為(5.82 ± 0.57)μmol/L。

a-GFPN-2-A對(duì)精氨酸酶抑制率；b-GFPN-2-A對(duì)精氨酸酶的抑制作用；c-GFPN-2-A抑制精氨酸酶的雙倒數(shù)；d-GFPN-2-A對(duì)精氨酸酶抑制常數(shù)圖9 GFPN-2-A對(duì)精氨酸酶的抑制活性Fig.9 Inhibitory of GFPN-2-A on arginase

3 結(jié)論

采用堿提法獲取的灰樹花粗多糖，經(jīng)高效分離制備得到多糖純化組分GFPN-2-A，初步結(jié)構(gòu)鑒定表明GFPN-2-A是一種分子質(zhì)量為4.56×106Da的酸性均一多糖，不含核酸及蛋白質(zhì)，紅外分析表明其主要存在β構(gòu)型糖苷鍵，單糖組成分析表明其主要由葡萄糖、葡萄糖醛酸、甘露糖、核糖和半乳糖組成，物質(zhì)的量比為54∶1∶0.51∶0.37∶0.68。掃描電鏡及原子力顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)GFPN-2-A表面較為光滑，無孔狀的結(jié)構(gòu)，分子間作用力強(qiáng)，在水溶液中呈圓柱和圓錐狀的形態(tài)。剛果紅實(shí)驗(yàn)表明GFPN-2-A不具備三螺旋結(jié)構(gòu)。在評(píng)價(jià)GFPN-2-A對(duì)精氨酸酶的抑制作用中，其對(duì)精氨酸酶的IC50為(0.855±0.64)mg/mL，通過酶促動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，判斷抑制類型屬于競爭性可逆抑制，抑制常數(shù)為0.284 mg/mL，而GFPN-2-A與精氨酸酶活性位點(diǎn)的結(jié)合方式及構(gòu)效關(guān)系仍有待進(jìn)一步探索。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)灰樹花堿提水溶性多糖具有良好的精氨酸酶抑制活性，可作為天然的精氨酸酶抑制劑，為灰樹花多糖的新型藥物開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。