磷脂脂肪酸生物標(biāo)記法分析養(yǎng)豬發(fā)酵床微生物群落結(jié)構(gòu)的空間分布

鄭雪芳，劉 波*，朱育菁，王階平，陳倩倩，魏云華

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福州 350003；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福州 350003）

我國(guó)是養(yǎng)豬大國(guó)，每年豬糞的產(chǎn)生量突破50億t，糞污已成為當(dāng)今社會(huì)三大污染源之一[1]。微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬是一種新型環(huán)保養(yǎng)豬模式，利用農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品如谷殼、秸桿、鋸糠、椰糠等制作發(fā)酵床墊料層，添加微生物菌劑，經(jīng)發(fā)酵鋪墊到豬舍，生豬生活在發(fā)酵床上，通過(guò)發(fā)酵床形成的有益微生物群落分解豬糞，消除惡臭，實(shí)現(xiàn)豬場(chǎng)的零排放[2－3]。

微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬的核心技術(shù)是利用其形成的有益功能微生物種群，長(zhǎng)期和持續(xù)穩(wěn)定地將豬糞尿進(jìn)行降解。因此，研究發(fā)酵床的微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)于揭示發(fā)酵床對(duì)豬糞尿的降解、轉(zhuǎn)化規(guī)律等具有重要意義[4－5]。趙國(guó)華等[6]研究發(fā)酵床養(yǎng)豬模式下不同使用年限微生物群落的變化，利用微生物分離結(jié)合16S rRNA分子生物學(xué)鑒定對(duì)發(fā)酵床微生物群落進(jìn)行分析；張學(xué)峰等[7]利用微生物分離結(jié)合16S rRNA研究了不同深度墊料對(duì)養(yǎng)豬土著微生物發(fā)酵床穩(wěn)定期微生物菌群的影響；李娟等[8]進(jìn)行了雞發(fā)酵床不同墊料理化性質(zhì)及微生物菌群變化規(guī)律研究。作者前期研究[9]中利用磷脂脂肪酸（Phospholipid Fatty Acid，PLFA）生物標(biāo)記分析了不同使用時(shí)間發(fā)酵床微生物群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，Yin等[10]采用傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)研究發(fā)酵床養(yǎng)豬模式下細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)。然而，目前關(guān)于發(fā)酵床微生物群落結(jié)構(gòu)的空間分布研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

微生物群落的研究通常采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法，但是許多功能微生物都處于存活不可培養(yǎng)狀態(tài)[11－13]。PLFA圖譜分析是近幾年來(lái)發(fā)展的研究微生物群落結(jié)構(gòu)的一種新方法，它可定量分析微生物群落的生物量和群落結(jié)構(gòu)[14－15]。本研究利用PLFA法研究大欄養(yǎng)豬發(fā)酵床微生物群落的空間分布特性，尋找出其變化規(guī)律，為微生物發(fā)酵床大欄養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)選址和飼養(yǎng)環(huán)境

實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)位于福清市漁溪現(xiàn)代設(shè)施農(nóng)業(yè)樣本工程示范基地的微生物發(fā)酵床大欄養(yǎng)豬舍，豬舍長(zhǎng)93 m、寬33 m，占地總面積為3069 m2，其中發(fā)酵床面積1617 m2，深度為75 cm，使用時(shí)間為1年，發(fā)酵床墊料由谷殼30%、椰糠70%構(gòu)成。豬舍裝配自動(dòng)喂料和飲水系統(tǒng)、微噴霧化空氣消毒系統(tǒng)、噴霧墊料加濕系統(tǒng)、環(huán)境（光、溫、濕、NH3、通風(fēng)）監(jiān)控系統(tǒng)。豬舍溫度控制在28～32℃，濕度控制在60%～70%。定期對(duì)墊料進(jìn)行翻堆（每周2～3次將表層墊料進(jìn)行翻耙，2個(gè)月深翻一次，每批豬出欄后，用新墊料替換表層腐熟程度高的墊料），豬只1500頭，為“杜×長(zhǎng)×大”三元雜交商品豬，采用大欄養(yǎng)殖模式，飼養(yǎng)密度為1頭·m－2，常規(guī)管理。

