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    阪崎克羅諾桿菌單克隆抗體的制備及特性分析

    2022-12-24 08:49:18張傳印蔣蔚劉鵬選王權(quán)葉方鈺謝雨芮韓先干陳偉
    關(guān)鍵詞:克羅諾單克隆效價(jià)

    張傳印,蔣蔚,劉鵬選,王權(quán) ,葉方鈺,謝雨芮,韓先干,陳偉*

    (1塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆 阿拉爾 843300)

    (2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所,上海 200241)

    食源性致病菌污染是影響食品安全的重要因素,據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查,由食品污染引起的食物中毒高達(dá)85%[1]。阪崎克羅諾桿菌(Cronobacter sakazakii,CS)是常見(jiàn)的一種食源性致病菌,該菌為革蘭陰性菌,周生鞭毛、無(wú)芽胞,自身免疫力低下的人群如嬰幼兒、老人及受過(guò)免疫損傷的成年人易感[2]。CS感染人體后能引起嚴(yán)重的腦膜炎、敗血癥、壞死性結(jié)腸炎等[3],甚至?xí)纬赡[瘤,影響神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育[4]。該菌主要分布于嬰幼兒食品及沖調(diào)食品中[5],但王小龍等[6]的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)從谷物、藕粉、芝麻糊中能檢測(cè)出CS,在面粉、香料、掛面、蔬菜、燕麥中也能檢測(cè)出CS[7]。在某些CS感染患者的尿液、腦脊液、胃腸道[8]均能檢出此菌,這表明此菌帶來(lái)的危害嚴(yán)重,亟需加大防控力度。

    CS為克羅諾桿菌屬,該屬含7個(gè)種,其余6個(gè)種分別為莫氏克羅諾桿菌、廣泛克羅諾桿菌、蘇黎世克羅諾桿菌、都柏林克羅諾桿菌、丙二酸克羅諾桿菌、康迪蒙提克羅諾桿菌[9],其中丙二酸克羅諾桿菌和阪崎克羅諾桿菌是臨床株[10],這意味著致病的克羅諾菌株大多數(shù)為丙二酸克羅諾桿菌和阪崎克羅諾桿菌。關(guān)于廣泛克羅諾桿菌及蘇黎世克羅諾桿菌報(bào)道很少,其余3種菌株為環(huán)境共生菌故臨床意義不大[11-12]。目前對(duì)CS的檢測(cè)方法有微生物學(xué)檢測(cè)法、分子學(xué)檢測(cè)法、免疫學(xué)檢測(cè)法等。傳統(tǒng)微生物檢測(cè)法主要包括DFI法[13]、三管法[14];分子生物學(xué)檢測(cè)主要包括PCR、熒光定量PCR、LAMP環(huán)等溫?cái)U(kuò)增;免疫學(xué)檢測(cè)法主要包括膠體金免疫層析檢測(cè)、酶聯(lián)免疫檢測(cè)、間接免疫熒光檢測(cè)、免疫磁珠富集技術(shù)等。傳統(tǒng)微生物檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣,分子生物學(xué)檢測(cè)花費(fèi)大、樣品前處理時(shí)間長(zhǎng),而免疫學(xué)檢測(cè)靈敏度高、耗時(shí)短、特異性強(qiáng)且操作簡(jiǎn)便。單克隆抗體技術(shù)是一種重要的免疫學(xué)技術(shù),可廣泛應(yīng)用于抗原的鑒定[15],此技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)以CS為免疫原制備抗CS單克隆抗體,可為該菌的防控提供基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    1.1.1 試驗(yàn)菌株、細(xì)胞和動(dòng)物

    阪崎克羅諾桿菌(ATCC21550、ATCC21561、ATCC21552、CMCC1.6765)、莫氏克羅諾桿菌CICC23943、蘇黎世克羅諾桿菌CICC24178、都柏林克羅諾桿菌CICC21564、廣泛克羅諾桿菌CICC21570、丙二酸克羅諾桿菌CICC21551、單增李斯特菌CICC21635、鼠傷寒沙門菌CMCC10248、副溶血弧菌、大腸桿菌O157∶H7、肺炎克雷伯菌、蠟樣芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、普通變形桿菌、骨髓瘤細(xì)胞均由上海獸醫(yī)研究所C301實(shí)驗(yàn)室保存;BALB/c及KM小鼠購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

