基于TaqMan探針多重實時熒光PCR的腸道特殊菌群絕對定量方法的建立

王虹，施美芳，楊浩，鄔永琳，肖振明，譙鵬，屈一帆，榮星喻，趙超,3

1.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教育部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點實驗室，上海 200032；2.上海市寶山區(qū)友誼社區(qū)街道衛(wèi)生服務(wù)中心檢驗科，上海 201999；3.國家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院)，上海 200040

腸道是與外界接觸的最大器官之一，寄居其中的腸道菌群易受到外界環(huán)境的影響[1]。研究證明，內(nèi)外環(huán)境變化引起的腸道菌群失調(diào)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[2-4]。腸道微生態(tài)紊亂最直觀的改變是腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變，表現(xiàn)為整體細菌數(shù)量或部分菌屬豐度的改變，因此對腸道菌群中關(guān)鍵或重要組成菌群進行精確定量，對于了解疾病機理具有重要的意義。

已有文獻證實，腸道菌群中的優(yōu)勢菌群與人體健康有著密切的聯(lián)系[5]。腸球菌屬作為哺乳動物正常腸道菌群的重要組成部分，具有較強的生存競爭能力以及對多種抗生素的內(nèi)在抗性，因此也被認為是引起院內(nèi)和社區(qū)感染的主要原因之一[6-7]。近期發(fā)表在Nature雜志的研究指出，糞腸球菌的異常擴張可導(dǎo)致非酒精性脂肪肝[8]。而健康人群腸道內(nèi)的另一優(yōu)勢菌屬是雙歧桿菌屬，其被證明與腸道黏膜免疫激活、腸道蠕動以及酸堿度的穩(wěn)定維持有關(guān)，其含量是評估腸道健康的重要指標[9]。另一共生于腸道中的優(yōu)勢菌科為腸桿菌科，其中許多菌種是導(dǎo)致人類感染的重要病原菌和機會致病菌，不同種的腸桿菌科細菌可轉(zhuǎn)移耐藥基因，導(dǎo)致高度耐藥的碳青霉烯耐藥腸桿菌(carbapenem-resistantEnterobacteriaceae, CRE)的產(chǎn)生[10]。吳仲文等[11]提出，糞便中雙歧桿菌與腸桿菌的數(shù)量比值(B/E值)可以作為腸道微生物定植抗力指標，評估腸道菌群的健康程度并預(yù)測感染疾病發(fā)生的風險。因此，針對重要菌群腸球菌屬、雙歧桿菌屬、腸桿菌科以及腸道總菌群建立快速準確的定量方法，可以實現(xiàn)對菌群健康及穩(wěn)定程度的快速評估，并建立針對疾病早期的無創(chuàng)輔助診斷方法體系。

迄今針對腸道菌群進行絕對定量的技術(shù)十分有限。由于腸道中細菌數(shù)量龐大、種類繁雜，且80%以上都不具有分離培養(yǎng)的技術(shù)，傳統(tǒng)的細菌計數(shù)方法并不適用于腸道菌群定量[12]。變性梯度凝膠電泳和熒光原位雜交在一定程度上實現(xiàn)了對部分細菌的絕對定量，但因其較高的樣本處理要求和較低的靈敏度，在腸道微生物組定量分析中應(yīng)用有限[13]。高通量測序技術(shù)能夠在多個層面上更精確地研究菌群結(jié)構(gòu)，其中16S rDNA擴增子測序的檢測范圍幾乎可覆蓋腸道中所有菌屬，但只能實現(xiàn)定性和相對豐度的檢測。宏基因組測序?qū)崿F(xiàn)了種水平的精確定量，但受限于較高的起始模板量和較長的檢測周期[14]，并不適用于常規(guī)臨床檢測。目前，標準化定量菌群的方法主要基于SYBR Green或Pico Green染料法的實時定量PCR(qPCR)來實現(xiàn)，但由于染料與DNA雙鏈分子的結(jié)合是非特異性的，因此無法在單個反應(yīng)體系同時檢測多個目的基因[15]。TaqMan探針多重qPCR可以在同一反應(yīng)體系內(nèi)完成對多種目標基因的檢測，在病毒譜快速診斷中已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用[16-18]，并已用于臨床實踐，但尚未應(yīng)用于腸道共生菌的定量。因此，本研究建立對腸道菌群重要菌屬的TaqMan探針多重實時熒光定量PCR法，期望對測序結(jié)果驗證、菌群特征譜的臨床應(yīng)用推廣以及前瞻性菌群相關(guān)研究等發(fā)揮積極作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株長雙歧桿菌GDMCC 1.1575購于廣東省科學(xué)院微生物研究所；大腸桿菌DH5α購于日本Takara公司；糞腸球菌菌株分離自健康人糞便，經(jīng)16S rDNA測序及同源性比對后確認。

