黃熱病現(xiàn)狀及其疫苗的研究與應(yīng)用

周嘉煒，王嘉琪，丁洋，朱少帥，馮俞琪，任浩

1.海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 200433；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)海軍醫(yī)學(xué)系生物醫(yī)學(xué)防護(hù)教研室，上海 200433

黃熱病(yellow fever, YF)是由黃熱病毒(yellow fever virus, YFV)引起的，經(jīng)帶毒伊蚊叮咬傳播的急性病毒性傳染病。該病分布范圍廣，傳播迅速，病死率較高，危害全球民眾健康，被列為國(guó)際檢疫的傳染病之一[1]。YFV屬于黃病毒科黃病毒屬的成員，為單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約11 kb，含有一個(gè)開(kāi)放閱讀框架(open reading frame, ORF)；5′端和3′端各有1個(gè)非翻譯區(qū)，從5′端至3′端依次編碼衣殼蛋白(C蛋白)、膜蛋白(M蛋白)和包膜蛋白(E蛋白)3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5共7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒復(fù)制周期發(fā)揮著重要作用[2]。

近年來(lái)，全球YF發(fā)病率略有上升趨勢(shì)。對(duì)于我國(guó)而言，亞熱帶溫?zé)釢駶?rùn)的環(huán)境易滋生蚊蟲(chóng)，人群對(duì)于YF普遍缺乏免疫力，一旦出現(xiàn)輸入病例，如遇到合適的季節(jié)和媒介，便存在YF傳播的風(fēng)險(xiǎn)[3]。由于YF尚無(wú)特異性的治療方法，主要采取對(duì)癥治療以及支持治療，接種YF疫苗是目前最有效的防控措施。因此，本文就YF全球疫情進(jìn)展、臨床表現(xiàn)，重點(diǎn)對(duì)YF疫苗的研制及應(yīng)用等研究進(jìn)行了綜述。

1 黃熱病傳播及全球疫情概述

根據(jù)傳播方式的不同，YF可分為叢林型和城市型。叢林型為“猴-非洲伊蚊或趨血蚊屬等-猴”的傳播，自然疫源通常在叢林中，人類受影響較小，偶爾進(jìn)入疫源地可能導(dǎo)致感染；城市型為“人-埃及伊蚊-人”之間的傳播，患者或者隱性感染者是感染源和擴(kuò)大宿主，伊蚊是主要傳播媒介，一旦暴發(fā)影響范圍較廣。

YFV起源于非洲。在奴隸貿(mào)易時(shí)代，由黑人奴隸從非洲西部地區(qū)帶到歐美地區(qū)，美洲大陸潮濕溫和的氣候，使得YFV在此形成了長(zhǎng)久穩(wěn)定的“森林循環(huán)”，1648年在尤卡坦半島發(fā)生了歷史記載的第一次YF疫情[4-5]，此后歷史上又發(fā)生了幾次大規(guī)模的暴發(fā)，但多局限于非洲和南美洲的熱帶地區(qū)[6]。自2000年，YF仍然陸續(xù)在非洲大陸各國(guó)肆虐，其中塞內(nèi)加爾共和國(guó)、加納共和國(guó)是受影響最大的兩個(gè)國(guó)家，其發(fā)病率分別為5.9%和10%[7]。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2013年嚴(yán)重的黃熱病感染病例約有8.4萬(wàn)～17萬(wàn)例，死亡病例達(dá)到了2.9萬(wàn)～6萬(wàn)例。自20世紀(jì)90年代以來(lái)，每年YF重癥病例平均高達(dá)20萬(wàn)例，病例主要集中在非洲大陸[8]。

