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    UGT2B15 在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)及影響

    2022-12-23 06:12:10陳選民周偉偉譚芳芳賓玉玲胡光勝
    關(guān)鍵詞:胃癌分子蛋白

    陳選民 周偉偉 譚芳芳 賓玉玲 胡光勝

    作者單位:421001 湖南衡陽,南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科

    胃癌是高度惡性的消化系統(tǒng)腫瘤,根據(jù)2018 年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,胃癌的病死率已位居惡性腫瘤第二位,全球每年因胃癌死亡的人數(shù)超過78 萬名[1]。我國是胃癌高發(fā)國家,盡管診療技術(shù)不斷進(jìn)步,分子靶向藥物也被不斷開發(fā)及應(yīng)用,但胃癌患者的5 年生存率仍然很低[2]。因此,揭示胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,尋找新的潛在治療靶點(diǎn),對(duì)提高胃癌患者的生存率具有十分重要的臨床意義。

    生物信息學(xué)在醫(yī)學(xué)研究中科學(xué)高效,該方法采用大數(shù)據(jù)高速算法,減少小樣本帶來的誤差,使結(jié)果更加科學(xué)合理,也為腫瘤的研究提供了新的方向。本研究前期對(duì)基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus,GEO)中胃癌mRNA高通量數(shù)據(jù)GSE54129、GSE79973 及GSE56807 進(jìn)行生物信息學(xué)分析(包括126 例胃癌組織及36 例癌旁組織),共篩查出118 個(gè)差異表達(dá)mRNA,進(jìn)一步通過基因聚類分析(gene ontology,GO)、基因信號(hào)通路分析(Kyto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway,KEGG pathway)及蛋白間相關(guān)性分析(protein and protein interaction,PPI),篩選處可能調(diào)控胃癌發(fā)生發(fā)展的葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶2家族B15(glucuronsyltransferase family 2 member B15,UGT2B15)[3]。

    UGT2B15 是UGT2 家族成員,主要在肝臟或肝外組織中表達(dá),在雄激素葡萄苷酸化中具有重要作用[4]。有研究表明,UGT2B15 的基因多態(tài)性導(dǎo)致個(gè)體對(duì)藥物或激素代謝存在差異[5]。前列腺癌中UGT2B15 高表達(dá)可導(dǎo)致去勢術(shù)后患者化療耐藥[6];乳腺癌中UGT2B15 表達(dá)增高能減弱莫西芬的化療效果,導(dǎo)致乳腺癌患者獲得性耐藥[4]。但UGT2B15在胃癌中的研究報(bào)道比較少見,本研究前期分析人類癌癥基因組圖譜計(jì)劃(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫,結(jié)果表明UGT2B15 在胃癌患者體內(nèi)高表達(dá),且其表達(dá)與胃癌患者的臨床分期及預(yù)后密切相關(guān)。本研究旨在分析UGT2B15 在胃癌組織中的表達(dá)及其對(duì)胃癌細(xì)胞的作用,從而為胃癌的分子治療尋求新的分子標(biāo)記物,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

    1 資料與方法

    1.1 資料收集 收集2015 年1 月—2019 年12 月在本院就診并行胃癌根治術(shù)的胃癌患者的226 份臨床標(biāo)本(包括腫瘤組織和癌旁組織標(biāo)本),其中136 份制成石蠟切片,另外90 份制作冰凍組織提取RNA。所有手術(shù)標(biāo)本均在離體30 min 內(nèi)收集,且術(shù)后經(jīng)病理科確診為胃癌。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn),并經(jīng)本院倫理審查(審批號(hào):2018110102008),所有患者均知情同意。

    1.2 儀器與試劑 熒光倒置相差顯微鏡購自中國北京博瑞斯科技有限公司,免疫組化試劑盒購自武漢谷歌生物科技有限公司,UGT2B15(ab89274)和FOXA1(ab170933)以及β-actin(ab179467)單克隆抗體均購自美國abcom 公司;實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative PCR,qRTPCR)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及CCK-8 試劑盒均購自上海翊圣生物科技有限公司;TRizol 試劑購自美國賽默飛世爾科技有限公司;siRNA 及PCR 引物由武漢賽維爾生物公司設(shè)計(jì)合成,序列見表1。