1.2 取樣方法

將整個(gè)發(fā)酵床劃分為5個(gè)不同的區(qū)域：A、B、C、D和E。每個(gè)區(qū)域再劃分為3個(gè)層次：表層（0～25 cm）、中間層（25～50 cm）、底層（50～75 cm）。A區(qū)靠近風(fēng)機(jī)，E區(qū)靠近水簾，B、C、D區(qū)為仔豬活動(dòng)和排便密集區(qū)域（圖1）。每個(gè)區(qū)域的每層取樣方法為五點(diǎn)取樣，每層的樣本充分混合后取出小樣（10 g），進(jìn)行PLEA測(cè)定，每個(gè)小樣設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3 PLFA分析方法

PLFA的提取方法參考文獻(xiàn)[16－17]并略作修改。具體操作如下：稱(chēng)取10 g樣本至50 mL離心管中，加入 20 mL 0.2 mol·L－1的 KOH 甲醇溶液，充分混勻，37℃水浴1 h（每10 min渦旋1次）；加入 3 mL 1.0 mol·L－1的醋酸溶液，充分搖勻；加入10 mL正已烷，充分搖勻，在 6000 r·min－1條件下離心 10 min；將上層溶液轉(zhuǎn)入干凈玻璃瓶中，在N2氣流下?lián)]發(fā)掉溶劑；加入1 mL體積比為1∶1的甲基叔丁基醚∶正已烷溶液，充分溶解，轉(zhuǎn)入GC小瓶，用于脂肪酸測(cè)定。

圖1 微生物發(fā)酵床樣本采集示意圖Figure 1 Schematic of sample collection in microbial fermentation bed

PLFA成分采用美國(guó)Agilent 6890N型氣相色譜儀測(cè)定。色譜柱 HP-ULTRA2（25 m×0.2 mm×0.33 μm），采用分流進(jìn)樣，分流比為100∶1，進(jìn)樣量為1 μL。二階程序升高柱溫：柱溫先以5℃·min-1由170℃升至260℃，再以40℃·min-1由260℃升溫至310℃，保持90 s。汽化室溫度為250℃，檢測(cè)器溫度為300℃，柱前壓10.00 psi（1 psi=6.895 kPa）。載氣（H2）流速為2 mL·min-1，尾吹氣（N2）流速為 30 mL·min-1。PLFA 的鑒定利用 SherlockMIS4.5 系統(tǒng)（MIDI，Newark，Delaware，美國(guó)）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

（1）PLFA生物標(biāo)記的識(shí)別：不同PLFA指示不同類(lèi)群的微生物，一些飽和或單不飽和脂肪酸代表細(xì)菌生物量，其中支鏈磷脂脂肪酸常見(jiàn)于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌（G+）如 i11：0、a12：0、i12：0 等[18]；環(huán)化脂肪酸和單烯不飽和脂肪酸在革蘭氏陰性細(xì)菌（G-）中占比高，如cy17：0、cy19：0 w8c、10：0 3OH 等[19-21]；18：1w9c、18：3w6，9，12等多烯脂肪酸為真核生物所獨(dú)有，其總和可指示真菌生物量[22]；指示放線菌脂肪酸的有10Me16：0、10Me17：0 和 10Me18：0[23]。

（2）微生物群落多樣性指數(shù)分析：引入群落生態(tài)學(xué)豐富度指數(shù)Shannon、多樣性指數(shù)Simpson和均勻度指數(shù)Pielou，分析發(fā)酵床不同空間墊料微生物群落的多樣性。按照計(jì)算物種指數(shù)方法[24]計(jì)算各指數(shù)值。

Shannon指數(shù)：H=-∑PilnPi

Simpson指數(shù)：C=1-∑（ni/N）2

Pielou指數(shù)：e=H/lnS

式中：S為群落中的脂肪酸總種類(lèi)數(shù)；Pi=ni/N；ni為i類(lèi)脂肪酸個(gè)數(shù)；N為該試驗(yàn)中總脂肪酸個(gè)數(shù)。

（3）聚類(lèi)分析采用DPS軟件，以供試樣品的PLFA為樣本，進(jìn)行單因子方差分析，構(gòu)建矩陣，以蘭氏距離為聚類(lèi)尺度，用類(lèi)平均法進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)，分析發(fā)酵床不同空間微生物種群動(dòng)態(tài)。