1.1.2 培養(yǎng)基BBL液體培養(yǎng)基(雙歧桿菌液體培養(yǎng)基)、雙歧桿菌瓊脂、腸球菌液體培養(yǎng)基購于青島海博生物有限公司；LB(Luria-Bertani，溶菌肉湯)培養(yǎng)基(胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉)購于上海生工生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 試劑細菌基因組提取試劑盒Axygen AxyPrep bacteria gDNA kit購于美國CORNING 公司；糞便菌群總DNA提取試劑盒DNeasy PowerSoil kit購于德國QIAGEN公司；質(zhì)粒小提試劑盒TIANPrep mini plasmid kit購于北京天根生化科技有限公司；膠回收試劑盒Thermo Scientific GeneJET Gel Extraction kit購于美國ThermoFisher公司；pET-28a(+)質(zhì)粒、限制性內(nèi)切酶Ncol及XhoI、去磷酸化酶rSAP均購于美國NEB公司；T4克隆連接試劑盒、GoTaq? qPCR Probe Master Mix均購于美國Promega公司。

1.1.4 引物和探針合成引物和探針序列由深圳華大基因科技公司合成并標記。引物和探針合成采用固相亞磷酰胺三酯法，將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成，由待合成引物的3′端向5′端合成延伸，相鄰的核苷酸通過3′→5′磷酸二酯鍵連接，在探針的5′端和3′端分別標記報告熒光基團和淬滅熒光基團，最后使用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)對引物和探針進行純化。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養(yǎng)長雙歧桿菌GDMCC 1.1575凍干粉用無菌水溶解稀釋后，均勻涂布在雙歧桿菌瓊脂平板上，待長出單菌落后，挑取單菌落于BBL液體培養(yǎng)基中。腸球菌使用腸球菌液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，二者均在37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h。大腸桿菌DH5α使用LB液體培養(yǎng)基，200 r/min 37 ℃ 恒溫搖床培養(yǎng)12 h。

1.2.2 細菌基因組DNA的提取取1～5 mL增菌培養(yǎng)后的長雙歧桿菌、腸球菌以及大腸桿菌菌液，低速離心(3 000 g, 3 min)去除培養(yǎng)基沉淀后采取高速離心(12 000 g, 3 min)獲得菌體。配制裂解緩沖液(20 mmol/L Tris, pH 8.0；2 mol/L EDTA；1.2% Triton；20 mg/mL溶菌酶)對長雙歧桿菌、腸球菌37 ℃溫浴，消化細胞壁制備原生質(zhì)球。按照AxyPrep bacteria gDNA kit說明，使用離心法提取細菌基因組DNA，并使用Nanodrop-1000紫外分光光度計測定DNA的濃度和純度。

1.2.3 糞便總菌群基因組DNA的提取在糞便標本中加入磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline, PBS)緩沖液，并在震蕩混勻器上以最大速度(3 200 r/min)震蕩10 min，對其進行均質(zhì)化處理后，使用QIAGEN DNeasy PowerSoil 試劑盒，按照說明提取糞便總菌群基因組DNA，并使用Nanodrop1000紫外分光光度計測定DNA的濃度和純度。