    表1 qRT-PCR 引物及siRNA 序列

    1.3 免疫組化檢測 將所收集的病理組織制成石蠟切片后經(jīng)60 ℃烤片溶蠟,二甲苯及梯度乙醇脫蠟脫水后置于95 ℃水浴鍋中靜置20 min,用3%過氧化氫(H2O2)溶液浸泡孵育,去除內(nèi)源性抗原,并在4 ℃冰箱加一抗孵育過夜。使用磷酸鹽緩沖液清洗3 次,每次約5 min,然后孵育二抗1~2 h 后,DAB顯色。蘇木素溶液復(fù)染并利用1%乙醇反藍(lán),封片后干燥。由3 名有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師分別閱片后進(jìn)行評(píng)分。

    1.4 qRT-PCR 及siRNA 轉(zhuǎn)染 采用TRizol 法提取組織或細(xì)胞中RNA,經(jīng)儀器測定RNA 濃度及純度無誤后,利用DNA 去除和反轉(zhuǎn)錄步驟制備cDNA。采用qRT-PCR 檢測相對(duì)表達(dá)量,進(jìn)行PCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min,1 個(gè)循環(huán);95 ℃變性10 s,60 ℃退火,延伸30 s,30 個(gè)循環(huán);95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s,1 個(gè)循環(huán)。取對(duì)數(shù)期生長的AGS 和MGC-803 胃癌細(xì)胞接種到6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板,加入無抗菌藥物培基培育12~24 h,待細(xì)胞融合度為約50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率檢測和后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.5 細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力檢測 利用胰酶消化并制備細(xì)胞懸液,在細(xì)胞計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)后,將細(xì)胞接種于96 孔板,每孔接種約2 000 個(gè)細(xì)胞,每5 個(gè)副孔設(shè)置為一組。檢測各組細(xì)胞5 d 的生長情況,使用酶標(biāo)儀檢測450 nm 處吸光度值(A),以各組胃癌細(xì)胞的A值表示細(xì)胞增殖水平。FITC/PI 雙染法收集處理轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞,并利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡;將各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后接種至Transwell 小室,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,清洗小室后以結(jié)晶紫染色并于顯微鏡下觀察各小室穿過的細(xì)胞,計(jì)算細(xì)胞數(shù)量以測定各組細(xì)胞的侵襲能力。

    1.6 Western blotting 檢測 利用RAPA 裂解液將細(xì)胞在冰上裂解約30 min 后,高速離心,收集上清蛋白液,變性后低溫保存,上樣80 V 恒壓電泳,恒流轉(zhuǎn)膜后孵育抗體,并利用顯影液顯影后觀察蛋白條帶。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0 軟件分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以百分比表示,采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 胃癌組織中UGT2B15 的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示,UGT2B15 在胃癌組織中呈深黃色或褐色,而在癌旁正常腺體組織中,UGT2B15 呈淡黃色或無染色,表明UGT2B15 在癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織。qRT-PCR 檢測結(jié)果也顯示UGT2B15 的mRNA在癌組織中表達(dá)水平明顯高于癌旁組織。見圖1。2.2 UGT2B15 表達(dá)與胃癌患者臨床病理及預(yù)后的關(guān)系 UGT2B15 在胃癌中的表達(dá)與腫瘤浸潤深度、脈管侵犯和TNM 分期密切相關(guān)(均P<0.05),而與患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)。見表2。Kaplan-Meier 生存分析顯示,UGT2B15 高表達(dá)患者的特定疾病生存率(disease-specific survival,DSS)和總生存率(overall survival,OS)均明顯低于低表達(dá)患者(DSS:Log Rank=8.425,P=0.004;OS:Log Rank=9.776,P=0.009)。

