漿細(xì)胞腫瘤多參數(shù)流式細(xì)胞免疫表型分析

白志瑤 堵艷 吳迪 代文芳 楊韻佳 陶景莉

作者單位：655000 云南曲靖，曲靖市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)中心

漿細(xì)胞腫瘤（plasma cell neoplasm，PCN）由終末期B 細(xì)胞（漿細(xì)胞或漿細(xì)胞樣淋巴細(xì)胞）單克隆增殖導(dǎo)致，歸巢于骨髓或骨髓外組織異常增殖并分泌同質(zhì)性免疫球蛋白及片段（單克隆蛋白即M 蛋白）。較常見的有漿細(xì)胞骨髓瘤（plasma cell myeloma，PCM），也包括累及淋巴細(xì)胞與漿細(xì)胞的重鏈型PCN和華氏巨球蛋白血癥（Waldenstrom macroglobulinemia，WM）及其他成熟B 細(xì)胞腫瘤［1］。

在實(shí)際臨床工作中，由于部分骨髓瘤細(xì)胞在形態(tài)上與正常漿細(xì)胞大致相同，很難區(qū)分，而且隨著漿細(xì)胞的成熟，B 細(xì)胞系特異性抗原及表面免疫球蛋白丟失，使骨髓瘤細(xì)胞表面抗原呈異質(zhì)性。流式細(xì)胞術(shù)具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)漿細(xì)胞表面抗原分子表達(dá)的不同，可將其分為正常漿細(xì)胞和惡性漿細(xì)胞。因此，在PCN 的臨床診斷及科學(xué)研究中，對漿細(xì)胞表面抗原進(jìn)行免疫表型分析具有廣闊的應(yīng)用前景，可作為PCN 的輔助診斷、預(yù)后評(píng)估及微小殘留監(jiān)測標(biāo)志物，其價(jià)值已被越來越多的學(xué)者所認(rèn)同。本研究旨在總結(jié)并分析常見PCN的流式細(xì)胞免疫表型特征，為臨床輔助診斷漿細(xì)胞惡性腫瘤、監(jiān)測病情和判斷預(yù)后提供參考，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料和方法

1.1 研究對象 選擇2014 年5 月—2020 年12 月在本院確診的46 例PCN 患者作為研究對象。40 例多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）患者中男性23 例，女性17 例；3 例原發(fā)性漿細(xì)胞白血?。╬rimary plasma cell leukemia，PPCL）患者中男性2 例，女性1 例；3 例WM 患者均為男性。所有確診病例均符合國內(nèi)診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］。

1.2 主要儀器 貝克曼庫爾特Navios 流式細(xì)胞分析系統(tǒng)購自美國Beckman 公司，生物安全柜購自美國Thermo 公司，高速離心機(jī)購自德國Sigma 公司。

1.3 研究方法 使用肝素抗凝管采集所有患者骨髓標(biāo)本3 mL，根據(jù)實(shí)驗(yàn)號(hào)編寫管號(hào)。兩個(gè)樣本管中分別加入所需抗體及100 μL 樣本混勻，室溫（20～25 ℃）避光染色15～30 min。加入2 mL FACS溶解液溶解紅細(xì)胞15 min，振蕩混勻，避光室溫孵育至完全溶血。以1 700 r/min 離心5 min，棄上清混勻，加入1%小牛血清2 mL 洗滌，1 700 r/min 離心5 min，棄上清。2 號(hào)管加入打孔劑處理后，加入適量Kappa-FITC及Lambda-PE試劑孵育30 min。加入1%多聚甲醛固定液500 μL，等待上機(jī)檢測。不立即檢測的樣本可暫時(shí)避光保存，在2 h 內(nèi)完成檢測。

1.4 倫理學(xué) 本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批（審批號(hào)：2022YJKTY07），患者均簽署知情同意書。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用Excel 軟件。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

流式細(xì)胞免疫分型結(jié)果 40 例MM 包括免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）型17 例，IgA 型9 例和輕鏈（light chain，LC）型14 例。3 例PPCL 包括IgG 型1 例和LC 型2 例。3 例WM 均為IgM 型。2.1 MM 患者免疫分型結(jié)果 40 例MM 患者中表達(dá)CD38 最多，為38 例，其次為CD138 表達(dá)29 例。見表1。

表1 40 例MM 患者流式細(xì)胞免疫分型結(jié)果

2.2 PPCL 患者免疫分型結(jié)果 3 例PPCL 患者均表達(dá)CD38，表達(dá)CD138、CD56、CD19 各1 例；3 例均為κ 輕鏈限制性表達(dá)。見表2。

表2 3 例PPCL 患者流式細(xì)胞免疫分型結(jié)果

2.3 WM 患者免疫分型結(jié)果 3 例WM 患者均表達(dá)CD38，2 例表達(dá)CD19，表達(dá)CD56、CD138 各1 例；3 例均不表達(dá)CD5、CD10、CD20 及CD22，2 例為κ 輕鏈限制性表達(dá)，1 例為λ 輕鏈限制性表達(dá)。見表3。