1.2.4 引物和探針設(shè)計通過NCBI(National Center for Biotechnology Information，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)公布的腸球菌屬、雙歧桿菌屬細菌的16S rDNA, 使用Snapgene對其進行比對，針對菌屬特異性的保守序列設(shè)計引物和探針。通過檢索國內(nèi)外的相關(guān)文獻[19-20]，參考腸桿菌科特異性檢測引物，并根據(jù)Primer Blast結(jié)果設(shè)計探針。對所有引物和探針進行優(yōu)化，使所有引物退火溫度接近，且不形成引物二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)，經(jīng)Primer-Blast/Nucleotide-Blast驗證，確保該引物和探針可以最大限度檢測所有可檢索到16S rRNA基因序列的目標菌屬/科的目標序列。根據(jù)Thermo Fisher Quant Studio 5熒光定量PCR儀檢測通道，標記探針熒光基團。

1.2.5 引物和探針特異性驗證以探針序列及其互補鏈引物序列，合成探針特異性驗證引物。以腸球菌為例，探針特異性引物命名為“Enterococcus-p”，序列為5′-TGGTTCTCTCCGAAATAGCTTTA-GGGCTA-3′ 及5′-CAGTGCTCTACCTCCATCA-TT-3′。以細菌基因組DNA及糞便總菌群基因組DNA為模板進行PCR擴增，擴增條件如表1所示，并進行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖濃度為2%，電泳條件為110 V恒壓20 min。

表1 PCR反應(yīng)程序

1.2.6 標準品制備首先，進行目的片段擴增，為保證后續(xù)重組質(zhì)粒的順利構(gòu)建，另設(shè)計黏性末端引物。以腸球菌為例，對原引物進行改造，添加限制性內(nèi)切酶NcoI和XhoI酶切位點和保護堿基，以獲得黏性末端引物，序列如下：F: 5’-CCCTCGA-GGGATGCTGGTGTGGAAGAGA-3’(XhoI)；R: 5’-TACCATGGTGCTCGCGTCCACTATCC-AGT-3’(NcoI)。PCR擴增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠中，110 V恒壓電泳20 min。在紫外凝膠成像儀下，使用干凈的手術(shù)刀片將含有DNA片段的凝膠切成薄片，盡可能切近DNA，以減少凝膠體積。此過程應(yīng)盡可能迅速，避免紫外線長時間照射損壞DNA。使用Thermo Scientific GeneJET Gel Extraction試劑盒，按操作說明回收目的片段，并測定其濃度和純度。由于目的片段較小(<500 bp)，凝膠溶解后加入同等體積的異丙醇以沉淀DNA，并減少多糖對后續(xù)步驟的影響。

然后，進行重組質(zhì)粒的構(gòu)建。使用限制性內(nèi)切酶NcoI及XhoI、去磷酸化酶rSAP對Pet-28a(+)載體進行消化，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及膠回收后，使用T4克隆連接試劑盒與目的片段連接，4 ℃過夜。將連接完成的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，經(jīng)卡那霉素以及藍白斑篩選后，挑取白色單菌落接種于5 mL卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫搖床震蕩培養(yǎng)16 h。使用TIANGEN TIAN Prep mini plasmid試劑盒提取質(zhì)粒，作為模板進行PCR擴增驗證及測序鑒定，擴增條件如表2所示。

表2 PCR反應(yīng)程序

最后，制備標準品。將成功構(gòu)建的陽性載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞，200 r/min 37 ℃恒溫搖床培養(yǎng)12 h并抽提質(zhì)粒，測定產(chǎn)物濃度并轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù)(copies/μL)，計算公式如下。

C=c×10-9×NA/MW

其中：C為拷貝數(shù)，單位為copies/μL；c為質(zhì)量濃度，單位為ng/μL；NA為阿伏伽德羅常數(shù)，取 6.02×1023copies/mol；MW為摩爾質(zhì)量，單位為g/mol。

