納米二氧化鈦對佳樂麝香所引起的沙蠶（Perinereis aibuhitensis）神經(jīng)毒性的影響

張倩茹 ，姜麗思 ，牟文燕 ，王建美 ，李斯雯

（1.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所 污染生態(tài)與環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110016；2.廣東省環(huán)境污染控制與修復(fù)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510275；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

隨著化學(xué)分析技術(shù)的提高和人們環(huán)境意識(shí)的增強(qiáng)，環(huán)境中藥品及個(gè)人護(hù)理品（Pharmaceuticals and Personal Care Products，PPCPs）已日漸引起廣泛關(guān)注，而我國是PPCPs生產(chǎn)和使用大國。合成麝香作為天然麝香的廉價(jià)代替品，由于其具有易于制得、多種特殊氣味和良好的提香、定香能力等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于日用化工行業(yè)，如作為香料添加到化妝品（香水、肥皂、洗發(fā)水和面霜）和洗滌劑（柔順劑、沐浴露和香波）中。由于其持續(xù)不斷地進(jìn)入環(huán)境并能夠在生物體內(nèi)積累，其效應(yīng)類似于持久性污染物。佳樂麝香（HHCB）是目前使用量最多的一種人工合成麝香，僅2000年歐洲年使用量就達(dá)1427 t[1]。由于麝香類物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)中含有疏水性官能團(tuán)，很容易吸附在污水處理系統(tǒng)內(nèi)的沉積污泥中，當(dāng)這些污泥進(jìn)入土壤或地表徑流及地下水時(shí)，會(huì)造成生態(tài)環(huán)境的有機(jī)污染。直接或間接排放的污水、污泥回用或垃圾填埋是人工麝香進(jìn)入環(huán)境的主要途徑[2]。HHCB作為多環(huán)麝香的典型代表，在環(huán)境中的濃度日益升高，由于人工合成麝香在環(huán)境中穩(wěn)定性好，對生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)存在著潛在威脅，其生態(tài)毒理效應(yīng)日漸受到關(guān)注。目前研究表明，多環(huán)麝香對水生生物具有亞急性毒性、弱雌激素與抗雌激素效應(yīng)以及抑制多種藥物的外向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等毒性效應(yīng)，同時(shí)在水體、大氣和污泥等環(huán)境介質(zhì)甚至人體脂肪和母乳中均已檢測出HHCB[3]。多環(huán)麝香可通過影響機(jī)體對污染物的外排機(jī)制，抑制其活性，使有毒物質(zhì)在體內(nèi)蓄積進(jìn)而損傷機(jī)體[4]。Luckenbach等[5]已證實(shí)多環(huán)麝香可以顯著抑制加州貽貝（Mytilus californianus）細(xì)胞的外排型轉(zhuǎn)運(yùn)體活性。除此之外，大量研究表明，HHCB能明顯抑制水生生物幼蟲的生長發(fā)育[6]以及促進(jìn)人體胚腎細(xì)胞的繁殖[7]。目前也有研究關(guān)注人工合成麝香及其復(fù)合污染對動(dòng)、植物及微生物的毒性作用[8]。律澤等[9]研究表明，HHCB和Cd單一、復(fù)合污染對土壤細(xì)菌和真菌數(shù)量都有顯著影響。王雯等[10]研究表明，在吐納麝香（AHTN）和Cd聯(lián)合暴露情況下，高劑量AHTN對赤子愛勝蚯蚓（Eisenia foetida）金屬硫蛋白與谷光甘肽均產(chǎn)生了抑制作用[10]。由于多環(huán)麝香可能通過影響多重耐藥外排型轉(zhuǎn)運(yùn)體（Multidrug/multi-xenobiotic resistance efflux transporters）的活性而使生物體對外源化合物的排斥力減弱，因此，即使在停止多環(huán)麝香暴露后，通常被機(jī)體排斥的毒物仍然會(huì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，持續(xù)積累[5]。

納米TiO2是應(yīng)用十分廣泛的納米材料之一，工業(yè)上稱作鈦白粉[11]。由于納米TiO2與常規(guī)物質(zhì)相比有著尺寸小、比表面積大、表面活性高等特點(diǎn)，因此具有一系列不同于傳統(tǒng)金屬氧化物材料的特殊物理化學(xué)性質(zhì)。納米TiO2具有很強(qiáng)的吸收和散射紫外線能力，無刺激性，可用于化妝品等行業(yè)[12]。研究發(fā)現(xiàn)，納米材料的多種水環(huán)境行為，使其特性等發(fā)生改變，進(jìn)而影響納米材料的水生生物毒性[13]。納米TiO2能夠阻礙魚腥藻（Anabaena variabilis）細(xì)胞的固氮活性[14]，其在日光照射情況下能破壞綠藻（Chlorophyta）、剛毛藻（Cladophora）、鞘藻（Oedogonium）等細(xì)胞結(jié)構(gòu)，降低光合作用，導(dǎo)致藻類生長受到抑制[15-16]。此外，斑馬魚（Danio rerio）在長時(shí)間低劑量納米TiO2的慢性暴露下，隨暴露時(shí)間的延長和濃度的增加，受到的毒副作用日趨明顯，肝體比上升[17]。隨著納米工程材料在世界范圍內(nèi)的廣泛應(yīng)用，其可以通過空氣、水、土壤、廢物處置、食物鏈等多種途徑進(jìn)入生態(tài)環(huán)境，對生態(tài)環(huán)境及安全將產(chǎn)生何種影響還了解得不全面。目前針對納米TiO2對生物的毒性效應(yīng)研究開展較多，但對于納米TiO2與其他污染物組合或相互作用而產(chǎn)生的毒性效應(yīng)還知之甚少。特別是作為環(huán)境修復(fù)材料用于處理一些新興有機(jī)污染物過程中，可能帶來的復(fù)合污染生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)還鮮有報(bào)道，因此，有必要開展新興有機(jī)和無機(jī)復(fù)合污染毒性效應(yīng)研究。