（4）采用DPS軟件中多元統(tǒng)計(jì)分析中的主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）方法，主要包括數(shù)據(jù)求協(xié)方差矩陣，計(jì)算特征方程中所有特征值，并根據(jù)特征值累積比例確定主成分的數(shù)量，計(jì)算主成分載荷值和主成分得分，進(jìn)行一級(jí)主成分評(píng)分等。主成分分析過(guò)程采用DPS軟件的相關(guān)模塊進(jìn)行處理，具體步驟參見(jiàn)文獻(xiàn)[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵床不同空間墊料微生物PLFA測(cè)定

微生物發(fā)酵床不同空間墊料共檢測(cè)到57個(gè)脂肪酸生物標(biāo)記，不同的生物標(biāo)記代表不同類(lèi)型的微生物（表 1）。脂肪酸生物標(biāo)記 15：0、17：0、a15：0、16：1 w9c、10Me18：0、18：1 w9c 和 20：1 w9c 在各樣本中均有分布，屬完全分布類(lèi)型，說(shuō)明這類(lèi)脂肪酸指示的微生物適應(yīng)性強(qiáng)，在各空間小生境均能生長(zhǎng)；10：0、11：0、20：4 w6，9，12，15c等其余50種脂肪酸生物標(biāo)記只在發(fā)酵床特定空間分布，為不完全分布，說(shuō)明大部分微生物只在特定環(huán)境下生長(zhǎng)；a12：0、i17：1 w10c、18：3 w6，9，12 和 20：1 w7c只在發(fā)酵床的 A 區(qū)分布，17：1 w6只在發(fā)酵床的B區(qū)分布，16：0 3OH只在發(fā)酵床的B區(qū)表層分布，15：0 3OH和16：0 2OH只在發(fā)酵床的E區(qū)表層分布。A區(qū)分布量最大的前3種PLFA為18：1 w9c、i17：1 w10c和 16：1 w9c；B 區(qū)和 D 區(qū)分布量最大的前 3 種 PLFA 為 16：0、18：1 w9c和 i15：0；C 區(qū)和 E區(qū)分布量最大的前 3種 PLFA 為 16：0、18：1 w9c和a15：0；A區(qū)PLFA種類(lèi)最少，其表層、中間層和底層分別為17、12種和16種，B區(qū)PLFA種類(lèi)最多，其表層、中間層和底層分別為45、45種和44種。

2.2 發(fā)酵床不同空間墊料微生物生物量特征

由表2可以看出，微生物發(fā)酵床不同空間墊料細(xì)菌、真菌、放線菌、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌和總PLFA含量差異顯著（P＜0.05）。D區(qū)表層最大，分布量分別為 994.24、286.83、33.65、357.75、69.38 nmol·g-1和 1 315.70 nmol·g-1，均顯著高于其他空間（P＜0.05）；這些特征微生物PLFA含量在各個(gè)區(qū)域表層（A區(qū)表層的G+、B區(qū)表層的真菌和放線菌含量除外）墊料分布量均高于中間層和底層；A區(qū)各層次墊料細(xì)菌、真菌、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和總PLFA含量均顯著低于其他區(qū)域（P＜0.05）；細(xì)菌、真菌和放線菌在各個(gè)空間墊料分布量均為細(xì)菌＞真菌＞放線菌。

表1 發(fā)酵床不同空間墊料PLFA生物標(biāo)記類(lèi)型及含量（3個(gè)重復(fù)數(shù)據(jù)的平均值）Table 1 Types and contents of PLFA biomarkers of litter system from microbial fermentation bed in different spatial（Mean）

續(xù)表1發(fā)酵床不同空間墊料PLFA生物標(biāo)記類(lèi)型及含量（3個(gè)重復(fù)數(shù)據(jù)的平均值）Continued table 1 Types and contents of PLFA biomarkers of litter system from microbial fermentation bed in different spatial（Mean）

由圖2可見(jiàn)，A區(qū)各層次真菌/細(xì)菌值極顯著高于其他區(qū)域（P＜0.01），而G+/G-值則極顯著低于其他區(qū)域（P＜0.01）。B、C、D、E 各區(qū)域和各層次之間的真菌/細(xì)菌值和G+/G-值無(wú)顯著差異。