    圖1 免疫組化檢測UGT2B15 在胃癌組織(1A)及癌旁正常腺體組織(1B)中的表達(dá)

    表2 UGT2B15 表達(dá)與胃癌臨床病理因素的關(guān)系

    2.3 siRNA 干擾胃癌細(xì)胞UGT2B15 表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲并促進(jìn)凋亡 UGT2B15 在AGS 和MGC-803 細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于胃黏膜上皮細(xì)胞GES1,因此利用siRNA 熒光標(biāo)記UGT2B15 后干擾AGS 和MGC-803 中UGT2B15 的表達(dá)。采用CCK-8 法檢測轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞增殖能力,結(jié)果顯示,抑制組的AGS 和MGC-803 細(xì)胞增殖能力均明顯低于對(duì)照組(AGS:0.67±0.25 比1.75±0.43,MGC-803:0.82±0.33 比1.86±0.47,均P<0.05)。FITC/PI 雙染實(shí)驗(yàn)和Teanswell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,抑制組的細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組〔(17.2±6.4)%比(8.7±3.4)%,P<0.05〕,A值明顯低于對(duì)照組(AGS:472.0±36.5 比700.3±82.2,MGC-803:487.2±18.2比638.5±21.3,均P<0.05)。見圖2。

    2.4 siRNA 抑制UGT2B15 表達(dá)并下調(diào)FOXA1 表達(dá) 生物信息學(xué)分析表明,F(xiàn)OXA1 在胃癌中表達(dá)升高,且與UGT2B15 的表達(dá)密切相關(guān),為進(jìn)一步明確二者關(guān)系,采用免疫組化方法檢測FOXA1 在胃癌中的表達(dá),結(jié)果顯示FOXA1 在癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織;Western blotting 及qRT-PCR 結(jié)果也顯示siRNA 抑制胃癌細(xì)胞UGT2B15 后可明顯降低FOXA1 的蛋白及RNA 表達(dá)(蛋白表達(dá):0.091±0.0182 比0.045±0.0124,RNA 表達(dá):AGS:1.000±0.000 比0.582±0.124,MGC-803:1.000±0.000 比0.724±0.157,均P<0.05)。見圖3~4。

    圖 2 抑制UGT2B15 的表達(dá)可明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡并降低胃癌細(xì)胞侵襲能力

    圖3 Western blotting 檢測siRNA 抑制UGT2B15 后FOXA1 的蛋白表達(dá)水平

    圖4 qRT-PCR 檢測siRNA 抑制UGT2B15 后FOXA1 的RNA 表達(dá)水平

    3 討論

    胃癌是危害社會(huì)公共健康的難題,雖然診療技術(shù)的不斷完善使胃癌診治方法有了較大進(jìn)展,但由于其侵襲轉(zhuǎn)移能力強(qiáng),且早期癥狀不明顯,胃癌治療仍然十分困難[7]。隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展,從基因?qū)用鎸ふ抑委煱悬c(diǎn)一直是胃癌研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn),因此尋找有效的分子標(biāo)志物十分迫切。近年來,隨著第三代基因測序及生物信息學(xué)的飛速發(fā)展,越來越多的研究者將兩者結(jié)合,分析和篩選出大量參與胃癌調(diào)控的分子標(biāo)志物,也從各層面進(jìn)一步揭示了胃癌的發(fā)展規(guī)律,為臨床治療提供新思路[8-9]。

