地塞米松灌洗支氣管肺泡聯(lián)合靜脈推注烏司他丁對老年急性肺損傷患者TGF-β1/Smads信號通路的影響

張藝, 胡松華, 朱建新

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 藥學(xué)部, 河北 張家口 075000)

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是由各種肺內(nèi)或(和)肺外致病因素所導(dǎo)致的彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，可由肺部感染、嚴(yán)重創(chuàng)傷、膿毒癥等引起，屬急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)病理學(xué)發(fā)展的早期階段，具有起病急、發(fā)病嚴(yán)重等特點，ALI多并發(fā)急性炎癥、微血管損傷，可造成肺血管和上皮細(xì)胞通透性增加，如不及時治療可發(fā)展為多器官功能衰竭[1-2]?，F(xiàn)階段，臨床主要通過治療原發(fā)基礎(chǔ)病及繼發(fā)性臟器損傷，并采用機(jī)械通氣等對ALI進(jìn)行治療，但這些治療僅能維持患者的肺功能，并不能從根本治療患者呼吸困難的病因[3]。地塞米松是臨床最常用的糖皮質(zhì)激素，被認(rèn)為是治療急危重癥患者的良藥，地塞米松可起到抗炎、抗過敏及免疫抑制等作用，常被用于急性胰腺炎、急性循環(huán)衰竭的輔助用藥[4]。烏司他丁作為廣譜的蛋白酶抑制劑，有拮抗炎性介質(zhì)、穩(wěn)定溶酶體膜和清除氧自由基的作用，適用于多種炎癥性疾病，但其作用機(jī)制亦尚未完全明晰[5-6]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，機(jī)體炎癥、氧化損傷、纖維組織增生及修復(fù)在ALI發(fā)病進(jìn)程中扮演著關(guān)鍵角色，目前關(guān)于地塞米松灌洗支氣管肺泡聯(lián)合烏司他丁治療老年ALI的研究仍鮮有報道，為了探明這一組合方案對老年ALI患者整體療效的影響，本研究選取2019年2月—2021年6月診治的58例老年ALI患者作為研究對象，采用地塞米松灌洗支氣管肺泡聯(lián)合烏司他丁治療，觀察治療期間患者的全身炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)及轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)/Smads信號通路的活化情況，報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2019年2月—2021年6月診治的116例老年ALI患者作為研究對象，所有受試者均符合參考文獻(xiàn)[7]中ALI的診斷標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)未伴有其他相關(guān)臟器的器質(zhì)性病變；(2)入住ICU時急性肺損傷評分(lung injury score,LIS)≥4分；(3)機(jī)械通氣治療時間>3 d;(4)入組前3個月未曾應(yīng)用過糖皮質(zhì)激素、免疫抑制藥物者，(5)患者家屬簽屬知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)地塞米松或烏司他丁藥物過敏者;(2)孕婦及哺乳期婦女;(3)有近期手術(shù)史者;(4)患有嚴(yán)重心肝腎功能障礙者;(5)存在自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病者;(6)血流動力學(xué)不穩(wěn)定者。根據(jù)患者入院順序，并按隨機(jī)數(shù)字表法將患者分為觀察組及對照組，每組58例。

1.2 治療方法

1.2.1對癥治療 入院后2組患者均根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]給予對癥、營養(yǎng)支持、糖皮質(zhì)激素、限制性液體管理及抗生素抗感染等治療，實時監(jiān)測生命體征；給予肺保護(hù)性通氣策略，通氣參數(shù)設(shè)置為小潮氣量通氣水平控制在5～8 mL/kg、呼吸頻率設(shè)定為20次/min、吸入氧濃度(fraction of inspiration O，F(xiàn)iO2)為0.35～0.80、平臺壓<35 cmH2O、呼氣末正壓通氣(positive end expiratory pressure,PEEP)水平依靜態(tài)P-V曲線+2 cmH2O確定，盡量保持患者自主呼吸，防止呼吸肌萎縮。

