右美托咪定通過AMPK/mTOR通路對老年大鼠術(shù)后認(rèn)知功能障礙的影響

張倩， 張志卓， 王歡， 李瑞冰

(1.河北省邢臺市第三醫(yī)院 麻醉科， 河北 邢臺 054000; 2.河北省邢臺市第三醫(yī)院 手術(shù)室， 河北 邢臺 054000; 3.河北省邢臺市第三醫(yī)院 心外科， 河北 邢臺 054000)

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(post-operative cognitive dysfunction，POCD)是指在麻醉手術(shù)后患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)的一種并發(fā)癥[1]，多發(fā)于老年患者，主要表現(xiàn)為認(rèn)知、注意力、意識及抽象思維等方面的障礙[2-3]。對POCD發(fā)病原因目前尚無統(tǒng)一觀點，在一些國內(nèi)外研究中認(rèn)為手術(shù)麻醉因素會誘導(dǎo)中樞神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡與炎癥，是引發(fā)POCD的重要原因[4-5]。目前臨床尚未明確治療POCD的方法，因此尋找安全有效的治療藥物是臨床亟需的。右美托咪定作為選擇性α2-腎上腺素受體激動劑，具有良好的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛及抗交感作用[6-7]。腺苷酸活化蛋白激酶和絲氨酸/雷帕霉素靶蛋白[adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase/mammalian target of rapamycin, AMPK/mTOR]信號通路是一組在細(xì)胞營養(yǎng)與能量代謝、細(xì)胞生長和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用的重要調(diào)控途徑[8]，在多項研究中表現(xiàn)出與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡有一定的作用[9-10]。為了探究右美托咪定對POCD 的改善作用及其相關(guān)機(jī)制，本研究通過對老年大鼠進(jìn)行肝部分切除術(shù)并進(jìn)行一系列分子生物學(xué)實驗，以期為POCD的臨床治療及藥物研發(fā)提供一定的思路及參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗試劑與藥物 鹽酸右美托咪定注射液(國藥準(zhǔn)字H20090248，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，β-肌動蛋白(β-actin)、AMPK、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin , mTOR)、線粒體促凋亡蛋白(BCL2 Associated X, BAX)與胱天蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3, Caspase-3)抗體及鼠抗二抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒(德國Roche公司，批號11782418713)，PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)，ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)。

1.1.2實驗動物 選取SPF級健康SD大鼠60只，由江蘇艾菱菲生物科技有限公司提供，均為16～20月齡老年雄性大鼠，體質(zhì)量為(550±50)g，大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、右美托咪定低劑量組及右美托咪定高劑量組，每組15只；采用標(biāo)準(zhǔn)飼料與飲用水喂養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度保持在(25±2)℃，相對濕度保持在(40±2)%，動物房進(jìn)行定期消毒和通風(fēng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d進(jìn)行實驗。

1.2 研究方法

1.2.1術(shù)后認(rèn)知障礙模型大鼠的制備 正常適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，所有大鼠均以2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，模型組、低劑量組、高劑量組大鼠均在左側(cè)最后1根肋骨下3 cm處打開1個切口，沿皮膚組織逐層分離，暴露出游離肝臟左葉，將肝左葉切除，確認(rèn)無出血后縫合等待大鼠蘇醒，完成老年大鼠術(shù)后認(rèn)知功能障礙模型的制備[11]。假手術(shù)組麻醉后僅打開腹腔，不予以肝臟部分切除，其余步驟與另外3組一致。

1.2.2給藥 低劑量組術(shù)前30 min以20 μg/kg鹽酸右美托咪定腹腔注射給藥，高劑量組以40 μg/kg鹽酸右美托咪定腹腔注射給藥，模型組與假手術(shù)組大鼠每天相同時間點腹腔注射等量生理鹽水。術(shù)后模型組、高劑量組死亡各2只，剔除；右美托咪定低劑量組死亡1只，剔除；最終每組選取10只動物進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1Zea-Longa評分大鼠認(rèn)知障礙情況 采用 Zea-Longa 評分法于術(shù)前及術(shù)后1、6、12、24、72 h時對大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評分，無神經(jīng)功能缺損癥狀為0分、無法充分伸展前爪為1分、行走時出現(xiàn)偏癱轉(zhuǎn)圈狀況為2 分、行走時出現(xiàn)向左側(cè)傾斜狀況為3分、完全無法自發(fā)行走并出現(xiàn)意識喪失為4分，得分越高神經(jīng)功能障礙越嚴(yán)重。術(shù)前各組大鼠Zea-Longa評分為0，待Zea-Longa評分處死大鼠，并取其海馬組織備用，保存于-80 ℃冰箱。