目前，YF在非洲形成了一條“黃熱病區(qū)帶”，該區(qū)域內(nèi)多是一些未接種疫苗或疫苗接種率低的國(guó)家和地區(qū)，包括尼日利亞聯(lián)邦共和國(guó)、安哥拉共和國(guó)、肯尼亞共和國(guó)等[9]。最近一次大規(guī)模暴發(fā)是在2016年，主要集中在非洲西南部國(guó)家安哥拉共和國(guó)，該次疫情為城市型YF，疫情持續(xù)了1年，至2016年12月23日，安哥拉共和國(guó)宣布疫情結(jié)束，共報(bào)告了4 188例疑似病例[10]。同時(shí)，此輪疫情在全球快速播散，亞洲、歐洲和美洲都有輸入性病例的報(bào)道，我國(guó)亦報(bào)道了11例YF輸入病例[11-12]。最近兩年，非洲YF疫情時(shí)有反復(fù)。2020年，塞內(nèi)加爾共和國(guó)暴發(fā)了小范圍的國(guó)內(nèi)疫情，累計(jì)報(bào)告7例，死亡2例。通過(guò)基因組分析顯示，此次YFV序列與兩年前一名被確診為YF的荷蘭旅行者的病毒序列一致，表明旅游是引起YF跨國(guó)傳播的重要因素之一[13]。WHO在2013年發(fā)布了《關(guān)于黃熱病疫苗和預(yù)防接種意見(jiàn)書(shū)》，2017年繼續(xù)發(fā)布了《關(guān)于接種小劑量黃熱病疫苗的補(bǔ)充意見(jiàn)書(shū)》，建議前往YF流行區(qū)的國(guó)際旅行者接種黃熱病疫苗[14-17]。即便如此，仍有諸多旅行者忽略WHO的警告而發(fā)生嚴(yán)重感染，因此如果疫苗接種不能最大范圍推廣，尤其是前往疫情國(guó)家的人不重視疫苗的接種，YF傳播蔓延極有可能持續(xù)下去，并且隨著感染的旅客將病毒帶至世界各地，疫情的防控將會(huì)更加嚴(yán)峻復(fù)雜[18]。

2 黃熱病臨床表現(xiàn)

YF臨床表現(xiàn)為高熱、黃疸、出血等，潛伏期短(大都為3～6天)，并發(fā)癥多[19]。典型病例臨床過(guò)程可分為感染期、緩解期、中毒期和恢復(fù)期4期。感染期常見(jiàn)癥狀包括突發(fā)高熱、頭痛、黃疸、肌肉疼痛、疲勞、食欲不振、惡心嘔吐等；大多數(shù)情況下，3～4天后癥狀消失，此時(shí)稱為緩解期；約有15%的患者會(huì)出現(xiàn)急性出血熱、肝腎受損、嚴(yán)重的黃疸等癥狀，進(jìn)入中毒期(肝腎損害期)，甚至在7～10天內(nèi)死亡；恢復(fù)期持續(xù)2～4周，表現(xiàn)為體溫下降至正常水平，癥狀消失，各器官功能逐步恢復(fù)，但疲勞感仍會(huì)持續(xù)數(shù)周，黃疸和轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)值升高可持續(xù)數(shù)月[20]。

目前，尚無(wú)針對(duì)YF的特效治療，最有效、最廣泛應(yīng)用的預(yù)防手段是疫苗接種。YF-17D減毒活疫苗的問(wèn)世，給全世界特別是非洲西部地區(qū)、南美洲地區(qū)的人民帶去了福音，有效地控制了YFV的感染風(fēng)險(xiǎn)，降低了死亡率。雖然接種YF-17D疫苗被認(rèn)為是最有效的預(yù)防措施，但是疫苗后接種所致的不良反應(yīng)仍時(shí)有報(bào)道。同時(shí)，由于疫苗接種顯著降低了發(fā)病率，非洲大陸放松了防控意識(shí)，從而導(dǎo)致YFV的感染率隨之上升[21]。

3 黃熱病疫苗研制與保護(hù)效果評(píng)價(jià)

3.1 FNV疫苗

1930年，法國(guó)科學(xué)家們將一種從YFV實(shí)驗(yàn)小鼠腦組織中提取的親內(nèi)臟性病毒(French viscerotropic virus, FVV)，經(jīng)鼠腦傳代128代后，制備了嗜神經(jīng)性疫苗(French neurotropic vaccine, FNV)，該疫苗在非洲的喀麥隆共和國(guó)、剛果民主共和國(guó)、加蓬共和國(guó)大規(guī)模應(yīng)用，顯著降低了當(dāng)?shù)氐腨F發(fā)病率。然而，由于接種后一系列嚴(yán)重的并發(fā)癥如小兒腦炎等，F(xiàn)NV于1982年被停止使用[22-23]。