將質(zhì)粒模板進行10倍比稀釋，凍存于-20 ℃待用。

1.2.7 反應(yīng)條件的優(yōu)化按GoTaq? Probe qPCR Master Mix的說明進行TaqMan探針實時定量PCR，分別用不同的引物終濃度(100 nmol/L、150 nmol/L、200 nmol/L、250 nmol/L、300 nmol/L、350 nmol/L、400 nmol/L)、探針終濃度(50 nmol/L、75 nmol/L、100 nmol/L、125 nmol/L、150 nmol/L、175 nmol/L、200 nmol/L)和循環(huán)數(shù)(30、35、40)對反應(yīng)體系進行優(yōu)化。

1.2.8 標準曲線和回歸方程的建立以濃度為1～1012copies/μL的標準品作為陽性模板，以nuclease-free H2O作為陰性對照，按照優(yōu)化好的反應(yīng)條件組合進行TaqMan探針實時定量PCR，一式3份。繪制lgC-Ct標準曲線，并獲得相應(yīng)的回歸方程。

1.2.9 重復(fù)性實驗選擇104copies/μL、105copies/μL、106copies/μL的標準模板進行重復(fù)性實驗，一式3份。每隔3 d重復(fù)1次實驗。計算組內(nèi)重復(fù)和組間重復(fù)變異系數(shù) CV，公式如下。

CV= SD/MN×100%

其中，SD為標準差，MN為平均值。

1.2.10 臨床樣本的檢測為評估本方法是否適用于臨床檢測，隨機取不同年齡段健康人群糞便標本各12例，包括青年人(44歲以下)、中年人(45～59歲)、普通老年人(60～79歲)、高齡老年人(80歲及以上)。志愿者來自上海市寶山區(qū)友誼街道社區(qū)、寧波某體檢機構(gòu)和復(fù)旦大學(xué)等，經(jīng)血液生化檢查、尿檢和糞檢等常規(guī)體檢項目篩查，未患有基礎(chǔ)代謝障礙、免疫缺陷以及慢性消耗性疾病，且近3個月內(nèi)無任何抗生素使用史。

提取糞便標本總菌群基因組DNA用以檢測，取濃度為1～1012copies/μL的標準品用于標準曲線繪制，以雙歧桿菌、腸球菌和大腸桿菌混菌液提取的gDNA為陽性模板，以nuclease-free H2O作為陰性對照，按照優(yōu)化的反應(yīng)條件組合，進行TaqMan探針多重實時定量PCR，并以回歸方程為參考，獲得各目標菌屬/科及總腸道菌群的含量，以探討本方法在臨床實際標本中的應(yīng)用效果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphpad Prism(version 8.4.0)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。多組比較使用ordinary one way ANOVA 檢驗。ns代表P>0.05，表明差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義；*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001，表明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 引物和探針特異性

設(shè)計引物和探針序列如表3所示。Primer Blast以及Nucleotide Blast結(jié)果顯示，引物和探針能夠與其對應(yīng)菌屬/科的16S rRNA基因序列相結(jié)合(見圖1)。PCR和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，引物和探針驗證引物的擴增產(chǎn)物均顯示為單一、明亮的條帶，大小與預(yù)期片段大小一致，無非特異性條帶產(chǎn)生(見圖2)，證明設(shè)計的引物和探針具有良好的特異性。

Each primer and probe verification primer can amplify the product as a single, and bright bands with the same size are as expected.1.Bifidobacterium; 2.Bifidobacterium-probe; 3.16S; 4.16S-probe; 5.Enterococcus; 6.Enterococcus-probe; 7.Enterobacteriaceae; 8.Enterobacteriaceae-probe.

表3 引物和探針序列

Binding sites of primers and probes on template DNA of total gut microbiota(top)and Enterobacteriaceae(bottom).