    本課題組前期通過對(duì)GEO 數(shù)據(jù)集中GSE54129、GSE79973、GSE56807 納入126 例胃癌組織及36 例癌旁組織的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析,篩查出它們共有118 個(gè)差異表達(dá)mRNA,并利用基因聚類分析、基因信號(hào)通路分析和蛋白間相關(guān)性分析等方法最終篩選發(fā)現(xiàn)UGT2B15 可能是參與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵分子。目前對(duì)UGT2B15 的研究主要集中在其對(duì)藥物代謝的影響以及在腫瘤耐藥等方面的作用[10-11]。但本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)表明,在136 例胃癌組織中檢測UGT2B15 的蛋白表達(dá),同時(shí)采用qRT-PCR 方法檢測另外90 例胃癌及癌旁組織中UGT2B15 的RNA表達(dá)水平,其表達(dá)明顯高于癌旁組織。因此推測UGT2B15 可能是參與胃癌發(fā)生的重要分子。另外,通過分析其在胃癌中的表達(dá)及其與臨床病理的關(guān)系,結(jié)果表明UGT2B15 在胃癌組織中的陽性表達(dá)與腫瘤浸潤深度、脈管浸潤及TNM 分期密切相關(guān)。TNM 分期以及脈管侵犯都是胃癌不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[12]。通過對(duì)136 例患者進(jìn)行追蹤隨訪,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)UGT2B15 陽性表達(dá)組患者的總體病死率和疾病特定死亡率明顯高于UGT2B15 陰性表達(dá)組患者,因此推動(dòng)UGT2B15 可能成為胃癌不良預(yù)后的分子標(biāo)志物。另外,由于UGT2B15 與胃癌腫瘤侵犯深度密切相關(guān),提示UGT2B15 可能參與胃癌腫瘤浸潤發(fā)展,因此利用siRNA 抑制UGT2B15 在胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS 和MGC-803 中的表達(dá)后,檢測其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響,結(jié)果表明與對(duì)照組比較,UGT2B15-siRNA 組細(xì)胞的增殖能力和侵襲能力明顯下降,且細(xì)胞凋亡率上升,也進(jìn)一步證實(shí)UGT2B15 對(duì)調(diào)控胃癌發(fā)展具有重要意義。為進(jìn)一步研究UGT2B15 促進(jìn)胃癌發(fā)展的分子作用機(jī)制,結(jié)合前期生物信息學(xué)研究,結(jié)果表明UGT2B15在胃癌中的表達(dá)與FOXA1 存在明顯關(guān)系,F(xiàn)OXA1是Hippo-YAP 信號(hào)通路骨架蛋白,并調(diào)控其信號(hào)活性。有研究證實(shí),腫瘤細(xì)胞通過高表達(dá)FOXA1活化Hippo-YAP 信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展及耐藥[13-14]。在胃癌、卵巢癌及乳腺癌患者中已經(jīng)證實(shí),F(xiàn)OXA1 活化Hippo-YAP 信號(hào)通路并上調(diào)YAP 表達(dá),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及遷移[15-16]。YAP1 蛋白進(jìn)入細(xì)胞核為Hippo 信號(hào)通路的關(guān)鍵事件。在YAP1 進(jìn)入細(xì)胞核后,特異性與轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)相關(guān)結(jié)構(gòu)域(transcriptional enhanced associate domain,TEAD)等蛋白結(jié)合,共同發(fā)揮轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子作用,促進(jìn)DNA 的轉(zhuǎn)錄,從而影響腫瘤增殖及發(fā)展[17]。本研究也進(jìn)一步通過Western blotting 和qRT-PCR 等實(shí)驗(yàn)證明,在胃癌細(xì)胞中抑制UGT2B15 的表達(dá)可明顯降低FOXA1 的蛋白和RNA 表達(dá)水平,因此推測,UGT2B15 可能通過調(diào)控FOXA1 表達(dá)活化Hippo-YAP 信號(hào)通路,從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖,但更深層的分子機(jī)制及調(diào)控方式還有待進(jìn)一步研究。

    綜上所述,UGT2B15 在胃癌組織中表達(dá)水平升高,且與腫瘤浸潤深度、脈管侵犯、TNM 分期以及不良預(yù)后密切相關(guān);UGT2B15 可能參與胃癌細(xì)胞增殖、侵襲以及凋亡;抑制胃癌細(xì)胞中UGT2B15 的表達(dá)后可降低FOXA1 的表達(dá)。因此UGT2B15 有望成為胃癌診療的有效分子標(biāo)志物。

    利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

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