乙酰膽堿酯酶（AChE）是生物體內(nèi)一種重要酶類，其作用是水解乙酰膽堿。乙酰膽堿是生物化學(xué)傳遞所必需的，但是它在釋放后必須迅速分解，否則該物質(zhì)的積累反而會(huì)引起神經(jīng)傳遞的阻斷[18]。早在20世紀(jì)50年代末就有研究將魚腦或無脊椎動(dòng)物AChE的抑制程度作為污染評(píng)價(jià)指標(biāo)[19]。研究表明，海洋無脊椎動(dòng)物AChE是一種最為敏感且易獲得的生物標(biāo)記物[20]。AChE活性高低常作為有機(jī)磷農(nóng)藥和神經(jīng)毒劑中毒的重要診斷指標(biāo)[21]，由于有機(jī)磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對生物體內(nèi)AChE的抑制十分顯著，利用農(nóng)藥對AChE活性的抑制，可表征環(huán)境樣品中有機(jī)磷農(nóng)藥的含量[22]。對血漿AChE活性的測定還有助于血管性癡呆病的鑒別診斷[23]。目前，國內(nèi)外對AChE的研究較多，AChE已成為環(huán)境科學(xué)和生態(tài)毒理學(xué)常用的污染評(píng)價(jià)指標(biāo)。

雙齒圍沙蠶（Perinereis aibuhitensis）屬環(huán)節(jié)動(dòng)物門多毛綱，廣泛分布于我國河口和海灣生境，是一種棲息于水陸交錯(cuò)帶的無脊椎動(dòng)物[24－25]。沙蠶以沉積物中營養(yǎng)物質(zhì)為主要食物，因其具有適應(yīng)性強(qiáng)和耐污染等特點(diǎn)而受到海洋環(huán)境學(xué)家的廣泛關(guān)注[25]。許多沙蠶種類對污染暴露極為敏感，在污染環(huán)境中會(huì)產(chǎn)生各種生理應(yīng)激反應(yīng)，甚至死亡[26]。沙蠶對重金屬、石油烴等污染物有較強(qiáng)的敏感性[27]，因此，經(jīng)常作為海陸交錯(cuò)帶生態(tài)監(jiān)測的指示生物。

本研究為探討新興有機(jī)和無機(jī)復(fù)合污染對海陸交錯(cuò)帶關(guān)鍵性物種沙蠶的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)，采用微宇宙試驗(yàn)方法，重點(diǎn)考察了雙齒圍沙蠶毒理學(xué)指標(biāo)（致死率和AChE活性）與新興污染物（HHCB和納米TiO2）濃度間的關(guān)系，著重關(guān)注納米TiO2對于由HHCB所引起的沙蠶神經(jīng)毒性的影響，以期為新興復(fù)合污染評(píng)價(jià)與預(yù)警提供數(shù)據(jù)及方法學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

HHCB購于SIGMA－ALORICH公司，其分子式為C18H26O；納米TiO2購于國藥集團(tuán)，分子式為TiO2，分子量為79.89，分子結(jié)構(gòu)式為O=Ti=O，粒徑小于25 nm，純度為99.8%。AChE試劑盒購于南京建成生物工程研究所。供試動(dòng)物雙齒圍沙蠶采自江蘇省贛榆縣沙蠶灘涂養(yǎng)殖場，為年齡、大小較為一致的成體沙蠶。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 供試生物采集及培養(yǎng)

采集的沙蠶置于有底泥的冰盒中運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，用采自其生活區(qū)域的海水清洗。挑選健康完整、大小相近的10條置于29 cm×14 cm×20 cm的養(yǎng)殖反應(yīng)器中，加入1000 mL鹽度為3.2%的人造海水，在（15±1）℃恒溫培養(yǎng)2 d后，將健康沙蠶轉(zhuǎn)至含不同濃度污染物的人造海水中培養(yǎng)1周后，挑選健康的沙蠶個(gè)體分別進(jìn)行毒性試驗(yàn)。容器中投入不同濃度的HHCB和納米TiO2，利用超聲使其分散均勻。每一容器中投入10只沙蠶，每個(gè)處理組3個(gè)平行，觀察沙蠶受脅迫癥狀，并記錄死亡數(shù)目。為了消除干擾因素，減少實(shí)驗(yàn)誤差，實(shí)驗(yàn)過程中使用的玻璃容器均在實(shí)驗(yàn)前用稀硝酸浸泡[28]。期間利用曝氣裝置保證氧氣恒定，不投喂餌料。人造海水成分見文獻(xiàn)[29]。