1.2.2對照組 給予纖維地塞米松灌洗支氣管肺泡(規(guī)格5 mg/1 mL，國藥準(zhǔn)字H44025148，三才石岐制藥股份有限公司生產(chǎn))治療，步驟為：(1)術(shù)前30 min給予15 mg地西泮(規(guī)格10 mg/2 mL，國藥準(zhǔn)字H14022662，山西振東安特生物制藥有限公司)靜脈注射，將2%鹽酸利多卡因注射液噴灑咽喉(規(guī)格0.1 mg/5 mL，國藥準(zhǔn)字H61023138，陜西健民制藥有限公司)行局部麻醉；(2)患者仰臥體位，將ABF-3型纖維支氣管鏡(上海澳華光電內(nèi)窺鏡有限公司產(chǎn)品)經(jīng)氣管導(dǎo)管進(jìn)入氣道，逐級觀察總氣管、左右支氣管及肺葉段支氣管；(3)待氣管內(nèi)痰液清洗干凈后，給予地塞米松20 mg+0.45%氯化鈉溶液60 mL灌洗，20 mL/次，連續(xù)3次。療程7 d。

1.2.3觀察組 在對照組治療的基礎(chǔ)上加用注射用烏司他丁(規(guī)格5萬單位/支，國藥準(zhǔn)字H19990133，廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司)，劑量為10萬單位烏司他丁溶解于0.45%NaCl 20 mL中，靜脈推注，3次/d。，療程7 d。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1氧合指數(shù)、炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo) 分別于治療前后通過動脈血氣分析儀(型號NOVA pHOx plus)監(jiān)測2組患者血氧分壓、計算氧合指數(shù)(氧合指數(shù)=血氧分壓/吸入氧濃度)；同時采集清晨空腹外周靜脈血2 mL，3 500 r/mim離心10 min分離血清，采用免疫吸附(ELISA)法檢測血清中核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、血管細(xì)胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule,VCAM1)、單核細(xì)胞趨化因子-1(monocyte chemoattractant factor-1,MCP-1)及白細(xì)胞介素-8(interleukin-8,IL-8)水平，試劑盒均購自于貝克曼庫爾特商貿(mào)中國有限公司。

1.3.2氧化應(yīng)激指標(biāo) 取1.3.1項下的血清，采用放射免疫沉淀法檢測血清中缺血修飾清蛋白(ischemia modified albumin,IMA)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ,PPAR γ)及丙二醛(malondialdehyde ,MDA)水平，試劑盒均購自于貝克曼庫爾特商貿(mào)中國有限公司。

1.3.3TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)因子 分別于治療前后采集患者外周空腹靜脈血2 mL，用乙二胺四乙酸(elhylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗凝，加入紅細(xì)胞裂解液(美國Pharmacia公司生產(chǎn))200 μL，振蕩混勻，室溫避光5 min，3 500 r/mim離心10 min分離，收集上清液細(xì)胞裂解液 ，用BCA試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司生產(chǎn))檢測樣本蛋白濃度；SDA-PAGE垂直電泳分離，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜液中，200～250 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h，上樣量為30 μg/孔；洗滌液沖洗，10%脫脂奶粉(TTBS配制)4 ℃封閉過夜；分別加入TGF-β1 Ⅰ型受體(tgf-beta 1,TGF-β1RⅠ)、TGF-β1RⅡ、Smad2、Smad3單克隆抗體(抗體稀釋液為5%脫脂奶粉)室溫孵育4 h；用TTBS洗滌后滴加生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h、TTBS洗滌、顯色，實驗設(shè)GAPDH為內(nèi)參照。應(yīng)用Image J軟件計算目標(biāo)條帶的灰度值，目標(biāo)蛋白含量以目標(biāo)蛋白/GAPDH比值來表示。

1.3.4疾病嚴(yán)重程度 由1位5年以上臨床工作經(jīng)驗的呼吸內(nèi)科醫(yī)師采用雙盲法完成疾病嚴(yán)重程度的判斷，使用急性生理與慢性健康(acute physiology and chronic health evaluation， APACHEⅡ)評分、全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)評分及LIS評分評估病情。