1.3.2免疫印跡試驗(Western blot)檢測AMPK、mTOR、BAX與Caspase-3蛋白表達(dá)水平 取出部分大鼠海馬組織，通過組織破碎儀加入RIPA 裂解液和PMSF蛋白酶抑制劑提取總蛋白，變性后放入-20 ℃冰箱備用。以Western Blot法分別通過電泳、轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行相關(guān)抗體孵育，包括AMPK、mTOR與凋亡相關(guān)蛋白BAX、Caspase-3等抗體孵育，孵育完成洗膜后，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗二抗孵育，最后將含有蛋白標(biāo)記的膜洗凈，涂上化學(xué)發(fā)光顯影液通過顯影儀拍照，結(jié)果用ImageJ軟件對灰度值進(jìn)行系統(tǒng)性分析。

1.3.3實時熒光定量試驗(Real-time PCR)檢測AMPK/mTOR通路相關(guān)mRNA水平 取出部分大鼠海馬組織，將大鼠海馬組織于液氮中磨碎，加入適量TRIzol試劑，通過勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿處理，隨后進(jìn)行分層、沉淀、清洗及溶解等步驟制得RNA備用。取制備的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后加入SYBR Green染料與AMPK、mTOR、BAX及Caspase-3上下游引物混合離心(引物序列見表1)，隨后于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，循環(huán)完成后做溶解曲線。以采集到的熒光信號值(Ct值)進(jìn)行相對定量分析，比較各組心海馬組織AMPK/mTOR通路相關(guān)mRNA的表達(dá)水平。

表1 所選基因引物序列Tab.1 Primer sequences of selected genes

1.3.4海馬組織TUNEL染色病理學(xué)觀察 將各組大鼠海馬組織包埋后進(jìn)行切片、脫蠟至脫水，隨后浸潤在H2O2中孵育30～40 min以消除其中的內(nèi)源性過氧化酶活性；之后按照TUNEL染色試劑盒說明書步驟處理樣本、并染色，隨后在400倍顯微鏡下觀察各組樣本中海馬CA1區(qū)神經(jīng)元染色情況，陽性結(jié)果為出現(xiàn)細(xì)胞核固縮且細(xì)胞核被染成近褐棕色。

1.3.5ELISA檢測海馬組織炎癥水平 取出部分大鼠海馬組織，以25 mL/g 加入生理鹽水混合研磨勻漿，離心后轉(zhuǎn)移上清液至干凈的EP管，按照ELISA試劑盒步驟對樣本IL-1β與TNF-α進(jìn)行標(biāo)記，通過酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光度，并以標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算其中IL-1β與TNF-α含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Zea-Longa認(rèn)知障礙評分

術(shù)后各時間點各組大鼠的Zea-Longa認(rèn)知障礙評分結(jié)果顯示，模型組、低劑量組與高劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著高于假手術(shù)組，低劑量組與高劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠Zea-Longa認(rèn)知障礙評分情況Tab.2 Zea-Longa cognitive impairment scores of rats in each

2.2 海馬組織AMPK、mTOR、BAX及Caspase-3蛋白表達(dá)

術(shù)后低劑量組與高劑量組大鼠海馬組織AMPK、mTOR、BAX與Caspase-3的蛋白水平相對高于假手術(shù)組，但明顯低于模型組，同時高劑量組較低劑量組AMPK、mTOR、BAX與Caspase-3的蛋白水平較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：(1)與假手術(shù)組比較， P<0.05；(2)與模型組比較， P<0.05；(3)與低劑量組比較， P<0.05。圖1 各組大鼠海馬組織AMPK、mTOR、BAX及Caspase-3的蛋白水平Fig.1 Protein level of AMPK, mTOR, BAX， and Caspase-3 in the hippocampus of rats in each group

2.3 海馬組織AMPK、mTOR、BAX及Caspase-3的mRNA水平

低劑量組與高劑量組大鼠海馬組織AMPK、mTOR、BAX及Caspase-3 mRNA水平相對高于假手術(shù)組，但明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.4 神經(jīng)元細(xì)胞病理學(xué)形態(tài)

結(jié)果如圖3所示，模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮狀態(tài)，右美托咪定組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量與模型組相比明顯增加，神經(jīng)元凋亡指數(shù)明顯降低，大鼠海馬CA1區(qū)部分神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常，細(xì)胞膜基本完整、且高劑量組凋亡情況低于低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

注：(1)與假手術(shù)組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05；(3)與低劑量組比較，P<0.05。圖2 各組海馬組織AMPK、mTOR、BAX及Caspase-3的mRNA水平Fig.2 Levels of AMPK, mTOR, BAX, and Caspase-3 mRNA in the hippocampus of rats in each group

注：(1)與假手術(shù)組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05；(3)與低劑量組比較，P<0.05。圖3 各組大鼠海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞病理學(xué)形態(tài)(TUNEL染色，×400)Fig.3 Pathological morphology of neuronal cells in the hippocampal tissues of each group(TUNEL staining, ×400)