1.2.2 微宇宙試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定污染物脅迫濃度。單一脅迫組：HHCB 濃度為 0、150、450、750、1500 mg·L－1；納米 TiO2濃度為 0、5、10、40、80、160 mg·L－1。復(fù)合脅迫組：HHCB 濃度為 150 mg·L－1和 750 mg·L－1；納米 TiO2濃度為 5 mg·L－1和 40 mg·L－1。以不加污染物組為對照，投放沙蠶前利用超聲技術(shù)使化學(xué)品分散，分別取暴露 0、1、2、4、6 d 后沙蠶活體樣品進(jìn)行 AChE 活性測定。

1.2.3 AChE活性測定

AChE活性測定參照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒方法操作。將待測沙蠶在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙吸干，稱重。用手術(shù)剪快速剪碎組織至勻漿管中，加入9倍體積預(yù)冷勻漿介質(zhì)（0.01 mol·L－1Tris－HCl、0.0001mol·L－1EDTA－Na2、0.01 mol·L－1蔗糖、0.8%氯化鈉、pH 7.4緩沖液），采用組織勻漿器（Tissue Tearor，Biospec，US）冰浴勻漿 5 min。將制備好的勻漿液用高速冷凍離心機(jī)以4℃、8000 r·min－1條件離心10 min，留取上清液。按照試劑盒步驟依次加入試劑，于紫外－可見分光光度計(jì)412 nm處測定吸光值。定義每毫克組織蛋白在37℃保溫6 min，水解反應(yīng)體系中1 μmol基質(zhì)為1個(gè)活力單位（U），計(jì)算公式：

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One－way ANOVA），最小顯著差異法（LSD）在 α=0.05和 0.01水平進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 HHCB和納米TiO2單一及復(fù)合脅迫對沙蠶的毒性效應(yīng)

沙蠶在受到HHCB和納米TiO2單一及復(fù)合脅迫后，均出現(xiàn)明顯的中毒癥狀，對照組沙蠶較為安靜，靜臥水底并表現(xiàn)鉆沙行為。處理組沙蠶表現(xiàn)出活動(dòng)行為異常，對人為干擾反應(yīng)靈敏，置于脅迫環(huán)境暴露1～2 d后，普遍出現(xiàn)抱團(tuán)現(xiàn)象，無鉆沙行為，且腹部朝上；暴露4～6 d后，出現(xiàn)明顯的卷曲現(xiàn)象，身體開始出現(xiàn)大量紅腫充血、僵硬彎曲、生理排泄以及尾部潰爛，直至死亡等癥狀。這表明在本試驗(yàn)處理濃度下，外界化學(xué)品對沙蠶產(chǎn)生較強(qiáng)的毒性效應(yīng)，沙蠶為緩解中毒癥狀需要耗費(fèi)自身能量儲(chǔ)備，并通過自溶身體肌肉組織等方式來補(bǔ)充解毒所需能量。相似的這種自溶現(xiàn)象也發(fā)生在暴露于石油烴污染條件下的沙蠶[30]以及暴露于污染條件下的蚯蚓[31-32]。這是環(huán)節(jié)動(dòng)物門生物對于外界脅迫的一種特有的生理反應(yīng)。

由圖1可知，HHCB單一脅迫8 d，當(dāng)其濃度達(dá)到150 mg·L-1時(shí)，沙蠶死亡率為35.56%，隨著HHCB脅迫濃度的不斷增加，沙蠶死亡率逐漸升高，當(dāng)濃度達(dá)到750、1500 mg·L-1時(shí)，沙蠶死亡率分別為95.56%和100%。由圖2可知，納米TiO2單一脅迫8 d，當(dāng)其濃度從 5 mg·L-1增加到 40 mg·L-1時(shí)，沙蠶死亡率由13.33%迅速增加到66.67%；當(dāng)脅迫濃度繼續(xù)增大時(shí)，曲線成“凸”型，死亡率增加趨于平緩，當(dāng)脅迫濃度達(dá)到160 mg·L-1時(shí)，沙蠶的死亡率達(dá)到100%。通過擬合不同曲線方程發(fā)現(xiàn)，Logistic回歸——這種經(jīng)常應(yīng)用于藥理學(xué)和流行病學(xué)的回歸分析能夠很好地反映沙蠶死亡率與污染物濃度間的劑量-效應(yīng)關(guān)系[30]，其回歸方程分別表示為：

圖1 不同濃度HHCB對沙蠶的毒性效應(yīng)（8 d）Figure 1 Toxic effects of different concentrations of HHCB to P.aibuhitensis under 8 d stressed exposure

圖2 不同濃度納米TiO2對沙蠶的毒性效應(yīng)（8 d）Figure 2 Toxic effects of different concentrations of nano-TiO2to P.aibuhitensis under 8 d stressed exposure

Y1=100-95.56/[1+（X1/323.08）3]

Y2=100-96.67/[1+（X2/27.72）3]