1.3.5治療期間指標(biāo)及臨床結(jié)局 記錄2組患者治療期間臨床結(jié)局，包括機(jī)械通氣時間、ICU時間、住院時間、ARDS發(fā)生率、呼吸機(jī)相關(guān)肺炎(ventilator associated pneumonia,VAP)發(fā)生率及總死亡率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般資料

結(jié)果顯示，2組患者性別、年齡、發(fā)病時間及損傷原因等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

2.2 血清氧合指數(shù)、炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)

治療前，2組ALI患者血清氧合指數(shù)、NF-κB、VCAM1、MCP-1、IL-8水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療后，2組患者血清氧合指數(shù)較治療前明顯提高，血清NF-κB、VCAM1、MCP-1、IL-8水平較治療前明顯降低，且觀察組變化更顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表1 兩組ALI患者一般資料比較Tab.1 Comparison of the general data between the two groups

表2 治療前后2組ALI患者血清氧合指數(shù)、炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)比較Tab.2 The serum oxygenation index and inflammatory response related indexes were compared between the two groups before and after

2.3 血清氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)

治療前，2組ALI患者血清IMA、ROS、PPAR γ、MDA水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療后，2組患者血清PPAR γ較治療前明顯提高，血清IMA、ROS、PPAR γ、MDA水平較治療前明顯降低，且觀察組變化更顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

表3 治療前后2組ALI患者血清氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)比較Tab.3 Comparison of serum oxidative stress related indexes between the two groups before and after

2.4 血細(xì)胞TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)因子

治療前，2組ALI患者血細(xì)胞TGF-β1RⅠ、TGF-β1RⅡ、Smad2、Smad3水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療后，2組患者血細(xì)胞TGF-β1RⅠ、TGF-β1RⅡ、Smad2、Smad3水平較治療前明顯降低，且觀察組變化更顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表4。

表4 治療前后2組ALI患者血細(xì)胞TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)因子表達(dá)水平Tab.4 Relative expression levels of TGF-β1/Smads signaling pathway related factors in blood cells of patients between the two groups before and after

2.5 APACHEⅡ、SIRS、LIS評分

治療前，2組ALI患者APACHEⅡ、SIRS、LIS評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療后，2組患者APACHEⅡ、SIRS、LIS評分均較治療前明顯降低，且觀察組變化更顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表5。

表5 治療前后2組ALI患者APACHEⅡ、SIRS及LIS評分分]Tab.5 APACHEⅡ, SIRS, and LIS scores before and after treatment between the two

2.6 治療期間指標(biāo)及臨床結(jié)局

結(jié)果顯示，治療期間觀察組ALI患者機(jī)械通氣時間、ICU時間、住院時間、ARDS發(fā)生率、VAP發(fā)生率均較對照組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；2組患者總死亡率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表6。

表6 兩組ALI患者治療期間指標(biāo)及臨床結(jié)局比較Tab.6 Comparison of clinical outcomes between the