2.3 發(fā)酵床不同空間微生物群落多樣性分析

如表3所示，發(fā)酵床不同空間墊料的Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)和Pielou指數(shù)均呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）。Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)最大值均出現(xiàn)在C區(qū)底層，分別是0.881 3和3.777 9，C區(qū)底層的Pielou指數(shù)較大，為0.709 9，僅次于A區(qū)中間層（0.759 8）和A區(qū)底層（0.751 1）。A區(qū)3個(gè)層次的Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)小于其他區(qū)域，Pielou指數(shù)大于其他區(qū)域，其中A區(qū)表層和中間層的Simpson指數(shù)最小，為0.821 4，A區(qū)中間層的Shannon指數(shù)最小，為2.723 7，A區(qū)中間層的Pielou指數(shù)最大，為0.759 8。

2.4 基于PLFA發(fā)酵床不同空間墊料群落結(jié)構(gòu)的聚類(lèi)分析

發(fā)酵床不同空間墊料聚類(lèi)結(jié)果如圖3所示。當(dāng)蘭氏距離為117.1時(shí)，可將不同空間墊料聚為兩個(gè)類(lèi)群，A區(qū)3個(gè)層次的墊料聚在一個(gè)類(lèi)群（類(lèi)群Ⅰ），其他區(qū)域各層次聚在另一類(lèi)群中（類(lèi)群Ⅱ）；當(dāng)蘭氏距離為23.4時(shí)，可將類(lèi)群Ⅱ細(xì)分為2個(gè)亞類(lèi)群，B區(qū)和D區(qū)在一個(gè)亞類(lèi)群，C區(qū)和E區(qū)聚在同一亞類(lèi)群中，相同區(qū)域不同層次樣本均在同一類(lèi)群中。由此可見(jiàn)，發(fā)酵床墊料PLFA分布與區(qū)域性關(guān)系更為密切。

表2 微生物發(fā)酵床不同空間墊料特征微生物PLFA含量（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，nmol·g-1）Tabel 2 Content of special microbial PLFA for microbial fermentation bed in different spatial（Mean±SD，nmol·g-1）

圖2 微生物發(fā)酵床不同空間墊料真菌/細(xì)菌和G+/G-值Figure 2 Fungi/bacteria and G+/G-for microbial fermentation bed in different spatial

表3 發(fā)酵床不同空間微生物群落多樣性指數(shù)（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Table 3 Microbial community diversity index of microbial fermentation bed in different spatial（Mean±SD）

2.5 基于PLFA發(fā)酵床不同空間墊料群落結(jié)構(gòu)的主成分分析

基于PLFA發(fā)酵床不同空間墊料經(jīng)主成分分析得出，主成分 1（PC1）貢獻(xiàn)率為 52.08%，主成分 2（PC2）貢獻(xiàn)率為72.26%，PC1和PC2基本能將發(fā)酵床不同空間墊料樣本區(qū)分出來(lái)（圖4）。A區(qū)3個(gè)不同層次墊料樣本歸在一類(lèi)群；D區(qū)和B區(qū)的3個(gè)不同層次墊料樣本歸在一類(lèi)群；C區(qū)和E區(qū)的3個(gè)不同層次墊料樣本歸在一類(lèi)群；A區(qū)的3個(gè)不同層次墊料微生物種群與PC1和PC2均呈負(fù)相關(guān)；E區(qū)3個(gè)不同層次墊料微生物種群與PC1和PC2均呈正相關(guān)；D區(qū)和B區(qū)的3個(gè)不同層次墊料微生物種群與PC1呈正相關(guān)，與PC2均呈負(fù)相關(guān)；C區(qū)墊料表層微生物與PC1和PC2呈正相關(guān)，中間層和底層與PC1呈負(fù)相關(guān)，與PC2均呈正相關(guān)。

3 討論

圖3 微生物發(fā)酵床群落結(jié)構(gòu)空間分布的聚類(lèi)分析Figure 3 Cluster analysis of microbial community for microbial fermentation bed in different spatial