式中：X1表示 HHCB 脅迫濃度，mg·L-1；X2表示納米TiO2脅迫濃度，mg·L-1；Y1和 Y2分別表示 HHCB 和納米TiO2脅迫8 d條件下沙蠶的死亡率。通過擬合方程計(jì)算得到沙蠶可以耐受HHCB的半致死濃度（LC50）為 313.21 mg·L-1；納米 TiO2的 LC50為 27.09 mg·L-1。

根據(jù)上述半致死濃度各選擇高低兩個(gè)濃度進(jìn)行復(fù)合脅迫試驗(yàn)，2 d后沙蠶的毒性效應(yīng)結(jié)果如圖3所示。納米TiO2的添加導(dǎo)致低濃度HHCB（150 mg·L-1）處理組沙蠶的死亡率明顯升高，從單一脅迫的20%增加至40%～80%；而納米TiO2存在與否對于高濃度HHCB（750 mg·L-1）所導(dǎo)致的死亡率（100%）均影響不大。分析其原因，可能與納米金屬顆粒結(jié)構(gòu)的特殊性有關(guān)，納米TiO2的小尺寸效應(yīng)使其能夠迅速進(jìn)入生物體各個(gè)組織器官并與體內(nèi)大分子發(fā)生反應(yīng)，抑制相關(guān)蛋白或酶的活性，進(jìn)而加重HHCB對生物體細(xì)胞外排機(jī)制的影響[4-5]，使得沙蠶體內(nèi)大量蓄積污染物，對機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p傷，最終導(dǎo)致死亡。此外，納米金屬顆粒的表面及界面效應(yīng)也可能使其與HHCB結(jié)合后發(fā)生一系列反應(yīng)，導(dǎo)致團(tuán)聚體化學(xué)特性改變，化學(xué)毒性大大增強(qiáng)，最終破壞生物體免疫系統(tǒng)，直至死亡。

2.2 HHCB單一脅迫對沙蠶體內(nèi)AChE活性的影響

圖3 HHCB和納米TiO2復(fù)合脅迫對沙蠶的毒性效應(yīng)（2 d）Figure 3 Joint toxic effects of HHCB and nano-TiO2to P.aibuhitensis under 2 d stressed exposure

圖4 不同暴露時(shí)間沙蠶體內(nèi)AChE活性與HHCB暴露濃度的關(guān)系Figure 4 Relationships between AChE activity in P.aibuhitensis and the exposed concentrations of HHCB under different treatment time

圖5 不同暴露時(shí)間沙蠶體內(nèi)AChE抑制率與HHCB暴露濃度的關(guān)系Figure 5 Relationships between inhibition rate of AChE in P.aibuhitensis and the exposed concentrations of HHCB under different treatment time

為探究HHCB對沙蠶所產(chǎn)生的神經(jīng)毒性效應(yīng)，考察了單一HHCB脅迫條件下沙蠶體內(nèi)AChE活性及抑制率的變化。由圖4可見，不同暴露時(shí)間下AChE活性基本隨暴露濃度的增加而降低，即HHCB對沙蠶體內(nèi)AChE的抑制率隨之升高（圖5）。與對照組相比，暴露1 d和2 d的抑制效應(yīng)并不明顯，抑制率僅在 16.08%～38.81%（1 d）和 0.64%～19.30%（2 d）范圍內(nèi)，HHCB的毒害抑制率均未超過50%；隨著HHCB對沙蠶脅迫時(shí)間的延長，抑制率明顯增高，特別是4 d時(shí)抑制率已達(dá)到了27.98%～53.62%，這表明沙蠶體內(nèi)的AChE已被明顯抑制。從整個(gè)脅迫周期來看，沙蠶體內(nèi)AChE對于HHCB毒害作用的反應(yīng)比較靈敏，其活性的高低與HHCB暴露濃度基本呈線性負(fù)相關(guān)。這與HHCB具有酮類的三環(huán)結(jié)構(gòu)密不可分，這種結(jié)構(gòu)能夠?qū)е略擃惢衔锉憩F(xiàn)出天然麝香的氣味[33]，可對神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生刺激作用，甚至毒害。有研究顯示，HHCB能夠影響大鼠小腦顆粒神經(jīng)元（CGNs）細(xì)胞存活率，損傷細(xì)胞膜，引起氧化脅迫，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而產(chǎn)生神經(jīng)毒性效應(yīng)，但它作用于神經(jīng)遞質(zhì)并產(chǎn)生毒害效應(yīng)的具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步探究[34]。