    1.1.2 試驗(yàn)試劑

    弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、PEG 6 000購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;DMEM購(gòu)自Gibco公司,南美特級(jí)胎牛血清及TSB肉湯購(gòu)自上海秋爽生物科技有限公司;青鏈霉素混合液及L-谷氨酰胺購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;次黃嘌呤(Hypoxanthine)、氨基喋呤(Aminopterin)、胸腺嘧啶核苷(Thymeidine)購(gòu)自上海Sigma公司;細(xì)胞培養(yǎng)板及酶標(biāo)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司;亞型鑒定試劑盒購(gòu)自Southern Biotech公司。

    1.1.3 試驗(yàn)引物

    根據(jù)參考文獻(xiàn)[16]-[19]中已報(bào)道的CS特異性鑒定引物,篩選出4對(duì)并由北京擎科生物科技上海分公司合成,其序列見(jiàn)表1。

    表1 4對(duì)特異性引物序列

    1.1.4 主要儀器

    倒置顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Carl Zeiss公司;乳化儀購(gòu)自Amalgamator公司;臺(tái)式低溫離心機(jī)購(gòu)自Thermo Fisher科技有限公司;電子分析天平購(gòu)自美國(guó)Mettler Toledo公司;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司;多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Biotek公司。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 阪崎克羅諾桿菌的復(fù)蘇、純化、鑒定

    將4株CS(ATCC21550、ATCC21561、ATCC21552、CMCC1.6765)轉(zhuǎn)接于TSB肉湯,37℃恒溫?fù)u床(200 r/min)增菌18 h。增菌完成后,將菌液用劃線法接種于TSA平板上,37℃恒溫箱培養(yǎng)18~24 h,以增菌→劃線接種的方式純化5代。第5代菌落增菌至OD600=1時(shí),平板計(jì)數(shù)法[20]計(jì)此狀態(tài)活菌數(shù)。將上述4株CS各取1 mL菌液,提取基因組后PCR鑒定并測(cè)序。

    1.2.2 抗原制備及免疫動(dòng)物

    把增菌至OD600=1的4株菌的菌液(ATCC21550、ATCC21561、ATCC21552、CMCC1.6765)各 加 入0.3%甲醛滅活后等比例混勻,用無(wú)菌1×PBS洗脫甲醛5次(12 000 r/min,3 min),然后用0.9%NaCl生理鹽水將菌液濃度調(diào)整為1×1010CFU/mL。

    將制備的200 μL免疫原(滅活細(xì)菌量為2×109CFU)與200 μL弗氏完全佐劑混勻后乳化,免疫小鼠足墊;2周后第2次免疫,免疫量為1×109CFU,選用弗氏不完全佐劑乳化,免疫小鼠背部皮下;第3~5次免疫與第2次免疫一致,共免疫3只BALB/c小鼠。

    1.2.3 間接ELISA法測(cè)定血清效價(jià)

    對(duì)免疫后7 d小鼠采集血清,將血清二倍比稀釋至128 000倍,利用間接ELISA法測(cè)定血清效價(jià)。步驟:把濃度為2×109CFU/mL菌懸液37℃包被4 h或4℃包被12 h;用1%明膠37℃封閉2 h;加入100 μL稀釋后的血清37℃孵育1.5 h或4℃孵育12 h;加入100 μL 10 000倍稀釋的羊抗鼠IgG,37 ℃孵育1 h;加入100 μL底物顯色液37 ℃反應(yīng)15 min,加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng);多功能酶標(biāo)儀讀取OD450值,陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)為P/N≥2.1且OD450>1。