3.2 YF-17D疫苗

1927年，Adrian Stokes首次利用恒河猴模型，從加納共和國(guó)一位YF患者血液標(biāo)本中分離出YFV原型株，即Asibi株，為YFV疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。目前廣泛使用的YF-17D黃熱病減毒活疫苗，是Max Theiler及其同事利用小鼠和雞胚將YFV Asibi株進(jìn)行減毒而獲得的[24]。研究人員將YFV皮下注射到恒河猴體內(nèi)，同時(shí)將病毒注射入恒河猴大腦觀察其所致腦炎的情況。其研究結(jié)果表明，病毒在恒河猴體內(nèi)傳代至89～114代時(shí)，喪失了引起恒河猴致命腦炎的能力；將第114代病毒在雞胚中傳代培養(yǎng)，并將114～176代病毒注射入小鼠大腦，其病毒嗜神經(jīng)性低于89～114代。據(jù)此，研究人員推測(cè)當(dāng)病毒在雞胚中傳代至200代后，可以進(jìn)行人體接種。為了證實(shí)該推測(cè)，開(kāi)展了如下醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中，對(duì)8只猴子分別接種216代和217代病毒，其中7 只產(chǎn)生了中和抗體(4只可以抵抗FNV攻毒，2只表現(xiàn)為腦炎，1只死亡)；另外一組分別接種了第215代病毒和227代病毒，數(shù)據(jù)表明第227代病毒接種后產(chǎn)生的抗體滴度明顯高于第215代，免疫效果較好[25]。在此基礎(chǔ)上，研究人員招募志愿者進(jìn)行人體免疫接種實(shí)驗(yàn)。有YF自然感染和疫苗接種史的4名志愿者接種了227代病毒，抗體應(yīng)答均顯著提高，除皮下接種部位有些許反應(yīng)外無(wú)其他明顯不適；8名無(wú)YFV免疫力的志愿者接種了227和229代病毒，5名表現(xiàn)出輕微的發(fā)熱(最高37.4 ℃)并伴有輕微頭痛和背痛，免疫后2周，6人檢測(cè)到不同水平的抗體應(yīng)答[25]。該研究為后續(xù)YF疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

YF-17D減毒活疫苗最終于20世紀(jì)30年代研制成功，是目前唯一在使用的YF疫苗，全球累計(jì)接種超5億例次[26]。YF-17D可以激活接種部位的抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)，進(jìn)而激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，單次疫苗注射后，99%的易感人群在30天內(nèi)可獲得近乎終生有效的免疫保護(hù)[27]。YF-17D疫苗有17D-204、17D-213和17DD 3個(gè)亞系，代表了原始17D疫苗的不同傳代[28]，這3種亞系品種均被證實(shí)安全有效，我國(guó)使用的是17D-204疫苗[29-30]。

盡管YF-17D多年來(lái)被廣泛用于YF的預(yù)防，其安全性和有效性已被全世界廣泛證實(shí)，但是接種后不良反應(yīng)事件(adverse event following immunization, AEFI)仍時(shí)有報(bào)道。有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，YF-17D接種后嚴(yán)重的不良反應(yīng)事件(AEFI related to yellow fever virus, AEFI-YFV)發(fā)生率在YF流行區(qū)為0～2.1例/10萬(wàn)劑次，非流行區(qū)為0.09～0.4例/10萬(wàn)劑次[31]。疫苗相關(guān)嗜神經(jīng)疾病(vaccine-associated neurotropic disease, YEL-AND)和疫苗相關(guān)嗜內(nèi)臟疾病(vaccine-associated viscerotropic disease, YEL-AVD)是常見(jiàn)的2類嚴(yán)重不良事件。YF-AND被稱為“接種后腦炎”，常見(jiàn)于嬰幼兒，發(fā)生率低，約百萬(wàn)分之四，致死率低于5%；而YEL-AVD具有“泛系統(tǒng)化”的特點(diǎn)，在各內(nèi)臟器官有較高的病毒滴度，雖然發(fā)生率不高(約百萬(wàn)分之三)，但致死率可達(dá)60%[32]。除YF疫苗接種后存在不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)外，全球YF疫苗供應(yīng)分配不均、疫苗質(zhì)量等問(wèn)題，也導(dǎo)致感染人數(shù)局部上升。

4 YF-17D疫苗保護(hù)機(jī)制及應(yīng)用

疫苗接種可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生牢固的體液免疫和細(xì)胞免疫，YF-17D可以激活接種部位的APC，進(jìn)而激發(fā)機(jī)體的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。人單次注射YF-17D疫苗后，2周左右體內(nèi)中和抗體可達(dá)到最高水平，99%的易感人群在30天內(nèi)可獲得近乎終生有效的免疫保護(hù)[33]。病毒特異性CD4+T和CD8+T細(xì)胞分別在接種后第10天、15天達(dá)到高峰，其中CD8+T細(xì)胞受病毒載量的影響較大[34-35]。在17D-204株疫苗的刺激下，CD4+T細(xì)胞可釋放γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)和白介素-2(interleukin-2, IL-2)，在抑制病毒復(fù)制的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[36]。