2.3 HHCB和納米TiO2復(fù)合脅迫對沙蠶體內(nèi)AChE活性的影響

HHCB和納米TiO2復(fù)合脅迫暴露1、2 d對沙蠶體內(nèi)AChE活性的影響如圖6所示。在低濃度HHCB（150 mg·L－1）處理組中，納米 TiO2的存在對沙蠶體內(nèi)AChE活性的影響顯著（P＜0.05），且隨納米TiO2濃度的增加，沙蠶體內(nèi)AChE活性呈升高趨勢；與單一低濃度HHCB處理組相比，低濃度納米TiO2（5 mg·L－1）的存在顯著降低了AChE活性（P＜0.05），高濃度納米TiO2（40 mg·L－1）影響不顯著（P＞0.05）。在高濃度HHCB（750 mg·L－1）處理組中，1 d 時(shí)低濃度納米 TiO2的存在顯著促進(jìn)了AChE活性（P＜0.05），而高濃度納米 TiO2影響不顯著（P＞0.05）；2 d 時(shí)納米 TiO2的存在顯著降低了AChE的活性（P＜0.05）。這表明脅迫初期納米TiO2的存在對HHCB神經(jīng)毒性產(chǎn)生的作用受脅迫濃度和作用時(shí)間影響；當(dāng)進(jìn)入脅迫穩(wěn)定期納米TiO2的存在可以鈍化AChE對HHCB的敏感性，進(jìn)而抑制了酶活性。這可能是由納米TiO2自身的結(jié)構(gòu)及化學(xué)特征所決定，HHCB與其復(fù)合后發(fā)生一系列反應(yīng)，增強(qiáng)了對沙蠶的神經(jīng)毒性效應(yīng)，使其體內(nèi)神經(jīng)傳遞受到阻斷，導(dǎo)致沙蠶機(jī)體生理生化過程失調(diào)和破壞，進(jìn)而造成免疫系統(tǒng)紊亂，直至死亡。

圖6 不同暴露時(shí)間HHCB和納米TiO2復(fù)合脅迫對沙蠶體內(nèi)AChE活性的影響Figure 6 Effects of the joint stresses of HHCB and nano-TiO2on AChE activity in P.aibuhitensis under different treatment time

3 討論

目前以沙蠶作為模式生物進(jìn)行的一些生態(tài)毒性效應(yīng)研究多集中在重金屬污染脅迫下沙蠶的解毒機(jī)制及富集狀況方面[35-36]。關(guān)于HHCB對海洋生物的毒性效應(yīng)研究亦有報(bào)道，研究發(fā)現(xiàn)，HHCB對海洋橈足類動(dòng)物的幼體發(fā)育有損傷和抑制作用[6，37]。此外，多環(huán)麝香會(huì)影響機(jī)體對污染物的外排機(jī)制，抑制外排轉(zhuǎn)運(yùn)體活性，導(dǎo)致污染物在體內(nèi)積累，毒性增強(qiáng)，最終導(dǎo)致機(jī)體死亡[38]。本研究結(jié)果表明，沙蠶對HHCB和納米TiO2具有較強(qiáng)的敏感性，隨著污染物濃度的增加，沙蠶的死亡率呈上升趨勢；HHCB的脅迫可顯著抑制沙蠶體內(nèi)AChE活性，是一種可作用于神經(jīng)系統(tǒng)并產(chǎn)生神經(jīng)毒性的化學(xué)物質(zhì)。它通過引起乙酰膽堿酯在中樞膽堿能突觸、神經(jīng)肌肉接頭等處的積累，表現(xiàn)出病狀，造成生物體生理生化過程的失調(diào)與破壞，從而導(dǎo)致生物體死亡。本研究中，在HHCB脅迫下沙蠶體內(nèi)AChE活性出現(xiàn)與對照組相當(dāng)或升高的現(xiàn)象可能是由于HHCB激發(fā)了沙蠶體內(nèi)AChE的從頭合成，進(jìn)而出現(xiàn)了酶活性升高的現(xiàn)象，這一結(jié)果與有機(jī)磷農(nóng)藥抑制AChE研究中酶活性的變化結(jié)論相一致[39]。Pérez等[20]研究表明，污染地區(qū)的過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）活性增強(qiáng)，分別為對照組的7倍和2倍，而AChE活性受到抑制，僅為對照組的四分之一，由此證明該地區(qū)存在具有神經(jīng)毒性和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的化學(xué)污染物；AChE在兩種供試生物中均表現(xiàn)出了相同的趨勢，由此認(rèn)為AChE是這些被測試指標(biāo)中最為可靠且敏感的生物標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也表明，隨著HHCB濃度的升高和暴露時(shí)間的增加，沙蠶體內(nèi)AChE的活性顯著降低。這一結(jié)論與Pérez等的研究結(jié)果基本一致，可能是由于HHCB與AChE發(fā)生乙?；饔?，從而抑制AChE活性，乙酰膽堿無法被水解，在體內(nèi)大量蓄積，誘發(fā)神經(jīng)纖維長期處于興奮狀態(tài)，過度刺激神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)癱瘓[40]。因此，對HHCB而言，AChE是一種反應(yīng)靈敏的生物標(biāo)志物。