    1.2.4 細(xì)胞融合

    選取血清效價(jià)最高的小鼠,取脾臟細(xì)胞與均一、明亮、圓潤(rùn)、長(zhǎng)勢(shì)快的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。步驟:將骨髓瘤細(xì)胞和脾臟懸液轉(zhuǎn)移至融合管內(nèi)離心(1 000 r/min,8 min),棄掉上清;取1 mL融合劑PEG于45 s內(nèi)均勻加入融合管內(nèi),反應(yīng)90 s;細(xì)胞融合終止:30 s內(nèi)均勻加入1 mL DMEM;30 s內(nèi)均勻加入2 mL DMEM;2 min內(nèi)快速加入10 mL DMEM。靜置后離心(1 000 r/min,10 min),用 10 mL 20%FBS DMEM(1%HAT)重懸,取1滴混于24 mL 20%FBS DMEM(1%HAT)中,滴入預(yù)先鋪布飼養(yǎng)層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,于第3~5 d觀察。

    1.2.5 細(xì)胞株篩選及亞克隆

    細(xì)胞株篩選步驟與血清效價(jià)測(cè)定步驟一致。陽(yáng)性瘤細(xì)胞株亞克隆步驟:把陽(yáng)性瘤細(xì)胞懸液二倍稀釋8~10梯度,靜置5~10 min,計(jì)細(xì)胞數(shù);選擇計(jì)數(shù)結(jié)果為100~150的細(xì)胞懸液混于10 mL 20%FBS DMEM(1%HAT)中,均勻鋪布至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中;剩余細(xì)胞懸液保留,備用。

    1.2.6 單克隆抗體腹水制備

    對(duì)同批健康BALB/c小鼠腹腔連續(xù)注射2次0.5 mg滅菌石蠟油,間隔為1周。第3周對(duì)每只小鼠腹腔注射1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞,采用體內(nèi)誘生法[21]誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生腹水。小鼠腹水的處理:腹水常溫靜置2~4 h或4℃靜置過(guò)夜后離心(1 000 r/min,30 min),抽取中層腹水,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.7 單克隆抗體效價(jià)測(cè)定

    梯度稀釋單克隆抗體,結(jié)合間接ELISA測(cè)定抗體效價(jià),步驟同血清效價(jià)測(cè)定。

    1.2.8 抗體特異性測(cè)定

    將單增李斯特菌、鼠傷寒沙門菌、副溶血弧菌、蠟樣芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、大腸桿菌O157∶H7、肺炎克雷伯菌、普通變形桿菌、蘇黎世克羅諾桿菌、丙二酸克羅諾桿菌、莫氏克羅諾桿菌、廣泛克羅諾桿菌、都柏林克羅諾桿菌作為ELISA包被原,將抗CS單克隆抗體稀釋至1∶20 000,測(cè)其與上述菌株的交叉反應(yīng),步驟同血清效價(jià)測(cè)定。

    1.2.9 抗體亞型測(cè)定

    根據(jù)SBA Clonotyping System-HRP抗體亞型鑒定試劑盒說(shuō)明書步驟,利用ELISA測(cè)定抗體亞型。抗體稀釋液為5%FBS PBST,亞型試劑稀釋液為1%BSA PBST。

    1.2.10 抗原表位測(cè)定

    包被及封閉完成后,用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記2H2抗體,加50 μL酶標(biāo)抗體(1∶500)及50 μL 不同梯度稀釋的9D10抗體,對(duì)照孔加入100 μL 2H2酶標(biāo)抗體(1∶1 000),37 ℃孵育2 h;加入100 μL底物顯色液 37 ℃反應(yīng) 15 min,用50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng);多功能酶標(biāo)儀讀取OD450值。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

    將純化后的4株CS增菌至OD600=1時(shí),其3組平行菌落計(jì)數(shù)結(jié)果如圖1所示,計(jì)數(shù)結(jié)果均為2×109CFU/mL。

    圖1 菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

    2.2 鑒定結(jié)果

    4對(duì)CS特異性引物擴(kuò)增片段分別為149 bp、282 bp、469 bp、952 bp,PCR鑒定后條帶大小均正確,將產(chǎn)物純化后測(cè)序,比對(duì)測(cè)序結(jié)果表明4株菌株均為CS,PCR鑒定結(jié)果如圖2所示。

    圖2 CS特異性引物鑒定結(jié)果

    2.3 免疫血清效價(jià)

    采集3只小鼠經(jīng)5次免疫后7 d的血清,把血清梯度稀釋后,利用間接ELISA測(cè)其血清效價(jià),結(jié)果如表2所示,3只小鼠血清效價(jià)均可達(dá)32 000。