YF-17D的保護(hù)機(jī)制尚未被完全闡釋清楚。由于正常小鼠皮下注射感染wtYFV時(shí)受I型干擾素反應(yīng)的嚴(yán)重影響[37]，Watson等[38]利用 C57BL/6 IFN AR-/-(AB6)小鼠模型研究了17D-204疫苗的保護(hù)機(jī)制，該小鼠缺乏I型干擾素受體，17D-204疫苗株可在皮下接種部位復(fù)制和傳播，可模擬人類疫苗接種。以上研究結(jié)果表明，17D-204接種不僅可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高濃度的中和抗體，而且誘導(dǎo)了17D-204特異性CD4+T和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。免疫后21天，對(duì)免疫小鼠進(jìn)行wtYFV(Ang71，1971年安哥拉FV分離株)攻毒，所有小鼠均未發(fā)病，100%存活，即使一年后再攻毒仍能發(fā)揮免疫保護(hù)作用。為了明確中和抗體、CD4+T和CD8+T細(xì)胞在其中發(fā)揮的作用，研究人員分離了免疫小鼠第21天的血清、CD4+T和CD8+T細(xì)胞，并分別或聯(lián)合過(guò)繼轉(zhuǎn)移至AB6小鼠，檢測(cè)其抗Ang71攻毒能力，發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞單獨(dú)或聯(lián)合CD8+T細(xì)胞使用的存活小鼠占比分別為5/8和4/8，僅使用CD8+T細(xì)胞的存活小鼠占比為0/8。單獨(dú)使用17D-204免疫血清也不能完全保護(hù)小鼠抵抗Ang71，只有血清聯(lián)合CD4+T和CD8+T細(xì)胞時(shí)才能完全保護(hù)小鼠[38]。由于17D-204 CD8+T細(xì)胞不能起到保護(hù)作用，因此，研究者認(rèn)為CD4+T細(xì)胞能夠部分保護(hù)wtYFV的攻擊，而CD8+T細(xì)胞則不能，17D-204特異性血清聯(lián)合CD4+T能夠提供免疫保護(hù)作用[38]。Cong等[36]研究也表明，在17D株疫苗的刺激下，CD4+T細(xì)胞可釋放γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)和白介素-2(interleukin-2, IL-2)，從而在清除病毒的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。YF-17D具有表達(dá)水平高、重組概率低，只在宿主細(xì)胞的胞質(zhì)中復(fù)制，不整合入宿主基因組中的特點(diǎn)，也被用于其他病原體疫苗的研發(fā)。全球首個(gè)登革熱預(yù)防疫苗Dengvaxia就是以YF-17D為骨架，將其prME基因替換為登革病毒prME基因，接種后有效降低了登革熱病死率和感染嚴(yán)重登革熱的風(fēng)險(xiǎn)[39]。此外，采用相同的策略，構(gòu)建的JEV-YF17-D嵌合疫苗(IMOJEV)也已獲批使用，ZIKV-YF17-D和WNV-YF-17D的嵌合疫苗也在研究當(dāng)中[40]。

2019年12月至今，新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疫情肆虐，研究人員嘗試將YF-17D應(yīng)用到冠狀病毒疫苗研發(fā)，將SARS-CoV-2、MERS-CoV的刺突S蛋白抗原區(qū)域替換YF-17D病毒表面的prM和E蛋白，構(gòu)建了新的重組疫苗。研究表明，以YF-17D作為載體構(gòu)建的MERS-CoV和SARS-CoV-2刺突蛋白在小鼠體內(nèi)具有免疫原性，并可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗體[41-42]。因此，將YF-17D作為重組載體進(jìn)行疫苗研發(fā)也為當(dāng)下新冠肺炎的防治提供了思路。

應(yīng)當(dāng)注意的是，重組YF-17D也存在下述缺點(diǎn)：①外源基因插入YF-17D基因組可干擾病毒和細(xì)胞蛋白的相互作用，影響RNA的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和病毒顆粒的形成，導(dǎo)致重組病毒的遺傳不穩(wěn)定性和低免疫原性；②YF-17D復(fù)制時(shí)缺乏校對(duì)功能，基因變異度高，有可能改變其細(xì)胞嗜性，增加神經(jīng)毒性的潛在風(fēng)險(xiǎn)等[43]。因此，增加重組病毒的遺傳穩(wěn)定性、對(duì)YF-17D的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行改建，擴(kuò)充其容量以插入更多的外源基因，同時(shí)有效阻遏不同基因間的干擾是未來(lái)的研究方向。