自然環(huán)境中，由于污染物來源的多樣性和復(fù)雜性，通常情況下都是多種污染物共存形成復(fù)合污染。單個(gè)污染物在水體中的行為不可避免地受制于其他共存污染物。目前，針對重金屬與有機(jī)物聯(lián)合對生物的毒性作用研究相對較多。例如：張玄可等[41]研究表明Cd暴露對南方鲇的膽堿酯酶活性有較強(qiáng)的抑制作用。Zhang等[30]研究重金屬與石油烴的復(fù)合污染對沙蠶AChE活性的影響表明，特定濃度的重金屬可以緩解石油烴的神經(jīng)毒性，這一結(jié)論與本研究結(jié)果稍有差異，這可能與化學(xué)品種類、其在生物體內(nèi)的代謝途徑和能否通過組織血液屏障的機(jī)制等有關(guān)[42]。此外，化學(xué)品間的濃度及組合關(guān)系，也是差異產(chǎn)生的另一個(gè)重要因素，這與聯(lián)合效應(yīng)廣義理論基本一致。本研究結(jié)果表明，納米TiO2的存在有可能增強(qiáng)沙蠶AChE對HHCB的敏感性，進(jìn)而加劇了HHCB對沙蠶的神經(jīng)毒害作用，其可能的原因是：①由于納米TiO2的結(jié)構(gòu)非常微小，可以輕松地通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)改變細(xì)胞膜的滲透性，使得HHCB更易通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)而導(dǎo)致明顯的細(xì)胞毒性及炎癥反應(yīng)；②納米TiO2和HHCB的配位結(jié)合能夠抑制生物分子的活性，使得維持生物正常生理過程的功能受到破壞，從而導(dǎo)致毒性；③納米TiO2的高化學(xué)活性又使其可以與細(xì)胞內(nèi)眾多細(xì)胞器以及一些生物大分子發(fā)生作用，同時(shí)對組織也有嚴(yán)重?fù)p傷作用[43]，進(jìn)而影響機(jī)體對HHCB的外排機(jī)制，抑制外排轉(zhuǎn)運(yùn)體活性，使得毒性較強(qiáng)的HHCB在沙蠶體內(nèi)大量蓄積，對機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p傷，最終導(dǎo)致沙蠶快速死亡；④納米TiO2是一種典型的納米金屬氧化物，推測納米TiO2與HHCB結(jié)合時(shí)，其表面可能被HHCB分子所修飾，這些修飾后的顆粒在水中具有較好的分散性，從而防止其尺寸效應(yīng)的損失，如果表面特性不能被有效控制，納米顆?？赡苎杆倬奂纱蟮念w粒，更容易與生物分子和器官作用，從而對沙蠶產(chǎn)生更強(qiáng)的毒性效應(yīng)；⑤納米TiO2與HHCB復(fù)合污染情況下，兩者通過抑制核酸的生物合成和破壞蛋白質(zhì)合成機(jī)制以及破壞動(dòng)物組織膜的完整性等活動(dòng)誘導(dǎo)沙蠶衰老直至死亡。

4 結(jié)論

（1）沙蠶體內(nèi)AChE對HHCB的敏感性較高，HHCB能顯著抑制沙蠶體內(nèi)AChE活性，對沙蠶的神經(jīng)毒性作用較大。

（2）納米TiO2的存在可加重HHCB對生物體的神經(jīng)毒性，與化學(xué)品間的濃度及組合關(guān)系密切相關(guān)。

（3）AChE是佳樂麝香的靶標(biāo)酶類，可以通過酶活性的變化情況來表征目標(biāo)區(qū)域的污染狀況，可作為該類化學(xué)品的潛在生物標(biāo)志物。

（4）新型環(huán)境修復(fù)材料，如納米TiO2在處理有機(jī)污染時(shí)需摸清使用量及組合方式，慎重考量其可能帶來的復(fù)合污染毒性效應(yīng)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Sommer C.The role of musk and musk compounds in the fragrance industry[M]//Rimkus G G.Synthetic musk fragrances in the environment.Berlin：Springer,2004：1-16.

[2]Zhou Q X,Wang M,Fan F,et al.Research progress in environmental pollution,ecological behavior and toxicological effects of synthetic musks[J].Acta Scientiae Circumstantiae,2008,28（1）：1-11.

[3]Reiner J L,Wong C M,Arcaro K F,et al.Synthetic musk fragrances in human milk from the United States[J].Environmental Science&Technology,2007,41（11）：3815-3820.

[4]Nakata H,Sasaki H,Takemura A,et al.Bioaccumulation,temporal trend,and geographical distribution of synthetic musks in the marine environment[J].Environmental Science&Technology,2007,41（7）：2216-2222.

[5]Luckenbach T,Epel D.Nitromusk and polycyclic musk compounds as long-term inhibitors of cellular xenobiotic defense systems mediated by multidrug transporters[J].Environmental Health Perspectives,2005,113（1）：17-24.

[6]Breitholtz M,Wollenberger L,Dinan L.Effects of four synthetic musks onthe life cycle of the harpacticoid copepod Nitocra spinipes[J].Aquatic Toxicology,2003,63（2）：103-118.

[7]Seinen W,Lemmen J C,Pieters R H H,et al.AHTN and HHCB show weak estrogenic-but no uterotrophic activity[J].Toxicology Letters,1999,111（1/2）：161-168.

[8]陳 春,周啟星,劉瀟威,等.多環(huán)麝香對蚯蚓的急性和亞急性毒性效應(yīng)[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào),2012,7（4）：401-407.CHEN Chun,ZHOU Qi-xing,LIU Xiao-wei,et al.Acute and sub-acute toxicological effects of polycyclic musks on earth-worm,Eisenia fetida[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2012,7（4）：401-407.