微生物發(fā)酵床是通過(guò)基質(zhì)墊層微生物群落來(lái)完成對(duì)豬糞尿的降解[26]。然而，目前關(guān)于發(fā)酵床與微生物群落的密切相關(guān)性知之甚少。Bardgett等[27]認(rèn)為土壤中PLFA的組成可以表示土壤微生物群落的組成和結(jié)構(gòu)。Klamer等[28]和Stegera等[29]的研究指出，脂肪酸量的增減能很好地反映微生物種群的興衰。本研究利用PLFA生物標(biāo)記技術(shù)研究發(fā)酵床微生物群落空間分布特性，以期探明發(fā)酵床對(duì)豬糞的降解機(jī)理。發(fā)酵床不同空間墊料共檢測(cè)出C10～C20共57個(gè)脂肪酸生物標(biāo)記，表明發(fā)酵床存在豐富的微生物種類(lèi)，研究結(jié)果與劉波等[30]對(duì)發(fā)酵床宏基組分析結(jié)果相吻合。研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵床不同空間墊料PLFA的種類(lèi)和含量都不同，A區(qū)各層墊料檢測(cè)的PLFA種類(lèi)最少，B區(qū)各層墊料中PLFA種類(lèi)最多。D區(qū)表層墊料細(xì)菌、真菌、放線菌、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌和總PLFA含量明顯高于其他區(qū)域。此外，各個(gè)區(qū)域表層PLFA種類(lèi)和數(shù)量高于中間層和底層，說(shuō)明發(fā)酵床表層微生物種類(lèi)最多、分布數(shù)量最大，可能是因?yàn)椋孩俦韺又苯佑|新鮮豬糞尿，糞尿輸入提供營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)；②中間層和底層溫度高，可達(dá) 60～70 ℃[5，31－32]，高溫殺死了一部分微生物，從而導(dǎo)致中間層和底層微生物種類(lèi)和數(shù)量低于表層。張學(xué)峰等[7]研究表明，發(fā)酵床從30 cm至70 cm墊料中微生物數(shù)量依次降低，認(rèn)為其是不同深度墊料的溫度、含氧量、微生物分解原材料等綜合作用的結(jié)果。

G+細(xì)菌和G－細(xì)菌是生態(tài)系統(tǒng)中細(xì)菌的重要組成部分[33]。Meril?等[34]認(rèn)為G+細(xì)菌能夠適應(yīng)條件較差的環(huán)境，且在資源有限的情況下更擅長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)資源，而G－細(xì)菌的生存更依賴(lài)環(huán)境提供新鮮的有機(jī)物。Saetre等[35]同樣認(rèn)為較高比例的G+細(xì)菌是環(huán)境從富營(yíng)養(yǎng)到寡營(yíng)養(yǎng)的轉(zhuǎn)變。作者前期對(duì)不同使用時(shí)間墊料微生物群落結(jié)構(gòu)的研究中發(fā)現(xiàn)，使用時(shí)間為1個(gè)月的墊料，主要以G－細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)菌，形成的群落結(jié)構(gòu)為初始群落；使用時(shí)間為6個(gè)月墊料中G－和G+細(xì)菌含量相當(dāng)，為過(guò)渡型群落；而使用時(shí)間為24個(gè)月墊料則以G+細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)菌，為穩(wěn)定型群落[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，A區(qū)墊料的G+/G－小于1，G－細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)菌，為初始群落；而發(fā)酵床B、C、D、E區(qū)墊料的G+/G－大于1，說(shuō)明這些區(qū)域G+細(xì)菌分布量大于G－細(xì)菌，發(fā)酵床已形成穩(wěn)定的群落結(jié)構(gòu)，此外也預(yù)示著這些區(qū)域墊料的營(yíng)養(yǎng)條件下降，可以考慮補(bǔ)充新鮮的墊料。

圖4 微生物發(fā)酵床群落結(jié)構(gòu)空間分布的主成分分析Figure 4 PCA analysis of microbial community for microbial fermentation bed in different spatial