    表2 5次免疫后3只小鼠血清效價(jià)

    2.4 亞克隆及篩選

    如圖3所示,細(xì)胞融合后5 d細(xì)胞團(tuán)內(nèi)細(xì)胞圓潤(rùn)、均一,細(xì)胞團(tuán)大小適中,呈葡萄串狀。選擇此狀態(tài)下的培養(yǎng)基上清用間接ELISA測(cè)定其效價(jià)并且對(duì)陽(yáng)性孔換新培養(yǎng)基3 d后復(fù)檢,復(fù)檢陽(yáng)性孔進(jìn)行亞克隆。本試驗(yàn)共計(jì)4次亞克隆,第1次亞克隆陽(yáng)性率為37.5%;第2次亞克隆陽(yáng)性率為48.9%;第3次亞克隆陽(yáng)性率為72.9%;第4次亞克隆陽(yáng)性率93.8%,經(jīng)4次克隆成功篩選出2株抗體效價(jià)高且特異性好的細(xì)胞株,根據(jù)融合板坐標(biāo),分別命名為2H2、9D10。

    圖3 細(xì)胞融合后5 d瘤細(xì)胞團(tuán)

    2.5 單克隆抗體腹水效價(jià)

    取1 μL單克隆抗體腹水將其梯度稀釋,利用間接ELISA測(cè)定OD450值,P/N≥2.1且OD450>1判定為陽(yáng)性,圖4中a圖與b圖N值分別為0.083和0.082。如圖4所示,2H2抗體腹水效價(jià)為6 000 000;9D10抗體腹水效價(jià)為2 000 000。

    圖4 2株單克隆抗體腹水效價(jià)

    2.6 單克隆抗體特異性試驗(yàn)

    如圖5所示,稀釋20 000倍的2株抗體與單增李斯特菌、鼠傷寒沙門菌、副溶血弧菌、蠟樣芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、大腸桿菌O157∶H7、肺炎克雷伯菌、普通變形桿菌、蘇黎世克羅諾桿菌、丙二酸克羅諾桿菌、莫氏克羅諾桿菌、廣泛克羅諾桿菌、都柏林克羅諾桿菌均無(wú)交叉反應(yīng),阪崎克羅諾桿菌為陽(yáng)性對(duì)照,由此表明9D10抗體和2H2抗體特異性良好。

    圖5 2株單克隆抗體特異性

    2.7 亞型鑒定結(jié)果

    單克隆抗體共計(jì)有6種重鏈亞型,分別為IgA、IgM、IgG2a、IgG1、IgG3、IgG2b;有2種輕鏈亞型,分別為 Lambda、Kappa。經(jīng) SBA Clonotyping System-HRP抗體亞型試劑盒鑒定,2H2抗體及9D10抗體重鏈均為IgG2a,2株抗體輕鏈均為Kappa,如表3所示。

    表3 2株單克隆抗體亞型測(cè)定結(jié)果

    2.8 單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)

    競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)果如圖6所示,未經(jīng)HRP標(biāo)記的9D10抗體加入后,與對(duì)照組OD450值差異不顯著,表明9D10抗體與2H2抗體針對(duì)CS不同抗原表位。

    圖6 2株單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)果

    3 討論

    CS引起的疾病發(fā)病率不算很高,但致死率極高[22]。該菌是食源性致病菌檢測(cè)的重點(diǎn),免疫學(xué)方法是檢測(cè)該菌的方式之一[5]。單克隆抗體技術(shù)是免疫學(xué)工作中經(jīng)常采用的一種技術(shù)[15],此技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。在單抗制備中免疫程序起著重要的作用,一般采用8~12周齡BALB/c小鼠免疫。免疫原制備選用甲醛滅活,制作成顆粒性抗原,這是由于顆粒性抗原比可溶性抗原有更好的免疫原性,從而讓小鼠有更好的免疫效果。選擇4種CS等量混合免疫,避免因個(gè)別菌種差異導(dǎo)致單克隆抗體針對(duì)的抗原表位差異太大,以保證抗CS單克隆抗體的均一。因初步融合細(xì)胞較為脆弱,需要提取KM小鼠腹腔內(nèi)的細(xì)胞鋪布融合細(xì)胞飼養(yǎng)層。陽(yáng)性細(xì)胞株需要進(jìn)一步克隆時(shí)應(yīng)趁早,避免細(xì)胞團(tuán)塊太多造成無(wú)效克隆。另外因?yàn)榧?xì)胞的生長(zhǎng)較為苛刻,所以應(yīng)及時(shí)關(guān)注細(xì)胞狀態(tài),避免因?yàn)橹饔^原因(CO2不足、H2O不足、溫度變化)而造成細(xì)胞狀態(tài)不好甚至死亡。