[9]律 澤,胡筱敏,魏 煒,等.佳樂麝香和鎘復(fù)合污染對土壤中細(xì)菌和真菌數(shù)量的影響[J].生態(tài)學(xué)雜志,2014,33（8）：2161-2167.Lü Ze,HU Xiao-min,WEI Wei,et al.Joint effects of galaxolide and cadmium on bacteria and fungi quantites in soil[J].Chinese Journal of Ecology,2014,33（8）：2161-2167.

[10]王 雯,張 園,王秀娟,等.吐納麝香與鎘聯(lián)合暴露對赤子愛勝蚓體內(nèi)谷胱甘肽與金屬硫蛋白的影響[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào),2011,6（4）：396-402.WANG Wen,ZHANG Yuan,WANG Xiu-juan,et al.Effect of joint exposure to polycyclic musk and cadmium on glutathione and metallothionein in Eisenia foetida[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2011,6（4）：396-402.

[11]Petosa A R,Jaisi D P,Quevedo I R,et al.Aggregation and deposition of engineered nanomaterials in aquatic environments：Role of physicochemical interactions[J].Environmental Science&Technology,2010,44（17）：6532-6549.

[12]王江雪,李 煒,劉 穎,等.二氧化鈦納米材料的環(huán)境健康和生態(tài)毒理效應(yīng)[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào),2008,3（2）：105-113.WANG Jiang-xue,LI Wei,LIU Ying,et al.Environmental health and ecotoxicological effect of titanium dioxide nanomaterials[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2008,3（2）：105-113.

[13]Nel A,Xia T,M?dler L,et al.Toxic potential of materials at the nanolevel[J].Science,2006,311（5761）：622-627.

[14]Cherchi C,Gu A Z.Impact of titanium dioxide nanomaterials on nitrogen fixation rate and intracellular nitrogen storage in Anabaena variabilis[J].Environmental Science&Technology,2010,44（21）：8302-8307.

[15]Peller J R,Whitman R L,Griffith S,et al.TiO2as a photocatalyst for control of the aquatic invasive alga,Cladophora,under natural and artificial light[J].Journal of Photochemistry and Photobiology A：Chemistry,2007,186（2）：212-217.

[16]Linkous C A,Carter G J,Locuson D B,et al.Photocatalytic inhibition of algae growth using TiO2,WO3,and cocatalyst modifications[J].Environmental Science&Technology,2000,34（22）：4754-4758.

[17]Chen J Y,Dong X,Xin Y Y,et al.Effects of titanium dioxide nanoparticles on growth and some histological parameters of zebrafish（Danio rerio）after a long-term exposure[J].Aquatic Toxicology,2011,101（3）：493-499.

[18]盧 斌,柯才煥,王文雄.低濃度鎘、鋅暴露對白氏文昌魚的毒性累積及其幾種重要酶活性的影響[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）,2012,51（4）：767-773.LU Bin,KE Cai-huan,WANG Wen-xiong.Effect of sublethal Cd and Zn on selected enzymes and accumulation of amphioxus Branchiostoma belcheri[J].Journal of Xiamen University（Natural Science）,2012,51（4）：767-773.

[19]周啟星,孔繁翔,朱 琳.生態(tài)毒理學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社,2004.ZHOU Qi-xing,KONG Fan-xiang,ZHU Lin.Ecotoxicology[M].Beijing：Science Press,2004.

[20]Pérez E,Blasco J,Solé M.Biomarker responses to pollution in two invertebrate species：Scrobicularia plana and Nereis diversicolor from the Cádiz bay（SW Spain）[J].Marine Environmental Research,2004,58（2/3/4/5）：275-279.

[21]李 昕,王忠斌,張 燕,等.乙酰膽堿酯酶在有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥快速檢測中的應(yīng)用[J].食品研究與開發(fā),2007,28（3）：127-129.LI Xin,WANG Zhong-bin,ZHANG Yan,et al.The rapid detection of organophosphorus and carbamate pesticides by acetylcholinesterase（AChE）from Musca domestica[J].Food Research and Development,2007,28（3）：127-129.

[22]Lund S,Fulton P M H,Key B.The sensitivity of grass shrimp,Palaemonetes pugio,embryos to organophosphate pesticide induced acetylcholinesterase inhibition[J].Aquatic Toxicology,2000,48（2）：127-134.

[23]許翠玲,王改萍,胡勝水.有機(jī)磷農(nóng)藥生物電化學(xué)傳感器的研究進(jìn)展[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào),2002,18（6）：502-507.XU Cui-ling,WANG Gai-ping,HU Sheng-shui.The development of electrochemical biosensor of organophosphorus pesticides[J].Journal of Analytical Science,2002,18（6）：502-507.

[24]吳寶鈴,孫瑞平,楊德漸.中國近海沙蠶科研究[M].北京：海洋出版社,1981.WU Bao-ling,SUN Rui-ping,YANG De-jian.Chinese offshore Nereidae research[M].Beijing：Ocean Press,1981.

[25]Yuan X T,Chen A H,Zhou Y B,et al.The influence of cadmium on the antioxidant enzyme activities in polychaete Perinereis aibuhitensis Grube（Annelida：Polychaeta）[J].Chinese Journal of Oceanology and Limnology,2010,28（4）：849-855.

