硫化氫合成酶在糖尿病模型小鼠結腸動力障礙中的作用機制

全曉靜 常丹燕 許曉毓 戴菲 王進海

慢性便秘是糖尿病常見并發(fā)癥之一[1]，但發(fā)生機制尚未完全明確。目前研究認為，糖尿病相關便秘的病理生理機制包括腸道間質Cajal細胞減少、腸神經系統(tǒng)功能障礙等[2]。硫化氫(H2S)是一種氣體信號分子，在哺乳動物體內可通過胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)和胱硫醚-β-合成酶(CBS)催化底物L-半胱氨酸生成[3]。H2S在消化道動力調控中發(fā)揮雙向調節(jié)作用，低濃度時具有促進作用,而高濃度時具有抑制作用[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，H2S在鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病模型大鼠胰腺、肝臟等組織器官中水平明顯增加，說明H2S可能參與糖尿病不同組織器官功能障礙的發(fā)生發(fā)展[7]。本研究采用STZ誘導建立雄性C57BL/6糖尿病模型小鼠，觀察其結腸動力變化及CES和CBS的表達水平以明確其在糖尿病模型小鼠結腸動力障礙中的作用及機制。

材料與方法

1.材料：SPF級雄性C57BL/6小鼠(8周齡)購自西安交通大學實驗動物中心(實驗動物許可證號：63241547)。小鼠飼養(yǎng)溫度(24±1) ℃，濕度65%～66%，自由飲食。本動物實驗方案通過西安交通大學第二附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(2021866)。實驗溶液包括臺式液、無鈣生理鹽水溶液(PSS)、L型鈣離子通道電極內液和細胞消化液，其配方與前期研究一致[8]。實驗試劑：STZ、H2S供體硫氫化鈉(NaHS)、河豚毒素(TTX)、枸櫞酸緩沖液、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液均購自Sigma公司，CSE抗體購自Abcam公司，CBS抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司。STZ冰浴避光使用枸櫞酸緩沖液配置，在溶解后5min內使用。

2.方法

(1)動物分組和干預措施：將16只SPF級小鼠隨機分為STZ組和對照組，每組各8只。再將10只SPF級小鼠隨機分為正常組和TTX組，每組各5只。STZ組一次性腹腔注射STZ(200 mg/kg)誘導1型糖尿病模型,對照組腹腔注射等體積枸櫞酸緩沖液。正常組和TTX組不做任何處理。

(2)模型建立:STZ組和對照組小鼠造模前禁食20 h后分別一次性腹腔注射STZ及枸櫞酸緩沖液。在STZ注射前當天、后2周、后4周通過尾靜脈采血對兩組小鼠進行空腹血糖檢測，2周后空腹血糖水平穩(wěn)定且高于16.7 mmol/L的小鼠被認為造模成功且最終納入本研究。在STZ注射后第2周和第4周分別記錄兩組小鼠24 h排便粒數(shù)。在STZ注射后第4周，采用10%水合氯醛麻醉處死所有小鼠。

(3)免疫熒光和蛋白免疫印跡法(Western blot)：一抗、二抗孵育后，用DAPI進行細胞核染色，在光子顯微鏡下觀察STZ組和對照組小鼠CBS和CSE在結腸全層的分布。提取結腸組織總蛋白后經電泳、轉膜后孵育一抗、二抗，后進行顯影、曝光。以灰度分析軟件處理數(shù)據(jù)，記錄CBS和CSE的表達水平。

(4)恒溫肌槽實驗:麻醉處死所有小鼠后迅速取出結腸組織置于氧飽和的4 ℃臺式液中，分別沿腸管縱軸及橫軸方向制備縱行肌條(LMS)和環(huán)形肌條(CMS),寬約3 mm,長約10 mm。將肌條連接至張力換能器(型號RM6240BD，購自成都儀器廠)并傳導信號至多通道生理信號采集處理系統(tǒng)(型號RM6240BD，購自成都儀器廠)，記錄STZ組和對照組小鼠結腸平滑肌條收縮振幅。正常組小鼠肌條不做任何預處理，TTX組在浴槽中加入TTX(1μmol/L)孵育10min，之后每隔3min以濃度累計方式向兩組肌條中依次加入0.02 mmol/L、0.10 mmol/L、0.50 mmol/L和1.50 mmol/L NaHS。記錄各時段正常組和TTX組小鼠結腸平滑肌條收縮振幅，將加入0.02 mmol/L NaHS前測得的值定義為基線值。