    本研究制備的2株抗體,采用的是P/N≥2.1且OD450>1雙重判斷標(biāo)準(zhǔn),9D10抗體和2H2抗體效價(jià)分別為2×106和6×106。其他文獻(xiàn)報(bào)道的研究中抗CS單克隆抗體效價(jià)分別為 50 000[23]、100 000[5]、200 000[24],相比而言,本試驗(yàn)制備的單抗腹水效價(jià)相對(duì)較高。特異性試驗(yàn)表明,9D10與2H2單抗對(duì)常見(jiàn)的其他食源性致病菌如大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、沙門菌等均無(wú)交叉反應(yīng)。克羅諾桿菌屬7個(gè)種之間同源性較高,相互之間容易產(chǎn)生抗原交叉[25-26],而本試驗(yàn)制備的2株抗體與克羅諾菌屬其他菌種均無(wú)交叉反應(yīng),這說(shuō)明2株抗體種屬間特異性較好,可以用于克羅諾桿菌屬中CS的鑒別診斷。亞型鑒定結(jié)果表明,本試驗(yàn)2株抗體的重鏈均為IgG2a,輕鏈均為Kappa,其他文獻(xiàn)報(bào)道的研究中抗CS單克隆抗體重鏈也多為IgG型,輕鏈多為Kappa型[23-24,27-28]。Ig主要在機(jī)體免疫中起保護(hù)作用,大多數(shù)抗菌、抗病毒產(chǎn)生的抗體類型,多數(shù)為IgG型抗體,IgG是唯一能通過(guò)胎盤的免疫球蛋白,在嬰兒期能夠起到很好的防御作用,還有中和細(xì)菌、毒素,結(jié)合微生物促成吞噬作用,激活補(bǔ)體等作用[15]。因此,本研究獲得的2株單抗將來(lái)可用于CS的治療研究。此外,可以利用單抗捕獲細(xì)菌,如楊柳等[29]利用磁珠耦連抗CS單克隆抗體,富集環(huán)境中存在的CS,也可以利用單抗建立檢測(cè)方法,如向雙林等[5]以2株抗CS單克隆抗體分別作為捕捉抗體和檢測(cè)抗體,建立雙抗夾心ELISA方法,檢測(cè)限度可達(dá)103CFU·mL-1。本研究利用HRP對(duì)抗體標(biāo)記,通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定2株抗體抗原表位競(jìng)爭(zhēng)性,結(jié)果表明這2株抗體針對(duì)CS不同的抗原表位,可為將來(lái)建立檢測(cè)CS的免疫學(xué)檢測(cè)方法提供基礎(chǔ),如雙抗夾心ELISA法。

    4 結(jié)論

    綜上,本研究成功制備出2株抗CS單克隆抗體9D10抗體和2H2抗體,效價(jià)均超過(guò)一百萬(wàn),2株抗體效價(jià)分別為2×106、6×106;2株抗體的特異性均較好,不僅與常見(jiàn)的食源性細(xì)菌,如大腸桿菌、單增李斯特菌、沙門菌等無(wú)交叉反應(yīng),與CS同屬的5種其他菌,如蘇黎世克羅諾桿菌、丙二酸克羅諾桿菌等也均無(wú)交叉反應(yīng);2株抗體的重鏈均為IgG2a,輕鏈均為Kappa;2株抗體針對(duì)CS不同的抗原表位??笴S單抗的成功制備,為后續(xù)針對(duì)CS的檢測(cè)與治療技術(shù)研究打下了很好的基礎(chǔ)。

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