3 討論

ALI作為一種過度反應(yīng)的急性炎癥疾病，往往受到多種內(nèi)、外源因素的影響，患者病情進(jìn)展較快，再加之老年群體多存在組織器官功能減退、合并癥較多等現(xiàn)象，更易危及生命[8]，因此，對ALI患者進(jìn)行針對性治療并優(yōu)化其臨床結(jié)局顯得尤為重要。長期臨床實踐證實，支氣管肺泡灌洗聯(lián)合局部注藥在諸多肺部疾病治療中發(fā)揮著重要效應(yīng)，其主要優(yōu)點在于可直視肺內(nèi)病灶并局部給藥，可深達(dá)支氣管以下肺段及亞肺段水平，能有效清除阻塞支氣管的炎性分泌物和痰液，進(jìn)一步改善氣道阻塞并促進(jìn)肺組織通氣[9]。地塞米松是臨床最常用的糖皮質(zhì)激素，能夠發(fā)揮促進(jìn)痰液排出、阻滯單核細(xì)胞及粒細(xì)胞活化等功能，被認(rèn)為是治療急危重癥患者的良藥，而纖支鏡下肺內(nèi)應(yīng)用地塞米松可提高局部藥物濃度，且藥物直達(dá)肺部患處病變組織，可進(jìn)一步提升治療效果[10]。烏司他丁是一種分子質(zhì)量為67 kDa的蛋白酶抑制劑，可抑制多種水解酶活性、抑制炎癥介質(zhì)釋放等；近年來其在心、肝、肺、腎等重要臟器的保護(hù)治療中扮演著重要角色，本研究結(jié)果顯示，地塞米松灌洗支氣管肺泡聯(lián)合靜脈推注烏司他丁較單一用藥在整體治療效果方面更具有優(yōu)勢，能夠明顯加快患者呼吸系統(tǒng)功能的恢復(fù)進(jìn)程并優(yōu)化其臨床結(jié)局，考慮可能是烏司他丁可通過臟器保護(hù)作用及信號通路調(diào)節(jié)等多條路徑來促進(jìn)臨床療效的提高，但仍需進(jìn)一步驗證。

肺纖維化是ALI發(fā)展進(jìn)程中主要的病理進(jìn)程，而現(xiàn)階段有大量研究表明TGF-β1參與肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展，其作為一類強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)沉積促進(jìn)劑，可直接影響細(xì)胞生長、分化、凋亡及遷移等一系列改變，被認(rèn)為是多種組織發(fā)生纖維化的“總開關(guān)”[12-13]。TGF-β1異構(gòu)體基本在所有的細(xì)胞內(nèi)均存在，且其在肺固有細(xì)胞、肺間質(zhì)細(xì)胞及浸潤炎性細(xì)胞等均有分泌，過度表達(dá)的TGF-β1可誘導(dǎo)正常成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，亦可促進(jìn)蛋白酶的表達(dá)，繼而誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)中多種成分發(fā)生水解。生成的肌成纖維細(xì)胞也會產(chǎn)生TGF-β1，對負(fù)反饋系統(tǒng)造成影響，進(jìn)一步加速肺部纖維化進(jìn)程。另外，TGF-β1還能使其他促纖維化因子上調(diào)而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和凋亡，以實現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[14]。Smad家族是TGF-β1的下游底物，在TGF-β1與細(xì)胞膜表面受體結(jié)合進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，TGF-β1RⅠ和TGF-β1RⅡ形成受體異聚體，促進(jìn)Smad2/3蛋白磷酸化并進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，完成信號跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)一步加速巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞的滲出和向損傷病灶的移動，進(jìn)而促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[15]。因此，本研究通過分析治療前后患者外周血TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)因子水平變化，旨在為評價預(yù)后提供一線依據(jù)。結(jié)果顯示，觀察組經(jīng)治療后的外周血TGF-β1RⅠ、TGF-β1RⅡ、Smad2、Smad3水平明顯高于對照組，提示烏司他丁對ALI病程中的肺間質(zhì)纖維化具有顯著的抑制作用，這也是其阻止患者病情進(jìn)展的直觀證據(jù)。