5 YF新型候選疫苗的研究

由于YFV-17D是源自雞胚培養(yǎng)的減毒活疫苗，不適用于周歲內(nèi)嬰兒、老人、孕婦、哺乳期女性、雞蛋過(guò)敏人群，以及免疫抑制人群如艾滋病患者等，因此仍有必要研發(fā)更加安全有效的新型YF疫苗[44-45]。當(dāng)前，新型YF疫苗研究主要包括病毒樣顆粒(virus-like particles, VLP)、單輪感染性顆粒(single-round infectious particles, SRIP)和BinJ/YFV-prME嵌合疫苗[46-48]。

VLP是將目標(biāo)病毒結(jié)構(gòu)基因嵌入異源性病毒載體獲得的，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，能夠借助載體系統(tǒng)裝配形成病毒樣顆粒。VLP具有高度免疫原性，但由于缺乏非結(jié)構(gòu)蛋白和感染性核酸，不具有傳染性，也無(wú)法恢復(fù)為傳染性形式，與活疫苗、減毒活疫苗相比，其是一種更穩(wěn)定、更安全的替代品，而且該技術(shù)比較成熟，曾用于登革病毒(dengue virus，DENV)、寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)、日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)及西尼羅病毒(West Nile virus，WNV)等疫苗的研發(fā)[49]。SRIP是通過(guò)構(gòu)建包含靶標(biāo)病毒基因組序列缺陷型復(fù)制子并轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得的，由于缺失結(jié)構(gòu)蛋白，不能包裝成病毒顆粒，僅產(chǎn)生單輪感染，其功能類似于減毒活疫苗，但能避免減毒活疫苗的毒力返祖現(xiàn)象，且與VLP、亞單位或核酸疫苗相比，SRIP免疫原性更強(qiáng)，是潛在有效的YF疫苗，具有極大的開(kāi)發(fā)價(jià)值[48]。

Binjari病毒(BinJV)是一種昆蟲(chóng)特異性黃病毒，其prME基因可以被其他黃病毒的prME基因所替代，并具有良好的耐受性[50-51]。Yan等[52]建立了一種基于BinJV的黃病毒疫苗研究平臺(tái)。利用此平臺(tái)，研究者將BinJV的prME基因替換為YFV 17D-204的prME基因，制備了YF嵌合疫苗(BinJ/YFV-prME)，該嵌合體保留了在C6/36蚊子細(xì)胞中復(fù)制的能力，但不能在脊椎動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制。BinJ/YFV-prME聯(lián)合佐劑腹腔注射成年雌性IFN AR-/-小鼠[52]，并于第4周進(jìn)行加強(qiáng)，第10周可以檢測(cè)到免疫中和抗體。15周時(shí)將YFV-17D經(jīng)腹腔注射入實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明免疫后的小鼠體內(nèi)能檢測(cè)到較高滴度的中和抗體，且能夠有效抵抗YFV-17D的攻擊[52-53]。由此可見(jiàn)，BinJV為YF疫苗研制開(kāi)辟了一條新的途徑。

6 小結(jié)

WHO于2017年制定了“消除黃熱病流行(Eliminating Yellow Fever Epidemics，EYE)”戰(zhàn)略[54]。根據(jù)這一戰(zhàn)略，在全球疫苗和免疫聯(lián)盟、聯(lián)合國(guó)兒童基金會(huì)等50多個(gè)合作伙伴的支持下，非洲27個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)國(guó)家的近10億人預(yù)計(jì)到2026年將獲得黃熱病疫苗接種。為盡快實(shí)現(xiàn)這一戰(zhàn)略目標(biāo)，須各國(guó)遵循國(guó)際防疫條例，政府提供強(qiáng)有力的保障，人民積極響應(yīng)號(hào)召，任重而道遠(yuǎn)。

COVID-19來(lái)勢(shì)洶洶，給全球帶來(lái)了不可挽回的損失，但也證明隨著科研經(jīng)費(fèi)的投入、研究人員的聚集，世界各國(guó)已經(jīng)成功搭建了多種新型疫苗研發(fā)平臺(tái)，或許其中的一個(gè)或幾個(gè)平臺(tái)可用于新型YF疫苗的研制[55]。YF-17D疫苗作為一種具有重大歷史意義的疫苗，為人類戰(zhàn)勝YFV奠定了基礎(chǔ)。在新型YF疫苗問(wèn)世前，YF-17D的新生產(chǎn)模式、基于17D的嵌合疫苗研發(fā)等都是需要探索的領(lǐng)域[55]。同時(shí)，也須針對(duì)疫苗使用過(guò)程中的一些不足進(jìn)行優(yōu)化，并不斷擴(kuò)大疫苗的接種率，以進(jìn)一步推動(dòng)人類消除YF流行的戰(zhàn)略規(guī)劃。