2.5 IL-1β、TNF-α水平

ELISA結(jié)果顯示術(shù)后各組大鼠海馬組織勻漿中L-1β與TNF-α水平均顯著升高，但與模型組相比右美托咪定能一定程度上減輕炎癥水平、且高劑量組降低IL-1β與TNF-α水平較低劑量組更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠海馬組織勻漿中IL-1β與TNF-α水平Tab.3 Levels of IL-1β and TNF-α in the hippocampal

3 討論

術(shù)后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生機(jī)制目前尚不明確，目前認(rèn)為是多重因素共同作用的結(jié)果[12]。在神經(jīng)退行性疾病中，神經(jīng)細(xì)胞的凋亡往往發(fā)揮著重要作用，它通過基因表達(dá)調(diào)控從而導(dǎo)致細(xì)胞自主并且程序性的死亡[13]，如果神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平的平衡失調(diào)，則會導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展，如阿爾茲海默癥[14]、帕金森病[15]、亨廷頓氏舞蹈癥[16]等存在認(rèn)知功能障礙的疾病。本研究通過肝部分切除術(shù)進(jìn)行老年大鼠術(shù)后認(rèn)知功能障礙模型的制備和相應(yīng)的實驗研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠較模型建造前Zea-Longa認(rèn)知功能障礙評分明顯升高，大鼠出現(xiàn)不同程度的行走偏癱、傾斜或意識喪失，提示術(shù)后認(rèn)知功能障礙大鼠模型制備成功。同時本研究實驗結(jié)果還顯示，右美托咪定組大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡率雖略高于假手術(shù)組，但明顯低于模型組，該結(jié)果表明右美托咪定能有效抑制海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，從而產(chǎn)生直接的神經(jīng)保護(hù)作用。陳燕樺等[17]與康文越等[18]研究結(jié)果顯示右美托咪定通過拮抗神經(jīng)細(xì)胞的凋亡發(fā)揮一定的神經(jīng)保護(hù)作用，與本研究結(jié)果一致。另有研究表明，在術(shù)后認(rèn)知障礙大鼠中其海馬區(qū)AMPK/mTOR信號通道表達(dá)異常[19]。AMPK是一種進(jìn)化上保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶[20]，mTOR也是一個保守的絲/蘇氨酸激酶，是細(xì)胞生長和增殖的中樞控制器[21]。在目前的研究中，AMPK/mTOR信號通路是細(xì)胞能量代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞凋亡進(jìn)程中重要調(diào)控途徑[22]，在多種神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮著重要作用。在本研究中，模型組大鼠海馬區(qū)AMPK、mTOR蛋白與凋亡相關(guān)蛋白BAX、Caspase-3的表達(dá)明顯上升，同時mRNA水平檢測結(jié)果與蛋白表達(dá)檢測結(jié)果一致，提示其凋亡水平增加，這可能與手術(shù)應(yīng)激條件下AMPK被激活導(dǎo)致出現(xiàn)代謝衰竭狀態(tài)后誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的活性氧促使大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)，其下游mTOR同樣會參與級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[23]。當(dāng)給予鹽酸右美托咪定后，術(shù)后認(rèn)知障礙模型大鼠海馬組織AMPK與mTOR表達(dá)量顯著降低，神經(jīng)細(xì)胞凋亡程度同樣減輕，提示右美托咪定或許通過抑制AMPK/mTOR信號通路發(fā)揮作用，且提高給藥濃度后，其抑制AMPK與mTOR的蛋白表達(dá)水平與抑凋亡作用明顯提升，進(jìn)一步說明了右美托咪定能通過抑制AMPK/mTOR信號通路發(fā)揮抑凋亡作用。

此外，在一些研究中由于手術(shù)應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致的腦內(nèi)炎癥的發(fā)生，從而出現(xiàn)一系列中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變化，具有神經(jīng)毒性的炎癥介質(zhì)，會影響神經(jīng)元功能，從而導(dǎo)致認(rèn)知功能的減退[24]。在本研究結(jié)果中，術(shù)后各組海馬組織IL-1β與TNF-α水平升高，與其他研究一致。與模型組相比，右美托咪定能一定程度上減輕炎癥水平，且高劑量組降低IL-1β與TNF-α水平較低劑量組更高，這可能與右美托咪定的中樞性擬交感作用和激活膽堿能抗炎通路從而發(fā)揮抗炎作用有關(guān)，國外的一些研究同樣證實右美托咪定具有一定的抗炎作用[25]。

綜上所述，本研究通過建立術(shù)后認(rèn)知障礙老年大鼠模型，應(yīng)用右美托咪定治療發(fā)現(xiàn)右美托咪定改善其海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡進(jìn)程，減輕手術(shù)應(yīng)激產(chǎn)生的海馬區(qū)炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮改善老年大鼠海馬組織損傷后的認(rèn)知功能障礙情況，其機(jī)制可能與調(diào)控凋亡相關(guān)信號通路AMPK/mTOR有關(guān)。本研究為開展老年患者手術(shù)應(yīng)激產(chǎn)生的認(rèn)知障礙的預(yù)防與治療提供了新的思路與研究證據(jù)。