2.2 qPCR標準品獲取及反應(yīng)體系優(yōu)化

以重組質(zhì)粒為模板進行PCR擴增驗證，結(jié)果顯示條帶大小與目的片段大小一致，經(jīng)測序，結(jié)果與所需片段同源性一致，表示成功構(gòu)建陽性質(zhì)粒，最終獲得濃度梯度為1～1012copies/μL的標準模板。

使用不同的引物濃度、探針濃度和循環(huán)數(shù)進行TaqMan探針多重實時熒光定量PCR，當循環(huán)數(shù)為40且在表4所示的最優(yōu)反應(yīng)濃度條件下，各引物擴增效率趨于一致且熒光強度最大。確定各目標細菌的檢測限為：雙歧桿菌46 copies/μL、腸球菌 37 copies/μL、腸桿菌 51 copies/μL、總菌群 7.5×102copies/μL。

表4 反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果

2.3 標準曲線建立及重復(fù)性實驗

如表5所示，起始模板量在一定范圍內(nèi)時，拷貝數(shù)對數(shù)值(lgC)與Ct值具有線性關(guān)系，標準曲線擬合度良好，R2值在0.995以上(見圖3)。

表5 回歸方程及相關(guān)信息

The linearity of different bacterial standard curves was high with coefficient of determination(R2≥0.995).

組間重復(fù)和組內(nèi)重復(fù)實驗結(jié)果顯示，各變異系數(shù)均在1.32%以下，表示本方法具有較高的可重復(fù)性，結(jié)果可信(見表6)。

表6 重復(fù)性實驗結(jié)果

2.4 臨床標本檢測

在健康增齡人群中，運用建立的TaqMan探針法檢測的腸道菌群總量在各組間無顯著差異。腸球菌和腸桿菌含量隨增齡呈增長趨勢，且老年組顯著高于青年組(腸球菌,P=0.017；腸桿菌,P=0.017)，在高齡老年人未發(fā)現(xiàn)腸球菌數(shù)量增加。雙歧桿菌含量隨增齡減少，且各組間具有顯著性差異(青年組和準老年組，P=0.033；青年組和老年組，P<0.000 1；準老年組和老年組，P=0.008 2；老年組和高齡老年組，P<0.000 1；青年組和高齡老年組，P=0.991)，在高齡老年人中也未觀察到雙歧桿菌含量顯著減少(見圖4)。

Using the regression equation of each target bacteria as a reference, the total intestinal flora of each group and the content of Enterococcus, Bifidobacterium, and Enterobacteriaceae were calculated based on the Ct value.From left to right, the abscissas are corresponding to the youth group, the middle aged group, the general elderly group, and the senile elderly group.Ordinary one way ANOVA test is used to test differences between groups, ns means P>0.05, no statistical difference; *means P<0.05, **means P<0.01, ***means P<0.001, and the difference is statistically significant.

3 討論

本研究主要建立基于TaqMan 探針多重qPCR的腸道總菌群以及重要共生菌群絕對定量方法。結(jié)果顯示：目標菌屬/科間不具有交叉反應(yīng)；靈敏度高，檢測限約為染料法qPCR 的10%；時效短，在2 h內(nèi)即可完成對3 類腸道共生菌和總菌群的檢測；具有良好的可重復(fù)性，變異系數(shù)低于1.32%，與其他基于TaqMan 探針qPCR 的研究結(jié)果相似[21-23]。Hu等[21]采用TaqMan探針qPCR檢測194份糞便標本中的福氏志賀菌，發(fā)現(xiàn)該方法敏感性達97%，特異性達99%。此外，既往針對腸道菌群定量的研究大多采用細菌計數(shù)或染料法qPCR。Sharma 等[22]使用平板計數(shù)法對嬰兒腸道中的需氧菌和厭氧菌進行定量，結(jié)果顯示菌落計數(shù)范圍為104～1013CFU/g 糞便；Yao等[23]通過SYBR 法qPCR對糞便中擬桿菌、梭菌、梭狀芽孢桿菌、雙歧桿菌和法氏桿菌16S rDNA的檢測實現(xiàn)了細菌定量，檢測限為 102～103copies/μL。但此類研究具有一定的局限性，平板計數(shù)法對培養(yǎng)基選擇、細菌培養(yǎng)條件等方面有較高的要求，且方法的準確性和可重復(fù)性低，靈敏度不及qPCR；SYBR 法qPCR 單孔內(nèi)只能檢測1 種靶基因，且直接以DNA 為模板不能消除多拷貝的影響。本研究通過建立TaqMan 探針多重qPCR 法，構(gòu)建重組質(zhì)粒作為標準模板，在除去細菌不同基因拷貝數(shù)影響的同時，保證實驗結(jié)果的準確性和穩(wěn)定性。