表3 3 例WM 患者流式細(xì)胞免疫分型結(jié)果

3 討論

PCN 最常見的是MM，骨髓中異常的漿細(xì)胞數(shù)量是其主要診斷標(biāo)準(zhǔn)和療效判斷指標(biāo)之一，但MM不同于其他血液系統(tǒng)惡性腫瘤。分化良好的骨髓瘤細(xì)胞在形態(tài)上與成熟漿細(xì)胞相似，形態(tài)學(xué)計(jì)數(shù)有一定困難，且MM 細(xì)胞呈灶性分布，易受穿刺部位、涂片水平和檢驗(yàn)者經(jīng)驗(yàn)等隨機(jī)因素的影響，使得部分患者未能被及時(shí)診斷，錯(cuò)過了最佳的治療時(shí)機(jī)，在臨床實(shí)踐中應(yīng)該給予高度重視［3］。

目前，除漿細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)可用于評(píng)判其克隆性外，免疫學(xué)表型是最常用的方法，漿細(xì)胞CD38 和CD138 陽性，CD19 陰性和（或）κ /λ 輕鏈限制性陽性為PCN 的重要特征［1］。有研究表明，正常漿細(xì)胞為多克隆，κ /λ 輕鏈比值約為1.5∶1，腫瘤性漿細(xì)胞為輕鏈限制性表達(dá)，歐洲骨髓瘤組織將κ /λ 輕鏈比值＞8（存在κ 輕鏈克?。┗颍?.2（存在λ 輕鏈克?。┳鳛槌霈F(xiàn)單克隆異常漿細(xì)胞的標(biāo)志［4］。通過增加獲取的骨髓總細(xì)胞數(shù)可以檢測出骨髓中＞0.01%的腫瘤漿細(xì)胞，直接評(píng)估骨髓腫瘤負(fù)荷。

本研究PCN 患者中，CD38 和CD138 是識(shí)別漿細(xì)胞的重要標(biāo)志物。雖然CD34+造血祖細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（nature killer cell，NK）、活化T 細(xì)胞以及單核細(xì)胞均可表達(dá)CD38，但正常漿細(xì)胞表面的CD38 分子表達(dá)水平明顯高于其他類型的細(xì)胞，異常漿細(xì)胞表面CD38 表達(dá)往往減弱。CD138 分子為漿細(xì)胞分化抗原，出現(xiàn)于漿細(xì)胞祖細(xì)胞階段，并隨著漿細(xì)胞的分化成熟，其表達(dá)不斷增強(qiáng)。正常骨髓中不表達(dá)CD138，僅漿細(xì)胞表達(dá)CD138，因此，CD138 是最具特異性的漿細(xì)胞標(biāo)志物［5］。

CD45 是白細(xì)胞表面共同抗原，除血小板和紅細(xì)胞以外，CD45 可在所有的造血細(xì)胞中表達(dá)。CD45在正常的未成熟階段的漿細(xì)胞中高表達(dá)，而在漿細(xì)胞的分化和發(fā)育中，CD45 表達(dá)逐漸下調(diào)［6］。

CD56 是介導(dǎo)造血細(xì)胞黏附的分子之一，屬于免疫球蛋白超家族成員，同時(shí)也是NK 細(xì)胞的表面抗原。CD56 一般不表達(dá)于正常成熟漿細(xì)胞表面，但可在神經(jīng)外胚層來源的腫瘤細(xì)胞中檢測到，并且CD56在MM 細(xì)胞中表達(dá)率較高，因此，常用于檢測異常漿細(xì)胞，與不良預(yù)后有關(guān)［7-8］。本研究40 例MM 患者中，23 例表達(dá)CD56，2 例部分表達(dá)CD56；3 例PPCL 和WM 患者中均有1 例表達(dá)CD56。

CD27 屬于腫瘤壞死因子家族成員，是成熟B 淋巴細(xì)胞向漿細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重要分子，表達(dá)于B 細(xì)胞和大部分外周T 細(xì)胞。此外，CD27 在正常漿細(xì)胞和意義未明單克隆丙種球蛋白血癥（monoclonal gammopathy of undetermined significance，MGUS）患者漿細(xì)胞表面均有表達(dá)，而在患者疾病進(jìn)展期丟失，因此是臨床判斷MGUS 轉(zhuǎn)歸的指標(biāo)［9］。本研究40 例MM 中，4 例表達(dá)CD27，3 例PPCL 和WM 均不表達(dá)CD27。林陽等［10］的研究報(bào)道提出，PCN 患者骨髓中常出現(xiàn)正常和異常漿細(xì)胞同時(shí)存在的情況，當(dāng)正常漿細(xì)胞占骨髓總漿細(xì)胞比值≥5%時(shí)，有助于鑒別和診斷MGUS 與MM，并評(píng)估MGUS 向MM 轉(zhuǎn)化的危險(xiǎn)程度，同時(shí)識(shí)別良好型的MM。此外，約半數(shù)MM 細(xì)胞不表達(dá)CD27，在疾病進(jìn)展期和復(fù)發(fā)期更明顯［11-12］。