(5)膜片鉗實驗:剝離正常小鼠結腸黏膜及黏膜下層，將剩余組織剪成小方塊，置于37 ℃氧飽和的細胞消化液中消化15～20 min。分次取適量組織塊置于含有氧飽和無鈣PSS的EP管中沖洗4次，然后置于4 ℃冰箱備用。實驗前用拋光的玻璃巴氏吸管制備細胞懸液，然后將其滴入浴槽中,待細胞貼壁后，用氧飽和臺式液灌流(1 ml/min)10 min以清除細胞殘渣。拉制尖端入液電阻為5～7 MΩ的微電極(型號P-97,購自Sutter公司)，在倒置顯微鏡下選擇折光性好、細胞膜光滑的平滑肌細胞進行高阻封接后負壓吸引破膜，形成全細胞記錄模式。采用Axon700B放大器及pClamp10.2軟件，鉗制電位-50 mV，階躍刺激從-50 mV開始，以每10 mV階躍去極化至+40 mV，持續(xù)300 ms引出L型鈣通道電流，記錄曲線圖和細胞膜電容，并記錄依次加入0.10 mmol/L和0.50 mmol/L NaHS后電流曲線圖，通過計算峰電流(pA)與膜電容(pF)的比值即獲得電流密度(pA/pF)。將加入0.10 mmol/L NaHS前測得的電流密度定義為基線值。

結 果

1.兩組小鼠空腹血糖與排便粒數(shù)比較：STZ組小鼠STZ注射后第2周與第4周空腹血糖水平均顯著高于同期對照組，排便粒數(shù)均顯著低于同組注射前及同期對照組(P<0.001)，見表1。

表1 兩組小鼠空腹血糖與排便粒數(shù)比較

2.兩組小鼠結腸平滑肌條收縮振幅比較：STZ組小鼠LMS和CMS收縮振幅均低于對照組[(0.47±0.12)g比(0.68±0.19)g，(0.25±0.07)g比(0.38±0.04)g，P<0.05]。

3.兩組小鼠CBS和CSE在中段結腸的表達情況：光鏡下可見，CBS主要分布在小鼠結腸的黏膜層和肌間神經叢(圖1A、1B)，CSE主要分布在黏膜層、平滑肌細胞和肌間神經叢(圖1C、1D)。STZ組小鼠結腸組織CBS和CSE表達水平均高于對照組[(0.61±0.16)g比(0.36±0.10)g，(0.84±0.16)g比(0.57±0.09)g，P<0.05]。

圖1 兩組小鼠CBS和CSE在中段結腸的表達情況(A、C：對照組；B、D：STZ組；A、B：CBS；C、D：CSE；DAPI染色，×200)

4.不同濃度NaHS對正常小鼠結腸平滑肌細胞L型鈣通道電流的作用比較：正常組和TTX組小鼠NaHS(0.1 mmol/L)LMS及CMS收縮振幅均高于同組基線值，兩組小鼠NaHS(1.5 mmol/L) LMS及CMS收縮振幅均低于同組基線值(P<0.05)。見表2。

表2 不同濃度NaHS組小鼠結腸平滑肌條收縮振幅比較

5.不同濃度NaHS組正常小鼠結腸平滑肌細胞電流密度比較：正常小鼠NaHS(0.10 mmol/L)組電流密度(-4.50±0.63)pA/pF高于NaHS(0.50 mmol/L)組(-3.03±1.12)pA/pF及基線值(-3.34±0.67)pA/pF(P<0.05)；NaHS(0.50 mmol/L)組電流密度與基線值比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

討 論

糖尿病患者結腸傳輸時間延長，常伴發(fā)便秘[1,10]。近來研究發(fā)現(xiàn)，腸神經系統(tǒng)、腸間質Cajal細胞和平滑肌細胞功能異常，興奮性和抑制性神經遞質失衡等參與糖尿病胃腸動力障礙的發(fā)生[2]。H2S作為繼NO和CO后第3個氣體信號分子，具有多種生物學功能，包括參與消化道動力的調控[4-6]。內源性H2S可通過CBS和CSE催化底物L-半胱氨酸而生成[6,13]。因此H2S合成酶表達改變會導致腸道H2S水平異常。STZ誘導的糖尿病動物實驗研究發(fā)現(xiàn)不同組織、器官H2S水平均增加[7]，說明STZ誘導的糖尿病模型存在H2S水平異常。本研究發(fā)現(xiàn)，STZ誘導的糖尿病模型小鼠排便減少、結腸動力減慢，可能與腸道組織H2S合成增加，抑制平滑肌細胞L型鈣通道開放有關。