目前的研究認(rèn)為除了肺部實質(zhì)損傷外，在ALI的進(jìn)展過程中，炎癥細(xì)胞浸潤增強(qiáng)進(jìn)而導(dǎo)致肺結(jié)構(gòu)的破壞及肺部的病理性改變，故炎癥反應(yīng)程度也可間接反映ALI患者疾病嚴(yán)重程度[16-17]。IL-8能夠介導(dǎo)炎癥細(xì)胞的激活和浸潤，在組織損傷后引起的炎性反應(yīng)及應(yīng)激反應(yīng)中顯著升高，引起呼吸道痙攣、液體滲出等，進(jìn)一步抑制了呼吸功能[18]。MCP-1為對單核細(xì)胞具有特異性趨化和激活活性的細(xì)胞因子，可與單核-巨噬細(xì)胞表面受體結(jié)合，趨化單核細(xì)胞進(jìn)入肺組織，繼而造成肺泡腔內(nèi)聚集并形成肺泡炎癥[19]。VCAM1是100～110 kDa 的I型跨膜蛋白，能夠介導(dǎo)炎癥細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附并促進(jìn)炎癥反應(yīng)的放大。NF-κB是在炎癥反應(yīng)激活過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子，其既可維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，又可介導(dǎo)病原特異性應(yīng)答，而肺泡、毛細(xì)血管的大量破壞可使NF-κB與其抑制分子IκB解離并成為游離且結(jié)合形成無活性的三聚體，保證炎癥反應(yīng)處于持續(xù)激活的狀態(tài)[20]。既往研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)的激活會進(jìn)一步引起局部組織中氧自由基過度生成，再加之ALI這一強(qiáng)烈的應(yīng)激源對氧化應(yīng)激反應(yīng)的刺激作用，大量自由基會在病程中大量分泌[21]。IMA屬有氧代謝產(chǎn)物，其含量聚集則能夠引起組織氧化損傷，故IMA為反映機(jī)體應(yīng)激性損傷的敏感性指標(biāo)[22]。PPAR γ是核激素受體家族中的配體激活受體，能夠在氧化應(yīng)激過程中發(fā)揮抗氧化作用，一項基礎(chǔ)實驗證實，LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞急性氧化損傷模型中，PPAR γ通路會促進(jìn)自噬和抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)來緩解細(xì)胞損傷[23]。ROS為氧的正常代謝的天然副產(chǎn)物，當(dāng)人體處于創(chuàng)傷時，會造成呼吸鏈缺損及解偶聯(lián)過程能量轉(zhuǎn)換下降，促進(jìn)ROS的過量釋放，而過量的ROS又可與組織局部的脂質(zhì)成分發(fā)生氧化反應(yīng)，引起MDA大量生成，形成惡性循環(huán)[24]。本研究結(jié)果顯示，觀察組患者經(jīng)治療后的血清NF-κB、VCAM1、MCP-1、IL-8以及IMA、ROS、MAD均明顯低于對照組，而PPAR γ則反之，提示地塞米松灌洗支氣管肺泡聯(lián)合靜脈推注烏司他丁能夠進(jìn)一步抑制炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激的激活。分析原因可能為烏司他丁可抑制中性粒細(xì)胞蛋白酶釋放，阻斷NF-κB等炎癥信號通路，以控制炎性介質(zhì)過度分泌，同時烏司他丁亦能夠有效改善微循環(huán)和肺組織灌注，進(jìn)一步清除自由基，這也是臨床需加強(qiáng)抗炎癥、增強(qiáng)抗氧化能力時，優(yōu)先選擇聯(lián)合用藥的又一依據(jù)。經(jīng)臨床觀察發(fā)現(xiàn)，在ALI患者整個病理生理過程中呼吸氧合功能存在異常，主要原因為患者胸腔壓力增大，下腔靜脈受到壓迫，引起回流障礙，導(dǎo)致血流動力學(xué)異常，進(jìn)而造成氧合功能異常。本研究結(jié)果顯示，觀察組治療后氧合指數(shù)顯著高于對照組，提示地塞米松灌洗支氣管肺泡聯(lián)合靜脈推注烏司他丁能夠明顯改善ALI患者的氧合功能。其作用機(jī)制可能與該治療方案能降低患者肺毛細(xì)血管通透性、抑制血肺泡灌洗液炎性反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，地塞米松灌洗支氣管肺泡聯(lián)合靜脈推注烏司他丁對老年ALI的治療效果優(yōu)于單一地塞米松灌洗支氣管肺泡，可顯著加速病情恢復(fù)進(jìn)程，并改善氧合功能和臨床結(jié)局，其機(jī)制可能與減輕機(jī)體全身炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)并抑制TGF-β1/Smads信號通路的活化有關(guān)。但由于本研究僅進(jìn)行了短期觀察，加之未對相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行動態(tài)觀察，數(shù)據(jù)結(jié)果的代表性有一定局限，因此尚有待更長期的大樣本動態(tài)研究加以證實。