CD28 是T 細(xì)胞限制性抗原，在正常漿細(xì)胞中一般不表達(dá)，CD28 過表達(dá)時(shí)提示有疾病進(jìn)展或復(fù)發(fā)情況發(fā)生［13］。本研究40 例MM 患者中，5 例表達(dá)CD28，3 例PPCL 和WM 患者均不表達(dá)CD28。CD19是相對分子質(zhì)量為95 000 的糖蛋白，是B 細(xì)胞群的重要表面分子，與B 細(xì)胞活化及發(fā)育調(diào)節(jié)有關(guān)，有研究證實(shí)，CD19 在MM 細(xì)胞中很少表達(dá)甚至不表達(dá)，本研究40 例MM 患者中3 例表達(dá)CD19；3 例PPCL患者中1 例表達(dá)CD19；3 例WM 患者中2 例表達(dá)CD19。CD117 和CD34 分子為干組細(xì)胞標(biāo)志物，在漿細(xì)胞表面不表達(dá)，本研究40 例MM 患者中2 例表達(dá)CD117。CD200 是一種跨膜糖蛋白，與CD200+骨髓瘤患者比較，有CD200-的骨髓瘤患者無事件生存期更長［14］。

漿細(xì)胞白血?。╬lasma cell leukemia，PCL）是一種罕見的漿細(xì)胞疾病，具有高度侵襲性，其特征是常規(guī)治療反應(yīng)率低，預(yù)后不良，且骨髓檢查可見漿細(xì)胞惡性增殖，并可累及外周血［15-16］。PCL 的發(fā)病率極低，目前多為個(gè)案或少數(shù)病例的報(bào)道。本研究3 例PPCL 患者均表達(dá)CD38，且為胞內(nèi)免疫球蛋白κ 輕鏈限制性表達(dá)，1 例表達(dá)CD138，1 例表達(dá)CD56，1 例部分表達(dá)CD19。林陽和萬歲桂［10］報(bào)道PCL 細(xì)胞表型CD38、CD2、CD3、CD10、CD13、CD16、CD138、CD15 表達(dá)與MM 相似，PPCL 的CD28 表達(dá)率明顯低于繼發(fā)性PCL，CD28 有助于鑒別PPCL 與繼發(fā)性PCL。因PCL 病例數(shù)較少，其免疫表型與MM 的差異還有待進(jìn)一步觀察積累。

WM 為惰性B 細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤，約占非霍奇金淋巴瘤的1%～2%,指伴有IgM 分泌的淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤（lymphoplasmacytic lymphoma，LPL），診斷時(shí)患者年齡為63～75 歲，男女比例約為2∶1［17］。本研究3 例WM 患者均表達(dá)CD38，2 例表達(dá)CD19，1 例表達(dá)CD56，1 例部分表達(dá)CD138，3 例均不表達(dá)CD5、CD10、CD20、cCD22，2 例為胞內(nèi)免疫球蛋白κ輕鏈限制性表達(dá)，1 例為λ 輕鏈限制性表達(dá)。林陽和萬歲桂［10］報(bào)道LPL 的腫瘤細(xì)胞具有與漿細(xì)胞相同的分化特征，單從形態(tài)上很難與PCN 區(qū)分，流式細(xì)胞免疫表型分析在LPL 與腫瘤細(xì)胞的鑒別診斷中有一定作用。

對PCN 流式細(xì)胞免疫表型進(jìn)行分析時(shí)，合理的設(shè)門是提高檢測敏感性和可重復(fù)性的關(guān)鍵。現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道多以CD138/散射光和CD38/散射光設(shè)門。此外，值得關(guān)注的是，采用CD38/SSC 設(shè)門方法檢測CD38 表達(dá)相對較弱的MM 細(xì)胞時(shí)易出現(xiàn)假陰性結(jié)果［10］。采用CD38/CD138 設(shè)門方法雖可提高漿細(xì)胞檢出率，但因混有其他細(xì)胞的概率較高，易影響漿細(xì)胞異常免疫表型分析，而采用CD38/CD45設(shè)門方法雖可減少污染其他細(xì)胞的概率，但同時(shí)也容易遺漏大多數(shù)CD45+的惡性漿細(xì)胞。因此，采用CD38、CD138、CD45 及散射光特性聯(lián)合分析，不但可提高異常漿細(xì)胞的檢出率，同時(shí)也可以保證不同操作者之間檢測結(jié)果的一致性。目前認(rèn)為CD38++、CD138+、CD19+、CD56-、CD19-、CD56+是鑒別良性與惡性漿細(xì)胞的主要免疫表型［18-21］。因此，聯(lián)合檢測CD19/CD56與CD20、CD117、CD27、CD28、CD33，可提高惡性漿細(xì)胞的檢出率。

綜上所述，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)，對細(xì)胞進(jìn)行免疫表型分析，可同時(shí)具備操作簡便速度快，結(jié)果準(zhǔn)確性和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在PCN 的診斷及鑒別、預(yù)后判斷、微小殘留?。╩inimal residual disease，MRD）監(jiān)測等方面具有極大的應(yīng)用價(jià)值。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突