STZ誘導糖尿病是經典且有效的造模方法，在前期很多研究中均采用[7-9]。本研究首先觀察了模型組小鼠的排便情況，結果顯示STZ組小鼠排便粒數(shù)在STZ誘導后第2周和第4周均顯著下降，并明顯低于同期對照組，間接說明糖尿病模型小鼠結腸蠕動減慢。我們還觀察了小鼠結腸LMS和CMS自發(fā)性收縮振幅改變，結果顯示STZ組小鼠LMS和CMS收縮振幅均較對照組明顯減弱。上述結果說明STZ誘導的糖尿病模型小鼠存在結腸動力減弱，與前期研究結果一致[12]。研究已證實STZ誘導的糖尿病模型小鼠結腸傳輸時間延長[9]，而排便粒數(shù)作為反映結腸傳輸功能的間接指標，在本研究中已證實STZ組顯著低于對照組。因此，本研究未進一步檢測結腸傳輸時間以評估糖尿病模型小鼠結腸動力。

本研究結果顯示，CBS主要分布在小鼠中段結腸的黏膜層和肌間神經叢，而CSE主要分布在黏膜層、平滑肌細胞和肌間神經叢。一方面說明黏膜及神經源性的H2S來自CBS和CSE，而平滑肌源性的H2S主要來自CSE催化底物生成。另一方面，說明H2S對腸道動力的調控可能為多靶點。但我們前期另一項研究結果顯示CBS在大鼠近端結腸平滑肌層表達[8]。該差異可能與種屬和檢測方法不同有關。本研究還發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比，糖尿病模型小鼠結腸CBS和CSE表達水平明顯增加，說明糖尿病模型小鼠腸道內源性H2S合成增加。

為明確H2S對小鼠結腸動力的作用，本研究觀察不同濃度NaHS對小鼠結腸組織LMS和CMS自發(fā)性收縮振幅的影響。與NaHS對小鼠胃竇平滑肌的收縮作用一致[6]，本研究也發(fā)現(xiàn)NaHS對小鼠結腸動力可能具有雙向調節(jié)作用，低濃度NaHS(0.1 mmol/L)促進LMS和CMS收縮，而高濃度NaHS(0.5～1.5 mmol/L)可明顯抑制LMS和CMS收縮。為進一步明確NaHS對結腸平滑肌收縮的雙向作用是神經源性還是肌源性，本研究采用TTX孵育LMS和CMS以阻斷腸神經纖維電壓依賴鈉離子通道，結果發(fā)現(xiàn)TTX孵育不能阻斷NaHS對小鼠結腸平滑肌收縮的雙向調節(jié)作用，說明H2S對結腸平滑肌收縮的雙向作用是肌源性的。為進一步明確H2S對結腸動力雙向調節(jié)作用的潛在機制，本研究觀察了不同濃度NaHS對正常小鼠結腸平滑肌細胞L型鈣通道電流的影響。L型鈣通道是調節(jié)平滑肌細胞收縮和舒張的重要離子通道[12]。鈣通道開放使鈣離子內流，細胞膜去極化，導致平滑肌細胞收縮。本研究結果發(fā)現(xiàn)，NaHS(0.1 mmol/L)使峰電流增加，但不會影響鈣通道的電壓依賴特性；而NaHS(0.5 mmol/L)使峰電流密度減低，峰電位右移，說明低濃度NaHS促進L型鈣通道開放從而促進平滑肌細胞收縮，而高濃度NaHS抑制鈣通道開放進而抑制平滑肌細胞收縮。結合NaHS對小鼠結腸平滑肌條自發(fā)性收縮活動的雙向調節(jié)作用，本研究認為L型通道參與NaHS對小鼠結腸收縮的雙重調節(jié)作用。

相關研究報道，NaHS生成H2S濃度約為NaHS濃度的1/3，故本研究中NaHS產生的H2S濃度為33～165 μmol/L,接近哺乳動物組織中H2S的生理濃度(1～160μmmol/L)[13-14]。因此，本研究推測正常小鼠腸道H2S對平滑肌細胞具有促進作用，從而促進結腸蠕動；而糖尿病模型小鼠由于腸道H2S合成酶表達增加，導致內源性H2S生成增加，而高濃度的H2S反向抑制L型鈣通道開放，從而抑制結腸收縮，導致糖尿病模型小鼠結腸慢傳輸。但是本研究并未對糖尿病模型小鼠腸道產H2S的相關菌群進行檢測，因此腸道菌群失衡是否導致內源性H2S生成增加需進一步研究證實。

綜上所述，STZ誘導的糖尿病模型小鼠結腸傳輸減慢，可能與結腸內源性H2S生成增加，進而抑制結腸平滑肌細胞L型鈣通道開放有關。因此，抑制內源性H2S生成可能有助于改善糖尿病患者慢性便秘。