[26]Zhou Q,Rainbow B,Smith P.Tolerance and accumulation of the trace metals zinc,copper and cadmium in three populations of the polychaete Nereis diversicolor[J].Journal of the Marine Biological Association of the UK,2003,83（1）：65-72.

[27]Dallinger R,Rainbow P S.Ecotoxicology of metals in invertebrates[M].America：CRC Press,1993.

[28]Mouneyrac C,Mastain O,Amiard J C,et al.Trace-metal detoxification and tolerance of the estuarine worm Hediste diversicolor chronically exposed in their environment[J].Marine Biology,2003,143（4）：731-744.

[29]張倩茹,牟文燕,張靖宜,等.石油烴對沙蠶鎘生物富集特性及金屬硫蛋白誘導(dǎo)的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2014,25（9）：2683-2694.ZHANG Qian-ru,MU Wen-yan,ZHANG Jing-yi,et al.Influences of petroleum hydrocarbons on accumulation of cadmium and induction of metallothionein in the polychaete Perinereis aibuhitensis[J].Chinese Journal of Applied Ecology,2014,25（9）：2683-2694.

[30]Zhang Q R,Zhou Q X,Wang J,et al.Influences of Cu or Cd on the neurotoxicity induced by petroleum hydrocarbons in ragworm Perinereis aibuhitensis[J].Journal of Environmental Sciences,2008,20（3）：364-371.

[31]Ramaswami V,Subbram V.Effect of selected textile dye on the survival,morphology,and burrowing behavior of the earthworm Polypheretima elongate[J].Bulletin of Environmental Contamination＆ Toxicology,1992,48（2）：249-252.

[32]Rao J V,Kavitha P.Toxicity of azodrin on the morphology and acetylcholinesterase activity of earthworm Eisenia foetida[J].Environmental Research,2004,96（3）：323-327.

[33]劉樹文.多環(huán)麝香的分子結(jié)構(gòu)和香氣之間的關(guān)系[J].有機(jī)化學(xué),1981（6）：414-420.LIU Shu-wen.The relationship between molecular structure and odour of polycyclic musks[J].Chinese Journal of Organic Chemistry,1981（6）：414-420.

[34]李卓娜,周群芳,劉稷燕,等.多環(huán)麝香（PCMs）的環(huán)境行為及毒性效應(yīng)[J].化學(xué)進(jìn)展,2012,24（4）：606-615.LI Zhuo-na,ZHOU Qun-fang,LIU Ji-yan,et al.Environmental behavior and toxicological effects of polycyclic musks[J].Progress in Chemistry,2012,24（4）：606-615.

[35]Mouneyrac C,Mastain O,Amiard J,et al.Trace-metal detoxification and tolerance of the estuarine worm Hediste diversicolor chronically exposed in their environment[J].Marine Biology,2003,143（4）：731-744.

[36]van Hoof N A L M,Hassinen V H,Hakvoort H W J,et al.Enhanced copper tolerance in Silene vulgaris（Moench）Garcke populations from copper mines is associated with increased transcript levels of a 2b-type metallothionein gene[J].Plant Physiology,2001,126（4）：1519-1526.

[37]Wollenberger L,Breitholtz M,KuskK O,et al.Inhibition of larval development of the marine copepod Acartia tonsa by four synthetic musk substances[J].Science of the Total Environment,2003,305（1）：53-64.

[38]Luckenbach T,Epel D.Synthetic musk compounds：Luckenbach responds[J].Environmental health Perspectives,2005,113（12）：A803-A804.

[39]Morgan M,Fancey J,Kiceniuk L.Response and recovery of brain acetylcholinesterase activity in Atlantic salmon（Salmo salar）exposed to fenitrothion[J].Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences,1990,47（9）：1652-1654.

[40]馬 鐸,陳杖榴,曾振靈.恩諾沙星對土壤微生物群落功能多樣性的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2007,27（8）：3400-3406.MA Duo,CHEN Zhang-liu,ZENG Zhen-ling.Effects of enrofloxacin on functional diversity of soil microbial communities[J].Acta Ecologica Sinica,2007,27（8）：3400-3406.

[41]張玄可,梁 敏,程衛(wèi)東,等.Cd暴露對南方鲇氧化應(yīng)激及腦膽堿酯酶活性的影響[J].重慶師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）,2015,32（1）：42-45.ZHANG Xuan-ke,LIANG Min,CHENG Wei-dong,et al.Effects of cadmium exposure on oxidative stress and activity of acetylcholinesterase（AChE）in southern catfish（Silurus meridionalis Chen）[J].Journal of Chongqing Normal University（Natural Science）,2015,32（1）：42-45.

[42]王 艷,馬澤民,吳石金.3種PAEs對蚯蚓的毒性作用和組織酶活性影響的研究[J].環(huán)境科學(xué),2014,35（2）：770-779.WANG Yan,MA Ze-min,WU Shi-jin.Study on the effect of enzymatic activity and acute toxicity of three PAEs on Eisenia foetida[J].Environmental Science,2014,35（2）：770-779.

[43]Xie Y,Wang B B,Li F C,et al.Molecular mechanisms of reduced nerve toxicity by titanium dioxide nanoparticles in the phoxim-exposed brain of Bombyx mori[J].PLoS One,2014,9（6）：e101062.