多樣性指數(shù)對(duì)于評(píng)價(jià)微生物群落多樣性是非常有效的方法，高的多樣性指數(shù)代表高的微生物群落多樣性[36]。Simpson指數(shù)反映群落中常見(jiàn)物種數(shù)量[37]，Shannon指數(shù)反映群落中物種的豐富度[38]，Pielou指數(shù)反映群落中各物種分布的均勻度[39]。本研究顯示，Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)和Pielou指數(shù)在發(fā)酵床不同區(qū)域，甚至同一區(qū)域不同層次均存在顯著差異，表明隨著發(fā)酵床微生態(tài)系統(tǒng)的確立，不同空間區(qū)域小環(huán)境不同會(huì)造成微生物群落結(jié)構(gòu)的空間異質(zhì)性，如一些微生物種類(lèi)適應(yīng)在墊料表層環(huán)境生存，而另一些微生物種類(lèi)則能適應(yīng)或忍耐墊料深層次高溫環(huán)境而存在于這個(gè)生態(tài)系統(tǒng)中。發(fā)酵床A區(qū)的Pielou指數(shù)大于其他區(qū)域，而Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)小于其他區(qū)域，說(shuō)明該區(qū)域墊料中微生物種類(lèi)少、分布量低，但分布均勻，與PLFA測(cè)定結(jié)果相吻合，即A區(qū)PLFA種類(lèi)最少，其表層、中間層和底層分別為17、12種和16種，遠(yuǎn)低于其他區(qū)域（一般超過(guò)40種）。

微生物組成及群落結(jié)構(gòu)與外界環(huán)境（溫度、濕度、通風(fēng)性等）密切相關(guān)，是環(huán)境變化的早期響應(yīng)指標(biāo)[40]。本研究為大欄養(yǎng)豬，發(fā)酵床面積大，每個(gè)區(qū)域面積約為325 m2，由于通風(fēng)和水簾等設(shè)備分布位置不同，造成不同區(qū)域局部小氣候差異，從而形成不同群落結(jié)構(gòu)。聚類(lèi)分析和主成分分析均顯示發(fā)酵床A區(qū)3個(gè)層次墊料樣本單獨(dú)歸一類(lèi)群，B區(qū)和D區(qū)樣本劃分為一類(lèi)，C區(qū)和E區(qū)樣本歸為另一類(lèi)群中，說(shuō)明B區(qū)和D區(qū)墊料形成相似微生物群落結(jié)構(gòu)，而C區(qū)和E區(qū)的微生物群落結(jié)構(gòu)相似。A區(qū)墊料與B、C、D、E區(qū)形成不同的微生物群落，這可能是因?yàn)锳區(qū)靠近風(fēng)機(jī)，風(fēng)力大，基質(zhì)墊料較干燥，影響發(fā)酵床的發(fā)酵進(jìn)程，該區(qū)域微生物種類(lèi)和數(shù)量均明顯低于其他區(qū)域。B、C、D區(qū)為中間區(qū)域，通風(fēng)和濕度最適宜，為仔豬集中活動(dòng)和排便的主要場(chǎng)所，發(fā)酵床發(fā)酵速度快，形成微生物種類(lèi)多、數(shù)量大，因此，這些區(qū)域基質(zhì)墊料熟化快，要注意新墊料的添加。當(dāng)然，發(fā)酵床的微生物發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的生物化學(xué)過(guò)程，而此過(guò)程是通過(guò)基質(zhì)墊層微生物群落的演替來(lái)完成的，在該過(guò)程中，每一個(gè)微生物群落在一定的時(shí)間有適合自身生長(zhǎng)繁殖的條件，對(duì)某一種或某一類(lèi)特定物質(zhì)的降解起作用[26]，在后續(xù)研究中，還需結(jié)合其他技術(shù)如宏基因組技術(shù)對(duì)發(fā)酵床的不同使用時(shí)間、不同空間、不同材質(zhì)墊料的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步的研究，以期為發(fā)酵床科學(xué)管理和利用提供更完整的依據(jù)。

4 結(jié)論

大欄養(yǎng)豬發(fā)酵床微生物群落結(jié)構(gòu)在不同區(qū)域和層次均存在明顯差異：（1）細(xì)菌、真菌、放線菌、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌和總PLFA含量在各個(gè)區(qū)域表層分布量高于中間層和底層，D區(qū)表層分布量最大；A區(qū)各層次真菌/細(xì)菌值顯著高于其他區(qū)域，而G+/G-值則顯著低于其他區(qū)域；（2）不同區(qū)域和層次的墊料Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)和Pielou指數(shù)值均呈現(xiàn)顯著差異；（3）A區(qū)墊料形成的微生物群落結(jié)構(gòu)不同于其他區(qū)域，B區(qū)和D區(qū)墊料的微生物群落結(jié)構(gòu)相似，C區(qū)和E區(qū)墊料的微生物群落結(jié)構(gòu)相似。

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