在本方法建立的過程中，考慮了各種影響實驗準確性的可能因素，其中引物和探針的有效性是保證試驗成功的關(guān)鍵。通過Blast 以及PCR 擴增，本研究驗證了引物和探針的特異性，并且對引物序列進行優(yōu)化，減少因退火溫度不同引起的擴增效率差異。此外，由于同一體系內(nèi)多對引物對底物(酶、Mg2+、dNTP等)的競爭，某些高豐度的目標基因的熒光信號可能出現(xiàn)過早，在其他基因擴增前已達到線性和平臺期，則可能使其他基因面臨試劑耗竭，從而導(dǎo)致擴增效果較差。在本實驗中，通過調(diào)整引物和探針的濃度，在最大程度上保證各引物擴增速率的一致性。

本研究利用建立的TaqMan 探針多重qPCR法對臨床標本進行檢測，結(jié)果顯示健康人群糞便標本中雙歧桿菌、腸球菌及腸桿菌的豐度隨增齡的變化趨勢與文獻基本一致[24-27]。雙歧桿菌隨著增齡而逐漸減少，腸桿菌輕度增多，B/E值的降低可能與老年人腸道菌群的定植抗性降低以及對病原的易感有關(guān)[28-29]。由于并非來自同一人群的隊列研究，而是較小規(guī)模的橫斷面研究，對高齡老年組的菌群變化與普通老年組不同的合理解釋，可能并非源自增齡相關(guān)的菌群變化規(guī)律，而更可能由高齡老年潛在的長壽影響因素決定。既往針對長壽老人的研究發(fā)現(xiàn)，他們腸道中的雙歧桿菌、阿克曼菌和毛螺菌等“有益菌”含量較普通老年人高，而“有害菌”含量更少，多樣性更高[30]。本研究在一定程度上支持了這一結(jié)論。

總體而言，本研究建立的腸道共生菌群定量檢測方法適用于實際標本，可以提高主要菌群定量檢測的時效和靈敏度，并有效減少標本用量，特別是珍貴的臨床標本。根據(jù)本方法的思路，可繼續(xù)開發(fā)針對其他目標菌群的定量方法，例如：腸道中有重要研究意義但培養(yǎng)條件嚴苛的厭氧菌；可用于總菌含量更低的標本，如血液、唾液、鼻咽拭子等。另外，TaqMan探針qPCR的多重分析特性，有助于在細菌定量研究中實現(xiàn)樣本的高通量檢測。2016年《柳葉刀》雜志報道的一項病例對照研究，使用該方法對11 400 例糞便標本完成32 種腸道病原菌的定量檢測[31]?；诖颂匦?，本研究建立的方法可作為高通量測序結(jié)果的實驗室補充驗證手段。另外，未來或許可以開發(fā)針對腸道共生菌檢測的TaqMan芯片。然而，本研究建立的方法也具有一定的局限性，單孔內(nèi)的檢測靶標越多，引物間干擾越大，結(jié)果偏差出現(xiàn)的風險也越高。因此，可能須對單重擴增和多重擴增進行差異分析比較，以確保方法的可信度。

綜上所述，本研究建立了一種簡單有效的菌群定量方法，適用于測序結(jié)果的驗證以及臨床推廣，旨在實現(xiàn)對菌群穩(wěn)定性和健康程度的快速評估。